技术领域
本发明涉及一种家禽品种鉴定的方法，具体涉及一种利用分子标记鉴定太湖鸡的方法。
背景技术
太湖鸡，中心产区在太湖周边地区，因产地而得名。太湖流域盛产稻米、畜禽农产品，当地百姓素有“进九吃母鸡”的养身习俗，还有以鸡蛋、母鸡作为伴手礼的传统，在这种特定的自然、社会条件下，经当地人民长期选育形成该品种。太湖鸡历史悠久，然而近年来遭受高产商品化品种冲击，养殖数量锐减，遗传资源濒临灭绝。为更好的了解和保护这一宝贵的品种资源，亟需一种有效鉴定太湖鸡的方法。
发明内容
本发明主要目的是提供一种利用分子标记鉴定太湖鸡的方法，本发明方法基于太湖鸡特异性INDELs位点以及特异性SNPs位点进行鉴定，所述特异性位点均具有较高的太湖鸡鉴定率，基于其一种或几种特异性位点进行鉴定，准确率高，结果更为可靠。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种太湖鸡鉴定的方法，所述方法包括鉴定以下任意一种或几种特异性遗传位点：
TH_tag1位于鸡1号染色体35623615处，CCT2基因第4内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag2位于鸡1号染色体181992632处，CWF19L2基因第10内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag3位于鸡2号染色体43011267处，CDCP1基因第1内含子，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag4位于鸡2号染色体118536101处，基因CRISPLD1与HNF4G之间，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag5位于鸡3号染色体43357525处，PDE10A基因第2内含子，太湖鸡基因型为--突变基因型为TTC//TTC；
TH_tag6位于鸡6号染色体31449461处，基因SEC23IP与PLPP4之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag7位于鸡7号染色体10434423处，PLCL1基因第1内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag8位于鸡10号染色体19649103处，CORO2B基因第1内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag9位于鸡1号染色体9500779处，SEMA3A基因第14内含子，太湖鸡基因型为TT，参考基因型为缺失；
TH_tag10位于鸡Z染色体15007920处，基因PARP8与ISL1之间，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag11位于鸡Z染色体80054278处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag12位于鸡Z染色体80729229处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为AA。
进一步地，鉴定以下任意一种或两种特异性遗传位点：
TH_tag5位于鸡3号染色体43357525处，PDE10A基因第2内含子，太湖鸡基因型为--突变基因型为TTC//TTC；
TH_tag9位于鸡1号染色体9500779处，SEMA3A基因第14内含子，太湖鸡基因型为TT，参考基因型为缺失；
以上所述特异性位点为特异性INDEL点。
进一步地，鉴定以下任意一种或几种特异性遗传位点：
TH_tag1位于鸡1号染色体35623615处，CCT2基因第4内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag2位于鸡1号染色体181992632处，CWF19L2基因第10内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag3位于鸡2号染色体43011267处，CDCP1基因第1内含子，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag4位于鸡2号染色体118536101处，基因CRISPLD1与HNF4G之间，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag6位于鸡6号染色体31449461处，基因SEC23IP与PLPP4之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag7位于鸡7号染色体10434423处，PLCL1基因第1内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag8位于鸡10号染色体19649103处，CORO2B基因第1内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag10位于鸡Z染色体15007920处，基因PARP8与ISL1之间，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag11位于鸡Z染色体80054278处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag12位于鸡Z染色体80729229处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为AA；
以上所述特异性位点为特异性SNPs位点。
进一步地，鉴定以下遗传特异性位点：
TH_tag1位于鸡1号染色体35623615处，CCT2基因第4内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag3位于鸡2号染色体43011267处，CDCP1基因第1内含子，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag5位于鸡3号染色体43357525处，PDE10A基因第2内含子，太湖鸡基因型为--突变基因型为TTC//TTC；
TH_tag6位于鸡6号染色体31449461处，基因SEC23IP与PLPP4之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag8位于鸡10号染色体19649103处，CORO2B基因第1内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag9位于鸡1号染色体9500779处，SEMA3A基因第14内含子，太湖鸡基因型为TT，参考基因型为缺失；
TH_tag10位于鸡Z染色体15007920处，基因PARP8与ISL1之间，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag11位于鸡Z染色体80054278处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag12位于鸡Z染色体80729229处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为AA。
进一步地，检测所述特异性位点的引物：
用于检测所述标记TH_tag1的引物为：TH_P1f和TH_P1r所示两条单链DNA：
TH_P1f：CCTTCCAACTCACACCATT；
TH_P1r：TTCCATCACCAACTTCATCA；
用于检测所述标记TH_tag2的引物为TH_P2f和TH_P2r所示两条单链DNA：
TH_P2f：GGTGAGTGCTGAGGTATG；
TH_P2r：AGATGTGCCAGGAATGATTA；
用于检测所述标记TH_tag3的引物为TH_P3f和TH_P3r所示两条单链DNA：
TH_P3f：ATCAGGAAGGATTCAGTAAGG；
TH_P3r：CAACCAACCAGACAGAAGA；
用于检测所述标记TH_tag4的引物为TH_P4f和TH_P4r所示两条单链DNA：
TH_P4f：AAGATGGCTGAGGATTGATT；
TH_P4r：ATTCTGCTGACACTTCCAA；
用于检测所述标记TH_tag5的引物为TH_P5f和TH_P5r所示两条单链DNA：
TH_P5f：GCAATGGTCTCTTGGTAGAA；
TH_P5r：CCTCTTACAATGTCCACACT；
用于检测所述标记TH_tag6的引物为TH_P6f和TH_P6r所示两条单链DNA：
TH_P6f：GTTAGGAATGGATGGAATGG；
TH_P6r：TTGCTCTGCTGAAGTCTC；
用于检测所述标记TH_tag7的引物为TH_P7f和TH_P7r所示两条单链DNA：
TH_P7f：GCCAGAAGGAAGAATGACA；
TH_P7r：GACACAGTGCCACAGATT；
用于检测所述标记TH_tag8的引物为TH_P8f和TH_P8r所示两条单链DNA：
TH_P8f：TTGCGTTGTGTTGTGTTG；
TH_P8r：GTTGGTGGTTAATTGTACTCC；
用于检测所述标记TH_tag9的引物为TH_P9f和TH_P9r所示两条单链DNA：
TH_P9f：CTGCCAATCTGCTGTCTT；
TH_P9r：AATTCAGGTGGTCCATTAGG；
用于检测所述标记TH_tag10的引物为TH_P10f和TH_P10r所示两条单链DNA：
TH_P10f：AACTGTTCTGGACTTGGATT；
TH_P10r：TTCTGCTCTTCTGTTCAACT；
用于检测所述标记TH_tag11的引物为TH_P11f和TH_P11r所示两条单链DNA：
TH_P11f：GAATGGCTTCAAGGATGG；
TH_P11r：CTGCGTAGACAGACAACT；
用于检测所述标记TH_tag12的引物为TH_P12f和TH_P12r所示两条单链DNA：
TH_P12f：GTTCAGGAAGGTAAGAAGTTG；
TH_P12r：GAGAAGCAGGCAATAGCA。
本发明提供一种引物组合，所述引物组合包括以下任意一对或几对引物组合：
用于检测所述标记TH_tag1的引物为：TH_P1f和TH_P1r所示两条单链DNA：
TH_P1f：CCTTCCAACTCACACCATT；
TH_P1r：TTCCATCACCAACTTCATCA；
用于检测所述标记TH_tag2的引物为TH_P2f和TH_P2r所示两条单链DNA：
TH_P2f：GGTGAGTGCTGAGGTATG；
TH_P2r：AGATGTGCCAGGAATGATTA；
用于检测所述标记TH_tag3的引物为TH_P3f和TH_P3r所示两条单链DNA：
TH_P3f：ATCAGGAAGGATTCAGTAAGG；
TH_P3r：CAACCAACCAGACAGAAGA；
用于检测所述标记TH_tag4的引物为TH_P4f和TH_P4r所示两条单链DNA：
TH_P4f：AAGATGGCTGAGGATTGATT；
TH_P4r：ATTCTGCTGACACTTCCAA；
用于检测所述标记TH_tag5的引物为TH_P5f和TH_P5r所示两条单链DNA：
TH_P5f：GCAATGGTCTCTTGGTAGAA；
TH_P5r：CCTCTTACAATGTCCACACT；
用于检测所述标记TH_tag6的引物为TH_P6f和TH_P6r所示两条单链DNA：
TH_P6f：GTTAGGAATGGATGGAATGG；
TH_P6r：TTGCTCTGCTGAAGTCTC；
用于检测所述标记TH_tag7的引物为TH_P7f和TH_P7r所示两条单链DNA：
TH_P7f：GCCAGAAGGAAGAATGACA；
TH_P7r：GACACAGTGCCACAGATT；
用于检测所述标记TH_tag8的引物为TH_P8f和TH_P8r所示两条单链DNA：
TH_P8f：TTGCGTTGTGTTGTGTTG；
TH_P8r：GTTGGTGGTTAATTGTACTCC；
用于检测所述标记TH_tag9的引物为TH_P9f和TH_P9r所示两条单链DNA：
TH_P9f：CTGCCAATCTGCTGTCTT；
TH_P9r：AATTCAGGTGGTCCATTAGG；
用于检测所述标记TH_tag10的引物为TH_P10f和TH_P10r所示两条单链DNA：
TH_P10f：AACTGTTCTGGACTTGGATT；
TH_P10r：TTCTGCTCTTCTGTTCAACT；
用于检测所述标记TH_tag11的引物为TH_P11f和TH_P11r所示两条单链DNA：
TH_P11f：GAATGGCTTCAAGGATGG；
TH_P11r：CTGCGTAGACAGACAACT；
用于检测所述标记TH_tag12的引物为TH_P12f和TH_P12r所示两条单链DNA：
TH_P12f：GTTCAGGAAGGTAAGAAGTTG；
TH_P12r：GAGAAGCAGGCAATAGCA。
本发明还提供还提供以上所述引物组合在鉴定太湖鸡种中的应用。
本发明还提供包括以上所述引物组合的试剂盒。
本发明还提供以上所述试剂盒在鉴定太湖鸡种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了可有效用于太湖鸡品种鉴定的特异性遗传位点，包括INDELs位点和SNPs位点，筛选得到的各遗传位点对太湖鸡均具有较好的鉴定率，因此各位点及组合可有效用于太湖鸡的鉴定。
本发明筛选得到TH_tag5、TH_tag9两个位点为特异性INDELs位点，INDELs位点突变速率低，易于检测，因此将TH_tag5、TH_tag9两个特异性INDELs位点用于太湖鸡的鉴定，不仅鉴定准确率高，而且易于操作，可节省大量的鉴定成本。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1利用分子标记鉴定太湖鸡的方法
所述方法为：鉴定以下特异性INDELs位点：
TH_tag5位于鸡3号染色体43357525处，PDE10A基因第2内含子，太湖鸡基因型为--突变基因型为TTC//TTC；
TH_tag9位于鸡1号染色体9500779处，SEMA3A基因第14内含子，太湖鸡基因型为TT，参考基因型为缺失；
检测所述标记TH_tag5的引物TH_P5f和TH_P5r：
TH_P5f：GCAATGGTCTCTTGGTAGAA；
TH_P5r：CCTCTTACAATGTCCACACT；
检测所述标记TH_tag9的引物TH_P9f和TH_P9r：
TH_P9f：CTGCCAATCTGCTGTCTT；
TH_P9r：AATTCAGGTGGTCCATTAGG。
实施例2利用分子标记鉴定太湖鸡的方法
所述方法为：鉴定以下SNPs位点：
TH_tag1位于鸡1号染色体35623615处，CCT2基因第4内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag2位于鸡1号染色体181992632处，CWF19L2基因第10内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag3位于鸡2号染色体43011267处，CDCP1基因第1内含子，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag4位于鸡2号染色体118536101处，基因CRISPLD1与HNF4G之间，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag6位于鸡6号染色体31449461处，基因SEC23IP与PLPP4之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag7位于鸡7号染色体10434423处，PLCL1基因第1内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag8位于鸡10号染色体19649103处，CORO2B基因第1内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag10位于鸡Z染色体15007920处，基因PARP8与ISL1之间，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag11位于鸡Z染色体80054278处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag12位于鸡Z染色体80729229处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为AA。
用于检测所述标记TH_tag1的引物为：TH_P1f和TH_P1r所示两条单链DNA：
TH_P1f：CCTTCCAACTCACACCATT；
TH_P1r：TTCCATCACCAACTTCATCA；
用于检测所述标记TH_tag2的引物为TH_P2f和TH_P2r所示两条单链DNA：
TH_P2f：GGTGAGTGCTGAGGTATG；
TH_P2r：AGATGTGCCAGGAATGATTA；
用于检测所述标记TH_tag3的引物为TH_P3f和TH_P3r所示两条单链DNA：
TH_P3f：ATCAGGAAGGATTCAGTAAGG；
TH_P3r：CAACCAACCAGACAGAAGA；
用于检测所述标记TH_tag4的引物为TH_P4f和TH_P4r所示两条单链DNA：
TH_P4f：AAGATGGCTGAGGATTGATT；
TH_P4r：ATTCTGCTGACACTTCCAA；
用于检测所述标记TH_tag5的引物为TH_P5f和TH_P5r所示两条单链DNA：
TH_P5f：GCAATGGTCTCTTGGTAGAA；
TH_P5r：CCTCTTACAATGTCCACACT；
用于检测所述标记TH_tag6的引物为TH_P6f和TH_P6r所示两条单链DNA：
TH_P6f：GTTAGGAATGGATGGAATGG；
TH_P6r：TTGCTCTGCTGAAGTCTC；
用于检测所述标记TH_tag7的引物为TH_P7f和TH_P7r所示两条单链DNA：
TH_P7f：GCCAGAAGGAAGAATGACA；
TH_P7r：GACACAGTGCCACAGATT；
用于检测所述标记TH_tag8的引物为TH_P8f和TH_P8r所示两条单链DNA：
TH_P8f：TTGCGTTGTGTTGTGTTG；
TH_P8r：GTTGGTGGTTAATTGTACTCC；
用于检测所述标记TH_tag9的引物为TH_P9f和TH_P9r所示两条单链DNA：
TH_P9f：CTGCCAATCTGCTGTCTT；
TH_P9r：AATTCAGGTGGTCCATTAGG；
用于检测所述标记TH_tag10的引物为TH_P10f和TH_P10r所示两条单链DNA：
TH_P10f：AACTGTTCTGGACTTGGATT；
TH_P10r：TTCTGCTCTTCTGTTCAACT；
用于检测所述标记TH_tag11的引物为TH_P11f和TH_P11r所示两条单链DNA：
TH_P11f：GAATGGCTTCAAGGATGG；
TH_P11r：CTGCGTAGACAGACAACT；
用于检测所述标记TH_tag12的引物为TH_P12f和TH_P12r所示两条单链DNA：
TH_P12f：GTTCAGGAAGGTAAGAAGTTG；
TH_P12r：GAGAAGCAGGCAATAGCA。
实施例3利用分子标记鉴定太湖鸡的方法
所述方法为：鉴定以下特异性INDELs位点和特异性SNPs位点：
TH_tag1位于鸡1号染色体35623615处，CCT2基因第4内含子，太湖鸡基因型为AA；
TH_tag3位于鸡2号染色体43011267处，CDCP1基因第1内含子，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag5位于鸡3号染色体43357525处，PDE10A基因第2内含子，太湖鸡基因型为--突变基因型为TTC//TTC；
TH_tag6位于鸡6号染色体31449461处，基因SEC23IP与PLPP4之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag8位于鸡10号染色体19649103处，CORO2B基因第1内含子，太湖鸡基因型为CC；
TH_tag9位于鸡1号染色体9500779处，SEMA3A基因第14内含子，太湖鸡基因型为TT，参考基因型为缺失；
TH_tag10位于鸡Z染色体15007920处，基因PARP8与ISL1之间，太湖鸡基因型为TT；
TH_tag11位于鸡Z染色体80054278处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为GG；
TH_tag12位于鸡Z染色体80729229处，基因ZNF608与LOC112530693之间，太湖鸡基因型为AA。
检测以上所述特异性位点所用引物如实施例1或实施例2所述。
实施例4引物组合
所述引物组合由以下引物组成：
用于检测所述标记TH_tag1的引物TH_P1f和TH_P1r；用于检测所述标记TH_tag3的引物为TH_P3f和TH_P3r；用于检测所述标记TH_tag5的引物TH_P5f和TH_P5r；用于检测所述标记TH_tag6的引物TH_P6f和TH_P6r；用于检测所述标记TH_tag8的引物TH_P8f和TH_P8r；用于检测所述标记TH_tag9的引物TH_P9f和TH_P9r；用于检测所述标记TH_tag10的引物TH_P10f和TH_P10r；用于检测所述标记TH_tag11的引物TH_P11f和TH_P11r；用于检测所述标记TH_tag12的引物TH_P12f和TH_P12r。
以上所述引物组合用于鉴定太湖鸡品种，还可用于制备检测太湖鸡的试剂盒。
实验例
应用上述12个特异性遗传位点及相应引物对20份太湖鸡血样和360份非太湖鸡血样进行鉴定。具体操作步骤如下：
以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。
PCR扩增过程：
1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各lOng,5μL 2×
power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足；
2)反应程序:首先94℃变性30s,退火30s,72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s,50.8-57.1℃退火30s,72摄氏度延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。
扩增产物送至测序公司进行DNA序列多态性检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型依据。各特异性位点的鉴定率如下表1所示。
表1.太湖鸡品种特异性标记鉴定率
由表1可知，本发明所述特异性标记位点对太湖鸡的鉴定率均在80％及以上，并且对非太湖鸡的鉴定率在60％以上，因此，所述各特异性遗传位点及其组合均可有效用于太湖鸡的鉴定。而筛选得到的其它特异性位点如Barcode10_1，Barcode8_3、Barcode33_2，BarcodeZ_2由于对太湖鸡的实际鉴定率较低而淘汰。
Barcode10_1，Barcode8_3、Barcode33_2，BarcodeZ_2具体位置信息为：
Barcode8_3位于8号染色体29949231处，TNNI3K基因第3内含子，太湖鸡基因型为TT；
Barcode10_1位于10号染色体3397646处，基因LINGO1与基因HMG20A之间，太湖鸡基因型为GG；
Barcode33_4位于鸡33号染色体，物理位置4702539处，基因LRP1第2内含子，太湖鸡基因型为GG；
BarcodeZ_2位于鸡Z染色体，物理位置55099167处，基因FSD1L第3内含子，太湖鸡基因型为GG。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
机译： 利用分子标记鉴定鸡的脂肪和瘦肉表型
机译： 利用分子标记鉴定鸡的脂肪和瘦型表型
机译： 利用分子标记鉴定鸡的脂肪和瘦肉表型
