一种用于检测男性人类基因组DNA的DNA片段和引物对

摘要

本发明公开了一种用于检测男性人类基因组DNA的DNA片段和引物对。本发明公开的用于检测男性人类基因组DNA的DNA片段，其序列为序列表中序列8，引物对由序列表中序列6和7所示的两条单链DNA组成。实验证明，利用本发明DNA片段可以检测男性人类基因组DNA，且检测的灵敏度高，可达0.128pg/μl，且可在10ng/μl‑0.128pg/μl的男性人类基因组DNA浓度区间内进行准确定量。表明，利用本发明的DNA片段乙，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种用于检测男性人类基因组DNA的DNA片段和引物对。

背景技术

现有的基于荧光定量PCR的男性人类基因组DNA定量方法主要选用单拷贝基因，拷贝数在人群中分布一致性高。但由于拷贝数少，定量检测灵敏度较低，难以准确检测DNA浓度低于10ng/μl的反应体系，所以目前急需一种可以检测更低浓度的男性人类基因组DNA的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测男性人类基因组DNA的遗传标记物，并解决了现有定量检测方法检测男性人类基因组DNA的灵敏度低及适用样本DNA浓度范围窄的问题。

本发明首先提供了名称为DNA片段乙的DNA片段在检测男性人类基因组DNA中的应用；所述DNA片段乙为序列表中序列8所示的DNA片段或其任一片段。

本发明还提供了检测所述DNA片段乙的物质在检测男性人类基因组DNA中的应用。

检测所述DNA片段乙的物质在制备检测男性人类基因组DNA产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

以所述DNA片段乙作为男性人类遗传标记物的检测男性人类基因组DNA方法中所用物质在检测男性人类基因组DNA中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述DNA片段乙作为男性人类遗传标记物在检测男性人类基因组DNA中的应用，也属于本发明的保护范围。

上文中，所述检测所述DNA片段乙的物质可包括名称为引物对C的引物对；所述引物对C由序列表中序列6和7所示的两条单链DNA组成。

所述检测所述DNA片段乙的物质还可包括进行PCR扩增或进行实时荧光定量PCR所需的其他物质。

所述检测所述DNA片段乙的物质可仅由所述引物对C组成，也可由引物对C与进行PCR扩增或进行实时荧光定量PCR所需的其他物质组成。

所述物质可为试剂盒。

本发明还提供了检测男性人类样本的方法，所述方法包括：利用所述检测所述DNA片段乙的物质检测待测样本的基因组DNA中是否含有所述DNA片段乙，确定所述待测样本是否含有男性人类样本或是否为男性人类样本：如所述待测样本的基因组DNA中含有所述DNA片段乙，所述待测样本含有或候选含有男性人类样本或为或候选为男性人类样本；如所述待测样本的基因组DNA中不含有所述DNA片段乙，所述待测样本不含或候选不含男性人类样本或不为或候选不为男性人类样本。

上述方法中，所述检测待测样本的基因组DNA中是否含有所述DNA片段乙可采用荧光定量PCR进行。

本发明还提供了定量检测男性人类基因组DNA的方法，包括：采用荧光定量PCR的方法，利用所述引物对C检测不同浓度男性人类基因组DNA标准品，得到不同浓度男性人类基因组DNA标准品的Ct值，确定Ct值和男性人类基因组DNA浓度间的关系；利用所述引物对C检测待测样本，得到所述待测样本的Ct值，根据Ct值和男性人类基因组DNA浓度间的关系以及所述待测样本的Ct值确定所述待测样本中男性人类基因组DNA的含量。

确定Ct值和男性人类基因组DNA浓度间的关系可为工作曲线1或工作曲线3，所述工作曲线1为y＝-1.396ln(x)+26.531，所述工作曲线3为y＝-1.45ln(x)+29.416，x为男性基因组DNA浓度，y为Ct值。

上文中，所述荧光定量PCR的方法可利用各引物对与2x qPCR Master Mix(含SYBRGreen染料)对待测样本的基因组DNA进行荧光定量PCR进行。所述2x qPCR Master Mix(含SYBR Green染料)可为南京诺唯赞生物科技有限公司产品。

所述荧光定量PCR的反应条件可为：95℃5min预变性；40个循环：95℃5s变性，60℃15s退火延伸。

所述检测所述DNA片段乙的物质，也属于本发明的保护范围。

所述DNA片段乙在法医学检测中的应用，或检测所述DNA片段乙的物质在法医学检测中的应用，也属于本发明的保护范围。

实验证明，利用本发明DNA片段乙可以检测男性人类基因组DNA，且检测的灵敏度高，可达0.128pg/μl，且可在10ng/μl-0.128pg/μl的男性人类基因组DNA浓度区间内进行准确定量。表明，利用本发明的DNA片段乙，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为人类基因组DNA检测工作曲线。

图2为人类男性基因组DNA检测工作曲线。

图3为待测DNA溶液中男性和女性DNA浓度检测结果。女性与男性DNA浓度测得值的比值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

2x qPCR Master Mix(含SYBR Green染料)为南京诺唯赞生物科技有限公司产品。

实施例1、序列3所示的DNA片段的拷贝数在人类不同个体间的拷贝数稳定

本发明在来源于274个男性个体的DNA样本及来源于198个女性个体的DNA样本中发现序列表中序列3所示的DNA片段(记为片段甲)在人类不同个体间的拷贝数稳定，使用Alu作为对照检测该DNA片段拷贝数的方法如下：

1、待测样本

提取274份来自男性个体的血卡样本及198份来自女性个体的血卡样本基因组DNA，然后分别进行5倍稀释，得到各待测样品DNA溶液。

2、荧光定量PCR

2.1引物：用于目标片段扩增的引物对由F1和R1组成(用于扩增序列3的第66-151位所示的DNA片段)，检测Alu的引物对由F2和R2组成，具体如下：

将各引物溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，成对引物等摩尔混合，得到分别扩增片段甲和Alu的引物溶液，各溶液中正、反向引物终浓度均为1.25μM。

2.2反应溶液配制及qPCR反应：分别对各待测样品DNA溶液进行荧光定量PCR，反应体系组成见下表：

PCR体系扩增反应条件为：95℃5min预变性；40个循环：95℃5s变性，60℃15s退火延伸。

3、数据分析

步骤2的荧光定量PCR结束后，男性样本(表1)和女性样本(表2)的两种引物荧光定量PCR反应的Ct值见表1和2，表1和表2中Ct值差值为引物对Alu扩增的Ct值与引物对A扩增的Ct值的差值。

表1、男性样本荧光定量PCR的Ct值

表2、女性样本荧光定量PCR的Ct值

结果显示，所得Ct值差值在上述来源于274个男性个体的DNA样本及来源于198个女性个体的DNA样本中差异小，且在男性与女性之间无显著差异，可用作检测人类DNA的遗传标记物。

实施例2、利用序列3所示的DNA片段检测人类基因组DNA的灵敏度

在实施例1的基础上，利用实施例1的引物对A检测人类基因组DNA，检测方法如下：

1、待测样本

混合来源男性全基因组DNA样本：Promega Human Genomic DNA:Male(Promega，G1471)。将该DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液进行5倍浓度梯度稀释，获得DNA浓度分别为100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl、0.16ng/μl、32pg/μl、6.4pg/μl及1.28pg/μl的男性DNA稀释溶液。

混合来源女性全基因组DNA样本：Promega Human Genomic DNA:Female(Promega，G1521)。将该DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液进行5倍浓度梯度稀释，获得DNA浓度分别为100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl、0.16ng/μl、32pg/μl、6.4pg/μl及1.28pg/μl的女性DNA稀释溶液。

2、荧光定量PCR

分别以步骤1的各DNA稀释溶液为模板DNA，利用引物对A进行荧光定量PCR，反应体系和反应条件如下：

反应体系(20μl)：2x qPCR Master Mix(含SYBR Green染料)10μl，DNA稀释溶液2μl，引物溶液8μl。其中，引物溶液为将序列表中序列1和2所示的两条单链DNA分别利用10mMTris-HCl缓冲溶液溶解后等摩尔混合得到的溶液，该溶液中序列1和2所示的两条单链DNA的浓度均为1.25μM。

反应条件：95℃5min预变性；95℃5s变性，60℃15s退火延伸，40个循环。

3、数据分析

步骤2的荧光定量PCR结束后，分析男性和女性的各浓度DNA样品对应的Ct值，见表3。

表3、各样本DNA的Ct值

根据反应体系中DNA浓度与Ct值，分别得到男性和女性基因组DNA检测工作曲线，如图1所示。男性基因组DNA检测工作曲线(记为工作曲线1)为y＝-1.396ln(x)+26.531，R

实施例3、人类DNA的降解程度的检测

在实施例1和实施例2的基础上，设计了另一对引物，将该引物对记为引物对B，该引物对由序列表中序列4和5所示的两条单链DNA组成，可以用于扩增序列3所示的DNA片段。利用该引物对可以检测人类基因组的降解程度，检测方法如下：

1、待测样本处理

使用10mM Tris-HCl缓冲溶液将混合人源DNA样本—Promega Human GenomicDNA:Male(Promega，G1471)稀释至约4ng/μl,使用DNase I(New England Biolabs)在37℃对样本进行降解，时间分别为0分钟，1分钟，2分钟，5分钟，之后在于80℃加热20分钟使得DNase I失活，得到降解不同时间的DNA溶液。

2、荧光定量PCR

分别以步骤1的各降解不同时间的DNA溶液为模板DNA，利用引物对A和引物对B进行荧光定量PCR，反应体系和反应条件如下：

反应体系(20μl)：2x qPCR Master Mix(含SYBR Green染料)10μl，模板DNA 2μl，引物溶液8μl。其中，引物溶液为引物对A溶液或引物对B溶液，引物对A溶液为利用10mMTris-HCl缓冲溶液分别溶解序列表中序列1和2所示的两条单链DNA后等摩尔混合得到的溶液，该溶液中序列1和2所示的两条单链DNA的浓度均为1.25μM；引物对B溶液为利用10mMTris-HCl缓冲溶液分别溶解序列表中序列4和5所示的两条单链DNA后等摩尔混合得到的溶液，该溶液中序列1和2所示的两条单链DNA的浓度均为1.25μM。

反应条件：95℃5min预变性；95℃5s变性，60℃15s退火延伸，40个循环。

3、数据分析

不同降解时间的Ct值如下：

注：Delta Ct(B-A)＝引物对B扩增的Ct值-引物对A扩增的Ct值。

引物对A的扩增片段长度为86bp，引物对B的扩增片段长度为226bp，因此对于降解样本，引物对B定量的Ct相比引物对A会随着基因组DNA降解程度的提高而更快地增大。通过比较引物对A与引物对B扩增同一样本时的Ct值，可以表征该样本中人源gDNA的降解程度，Delta Ct(B-A)越大，人源gDNA的降解程度越大。

实施例4、序列8所示的DNA片段的拷贝数在男性不同个体间的拷贝数稳定

本发明在来源于274个男性个体的DNA样本中发现序列表中序列8所示的DNA片段(记为片段乙)在男性人类不同个体间的拷贝数稳定，使用Alu作为对照检测该DNA片段拷贝数的方法如下：

1、待测样本

提取274份来自男性个体的血卡样本及198份来自女性个体的血卡样本基因组DNA，然后分别进行5倍稀释，得到各待测样品DNA溶液。

2、荧光定量PCR

2.1引物：用于目标片段扩增的引物对由F3和R3组成(用于扩增序列8所示的DNA片段)，检测Alu的引物对由F2和R2组成，具体如下：

将各引物溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，成对引物等摩尔混合，得到分别扩增片段乙和Alu的引物溶液，各溶液中正、反向引物终浓度均为1.25μM。

2.2反应溶液配制及qPCR反应：分别对各待测样品DNA溶液进行荧光定量PCR，反应体系组成见下表：

PCR体系扩增反应条件为：95℃5min预变性；40个循环：95℃5s变性，60℃15s退火延伸。

3、数据分析

步骤2的荧光定量PCR结束后，样本的两种引物荧光定量PCR反应的Ct值见表4，表4中Ct值差值为引物对Alu扩增的Ct值与引物对C扩增的Ct值的差值。

表4、样本荧光定量PCR的Ct值

结果显示，所得Ct值差值在上述来源于274个男性个体的DNA样本中差异小，可用作检测男性DNA的遗传标记物。

实施例5、利用序列8所示的DNA片段检测男性人类基因组DNA的灵敏度

在实施例4的基础上，利用实施例4的引物对C检测男性人类基因组DNA，检测方法如下：

1、待测样本

混合来源男性全基因组DNA样本：Promega Human Genomic DNA:Male(Promega，G1471)。将该DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液进行5倍浓度梯度稀释，获得DNA浓度分别为100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl、0.16ng/μl、32pg/μl、6.4pg/μl及1.28pg/μl的男性DNA稀释溶液。

2、荧光定量PCR

分别以步骤1的各DNA稀释溶液为模板DNA，利用引物对C进行荧光定量PCR，反应体系和反应条件如下：

反应体系(20μl)：2x qPCR Master Mix(含SYBR Green染料)10μl，DNA稀释溶液2μl，引物溶液8μl。其中，引物溶液为将序列表中序列6和7所示的两条单链DNA分别利用10mMTris-HCl缓冲溶液溶解后等摩尔混合得到的溶液，该溶液中序列6和7所示的两条单链DNA的浓度均为1.25μM。

反应条件：95℃5min预变性；95℃5s变性，60℃15s退火延伸，40个循环。

3、数据分析

步骤2的荧光定量PCR结束后，分析各浓度DNA样品对应的Ct值，见表2。

表5、各样本DNA的Ct值

根据反应体系中DNA浓度与Ct值得到男性基因组DNA检测工作曲线，如图2所示。男性基因组DNA检测工作曲线(记为工作曲线3)为y＝-1.45ln(x)+29.416，R

实施例6、利用序列10所示的DNA片段检测男性人类基因组DNA的特异性

1、待测样本

混合来源男性全基因组DNA样本：Promega Human Genomic DNA:Male(Promega，G1471)。将该DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液进行稀释，得到DNA浓度为25ng/μl的男性DNA样本；将该男性DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液稀释1000倍，得到DNA浓度为25pg/μl的男性DNA样本；

混合来源女性全基因组DNA样本：Promega Human Genomic DNA:Female(Promega，G1521)。将该DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液进行稀释，得到DNA浓度为25ng/μl的女性DNA样本；将该女性DNA样本使用10mM Tris-HCl缓冲溶液进行稀释，得到DNA浓度分别为12.5ng/μl、3.125ng/μl、0.625ng/μl、0.125ng/μl和25pg/μl的女性DNA样本；

将DNA浓度为25pg/μl的男性DNA样本分别与DNA浓度为25ng/μl、12.5ng/μl、3.125ng/μl、0.625ng/μl、0.125ng/μl和25pg/μl的女性DNA样本等体积混合，得到男、女DNA浓度比分别为1：1000，1：500，1：125，1：25，1：5和1：1的混合待测DNA溶液，这六种待测混合待测DNA溶液中，女性DNA含量分别为12.5ng/μl、6.25ng/μl、1.563ng/μl、0.313ng/μl、0.0625ng/μl和12.5pg/μl，男性DNA均为12.5pg/μl。

2、荧光定量PCR

按照实施例5中步骤2的方法，将DNA模板“DNA稀释溶液”分别替换为上述各混合待测DNA溶液以及DNA浓度为25pg/μl的男性DNA样本和女性DNA样本，其他均不变，进行荧光定量PCR。

按照实施例5中步骤2的方法，将DNA模板“DNA稀释溶液”分别替换为上述各待测DNA溶液以及DNA浓度为25pg/μl的男性DNA样本和女性DNA样本，并将引物对C替换为实施例2中的引物对A，检测总DNA含量。

3、数据分析

分析利用引物对C进行荧光定量PCR各待测样本对应的Ct值，并根据实施例5的工作曲线3计算各待测样本男性DNA浓度的测得值；

分析利用引物对A进行荧光定量PCR各待测样本对应的Ct值，并根据男性基因组DNA检测工作曲线(工作曲线3)的公式y＝-1.45ln(x)+29.416，将各Ct值作为x，计算各待测样本总DNA浓度的测得值y；

根据各混合待测DNA溶液中男性DNA浓度和总DNA浓度的测得值计算女性DNA浓度测得值以及女性DNA与男性DNA浓度比，混合待测DNA溶液中，女性DNA浓度测得值＝总DNA浓度的测得值-男性DNA浓度测得值。

结果见表6和图3。

表6、

表3中，1：1000，1：500，1：125，1：25，1：5和1：1分别表示男、女DNA浓度比分别为1：1000，1：500，1：125，1：25，1：5和1：1的待测DNA溶液，男2.5pg/μl和女2.5pg/μl分别表示DNA浓度为25pg/μl的男性DNA样本和女性DNA样本以10％体积比加入最终反应溶液后在反应体系中的DNA浓度。

结果显示，利用引物对C可以成功检测男性人类基因组DNA，并对其准确定量；利用引物对A可以成功对人类基因组DNA进行检测，并对其准确定量，利用引物对C和引物对A分别对样本中的男性和人类基因组进行定量，进而可以进一步确定是否含有女性基因组DNA并对其定量。引物对C的特异性和灵敏度均很好，可以在女性DNA与男性DNA的比例为1000：1的样品体系中准确检测出男性DNA含量。

序列表

<110> 公安部物证鉴定中心

<120> 一种用于检测男性人类基因组DNA的DNA片段和引物对

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tggaggtagt agagcctgaa gtc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggagtcaggc tgttcaagac aa 22

<210> 3

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gtgtctgatt tcccctggct tattctttac tttttcctcc ttttccaggc tcagcaggga 60

gctgctggag gtagtagagc ctgaagtctt gcaggactca ctggatagat gttattcaac 120

tccttccagt tgtcttgaac agcctgactc ctgccagccc tatggaagtt ccttttatgc 180

attggaggaa aaacatgttg gcttttctct tgacgtggga ggtgag 226

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gtgtctgatt tcccctggct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ctcacctccc acgtcaagag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gggccaatgt tgtatccttc tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gcccatcggt cacttacact tc 22

<210> 8

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gggccaatgt tgtatccttc tcagtgtttc ttcggccttt ctagtggaga ggtgctctcg 60

gggaagtgta agtgaccgat gggc 84