猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒

摘要

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒。本发明提供的引物对包括SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列的两条引物，其以SEQ ID NO:1所示核酸片段为标志物。利用本发明所述的引物对对伪狂犬病毒野毒株的检测具有良好的特异性，在对其他相关病毒进行检测时不产生假阳性，且检测的灵敏度高，检测限可达1.0×101拷贝/μL。该引物对对于伪狂犬病毒野毒株的病原学调查和猪伪狂犬病的净化存在积极意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又称奥叶基氏病(Aujeszky's disease，AD)，是猪群中传染性很强的一种疾病，其特点是患有神经系统疾病和母猪繁殖障碍，仔猪发病率很高，给世界养猪业造成了严重的经济损失。PR是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的，PRV是一种双链DNA病毒，基因组长度约143kb，属于疱疹病毒科水痘病毒属。PRV可存在于猪的外周神经系统。这些猪可能会潜伏感染并将PRV传播到另一个宿主。

随着灭活和/或减毒活疫苗及其他策略的实施，PRV已在许多国家的猪群中被根除。20世纪70年代，减毒PR疫苗Bartha-K61首次引入我国。加上其他疫苗接种策略和根除计划，PR仅在我国猪群中偶尔暴发。自2011年以来，由新型PRV引起的PR在我国大陆20多个省区暴发。这次猪PR暴发的特点是，在Bartha接种疫苗的猪群中，猪的发病率为50％，怀孕70-90天的母猪的流产率约为35％。目前已经有针对变异毒株的PR基因工程商品化疫苗使用。相较于自然情况下gE基因全部缺失的疫苗毒株Bartha-K61，其变异PRV来源的疫苗毒株缺失特征有所差异，其gE基因前三百多个核苷酸发生了人工缺失，而常规的检测方法无法区分新型变异PRV毒株来源的疫苗毒株和Bartha-K61及临床野毒株，因此急需建立能鉴别诊断PRV临床野毒株和疫苗毒株的(传统疫苗毒株Bartha-K61和变异PRV毒株)的快速高效的方法，早期发现PRV并采取严格的预防措施是非常重要的，同时鉴别不同类型的临床毒株，对于PR的净化也是非常重要的。

目前，普遍应用常规PCR检测方法检测PRV，但普通PCR检测的灵敏度相对较低，且无法对病毒含量进行定量，病毒的载量和疾病的发生发展有一定的相关性，同时因为免疫不同的疫苗，导致临床PRV毒株较多，而常规的检测方法无法区分新型变异PRV毒株来源的疫苗毒株和Bartha-K61及临床野毒株，需要进行鉴别诊断。因此，建立伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物对及试剂盒十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒，以便采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法对猪伪狂犬病毒野毒株进行检测。

本发明提供了一种基因片段作为标志物在制备猪伪狂犬病毒野毒株检测试剂中的应用；所述基因片段具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

在本发明中，SEQ ID NO:1所示的核酸序列共含有112bp，来自于gE基因部分片段，经验证，以该片段作为检测标志物，能够实现更良好的特异性和灵敏度。能够对伪狂犬病毒的野毒株和变异毒株。

本发明提供的猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对中：正向引物的核酸序列如SEQID NO:2所示，反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供的引物对的退火温度是60℃。

本发明还提供了检测猪伪狂犬病毒野毒株的试剂盒，其包括本发明提供的检测引物对。

本发明听歌的试剂盒中，所述引物对可以彼此独立存在，也可以混合存在。其可以以粉末形式存在，也可以以溶液形式存在，本发明对此不做限定。在本发明的实施例中，所述试剂盒中，引物对以溶液形式存在；其中，SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的正向引物的浓度为10μmol/L；SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向引物的浓度为10μmol/L。

本发明所述的试剂盒中还包括ChamQ SYBR qPCR Master mix预混液和ROXreference Dye2。其中，ChamQ SYBR qPCR Master mix预混液的浓度为2×，ROX referenceDye2的浓度为50×。

一些实施例中，本发明所述的试剂盒中还包括阳性质控品、阴性质控品；其中，所述阳性质控品为伪狂犬病毒野毒株的阳性质粒，阴性质控品为ddH

一些实施例中，本发明所述试剂盒中还包括ddH

本发明还提供了非诊断目的检测猪伪狂犬病毒野毒株的方法，其以本发明所述试剂盒对待测样品进行检测。

本发明中，所述检测的采用实时荧光定量PCR法。

一些实施例中，所述待测样品为来自于猪的样品或者环境样品。所述来自于猪的样品包括猪肺、猪淋巴结、猪脾脏、猪肾脏、猪肝脏、猪血清、猪口鼻拭子等；所述环境样品包括来自于猪舍的污水、饮用水、饲料、干草、地板、食槽、水槽等的样品。

在本发明中，所述待测样品在检测前，经过核酸提取的步骤。所述核酸提取包括以病毒DNA提取试剂对样品进行处理。

在本发明提供的检测方法中，所述检测的体系包括：

所述检测的扩增程序包括：

预变性阶段：95℃30s；

循环阶段：95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环；

溶解曲线阶段：95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s。

本发明所述的检测方法包括对样品中是否存在伪狂犬病毒野毒株进行判断。扩增结果中，出现扩增曲线、报告Ct值＜38，或扩增产物经电泳在预期位置出现扩增条带，说明样品中含有伪狂犬病毒野毒株，检测结果为阳性。

本发明所述检测方法还包括对阳性样品进行定量，所述定量采用相对定量法或绝对定量法。所述相对定量法以构建的阳性质粒为参照物，所述绝对定量采用标准曲线法。一些实施例中，所述标准曲线的建立采用人工构建的阳性质粒为标准品。

本发明提供了伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒，所述引物对包括SEQ IDNO:2～3所示核苷酸序列的两条引物，其以SEQ ID NO:1所示核酸片段为标志物。利用本发明所述的引物对对伪狂犬病毒野毒株的检测具有良好的特异性，在对其他相关病毒进行检测时不产生假阳性，且检测的灵敏度高，检测限可达1.0×10

附图说明

图1为伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR扩增标准曲线；其中，1-6对应不同浓度的样品的PCR产物；样品的浓度自左向右依次为：1×10

图2为伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR标准曲线；

图3为伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR扩增熔解曲线；

图4为伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR敏感性试验结果；其中，1-8对应不同浓度的样品的PCR产物；样品的浓度自左向右依次为：1.0×10

具体实施方式

本发明提供了猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得，其中：

1、菌株和质粒

大肠杆菌Top10感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。

PRV野毒株、PRVBarthaK61(猪伪狂犬病毒BarthaK61疫苗毒株)、PPV(猪细小病毒)、PDCoV(猪德尔塔冠状病毒)、JEV(日本乙型脑炎病毒)、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)均从疫苗或猪场临床样品中获得并由本实验室保存。

2、试剂

酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；

全自动核酸提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；

100bp ladder、DL2000 DNA marker、pMD18-T载体均购置Takara(大连)公司；

2×ChamQ SYBR qPCR Master mix预混液染料Q111-02购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

3、设备

高速台式离心机购自德国Eppendorf；PCR仪和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad；Nano Drop2000购自美国Thermo公司；

Applied Biosystems 7500PCR仪购自美国应用生物系统公司；

琼脂糖水平电泳槽购自北京六一生物科技有限公司；

高压灭菌锅购自美国Zealway公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法建立

一、引物设计与合成

根据GenBank中登陆的PRV SMX(KP192495)毒株的gE基因保守区域，选择SEQ IDNO:1所示的片段作为标志物，应用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所得的引物对的序列如表1、表2所示(其中，“F”代表正向引物，“R”代表反向引物)：

表1：实时荧光定量PCR引物信息

表2：标品构建PCR引物信息

二、标准品的制备

2.1、DNA的提取

使用全自动核酸萃取系统及其配套的病毒DNA提取试剂盒，按照操作说明书提取样品中的DNA。在提取DNA时，应设立阳性和阴性对照样品，按同样的方法提取对照样品的DNA。提取产物可以直接进行PCR，或者置于-20℃保存备用。具体步骤包括：

(1)加样前对操作台用75％酒精擦拭消毒，将抽提仪器打开照射紫外15min；

(2)将仪器配套使用试剂盒上下颠倒，使底部沉淀的磁珠充分悬浮；

(3)撕去真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，小心撕去铝箔封口膜，避免震荡，然后在第1列和第7列加入20μL的蛋白酶K；

(4)取200μL待测样品离心后的上清液加入抽提板样品列；

(5)将深孔板放入抽提仪，插入搅拌套；待抽提结束后，将第5列和第11列相洗脱下来的核酸转移至无核酸酶离心管中，核酸自动抽提仪开紫外灯灭菌。

2.2、扩增gE基因片段

将上一步提取的DNA为模板进行伪狂犬病毒野毒株的gE基因部分序列PCR扩增，按下述的反应体系和反应程序进行扩增：该伪狂犬病毒野毒株gE基因部分序列PCR扩增的反应体系为20μL，包括：

(1)10μmol/L SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的正向引物1μL；和10μmol/L SEQIDNO:4所示核苷酸序列的反向引物1μL；

(2)待测样品的DNA模板2μL；

(3)2×Taq Master Mix预混液10μL；

(4)ddH

该PCR的反应程序为：

(1)阶段1：95℃预变性5min；

(2)阶段2：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，35个循环；

(3)阶段3：72℃延伸7min，4℃∞。

反应结束后，PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳观察电泳结果。扩增PCR产物对应条带大小约为343bp，与伪狂犬病毒野毒株gE基因片段的长度一致。

2.3、目的产物胶回收

根据胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒的操作说明对上一步PCR扩增得到的目的基因进行胶回收纯化。

2.4、目的基因克隆

将上一步纯化好的目的基因与pMD 18-T载体连接，16℃连接30min，连接体系如下：

2.5、连接产物的转化

将上一步得到的连接产物按照以下步骤进行连接产物的转化：

(1)从-80℃冰箱中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，迅速置于冰上或者冰水混合物中解冻；

(2)将10μL连接产物和100μL解冻的大肠杆菌Top10感受态细胞置于1.5mL离心管中轻轻搅拌混匀，冰浴30min。并提前开好水浴锅，将温度调至42℃；

(3)42℃水浴热应激90s，并将离心管迅速转移至碎冰中放置3min；

(4)加入500μL预热的LB液体培养基，200rpm振荡培养约45min；

(5)8000rpm常温离心5min，弃400μL上清，重悬菌体取剩余100ul菌液均匀涂布在加有氨苄青霉素的LB固体培养基上，先在37℃温箱中正放1h吸收表面液体后再倒置平皿培养12-18h。

2.6、感受态细胞的制备(氯化钙法)

(1)取-80℃保存的甘油菌大肠杆菌Top10菌株，划线接种于LB培养基上，于37℃温箱倒置培养过夜。从大肠杆菌Top10平板中挑取一个单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃200r/min摇床培养过夜，在无菌条件下将菌种与培养基按1：100转接到装有LB的聚丙烯离心管中(培养基体积不要超过容器总体积的1/5，保证充足的溶氧)，至OD

(2)4℃4000r/min离心10min。弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽；

(3)加30mL冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，冰浴15min后，4℃4000r/min离心10min，弃上清；

(4)沉淀中加入2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2-15％甘油重悬细胞。然后以每100μL的细胞悬液分装于灭过菌的1.5mL离心管中(提前在冰箱冷冻，分装完成后先在液氮里面进行速冻——没有条件可以省略)，-80℃冰箱保存备用(若无-80℃冰箱也可按此方法，但是需要现做现用)。

2.7、菌落的挑取及常规PCR鉴定

挑取五个涂布的LB培养基中白色、湿润、光滑的单个菌落至15mL离心管中，加5mLLB液体培养基培养过夜，以该菌液为DNA模板，M13引物(表3)，按照如下反应体系和反应程序进行PCR检测：

表3：PCR鉴定引物信息

该PCR检测的反应体系为25μL，包括：

(1)10μmol/L正相引物M13-F 1μL；和10μmol/L反向引物M13-R1μL；

(2)菌液2μL；

(3)2×Taq Master Mix预混液12.5μL；

(4)ddH

该PCR检测的反应程序为：

(1)阶段1：95℃预变性5min；

(2)阶段2：95℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸10min，35个循环；

(3)阶段3：72℃延伸7min，4℃∞。

所得PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳观察。挑取鉴定为阳性克隆的菌液进行下一步实验。

2.8、PRVgE基因的序列测定及分析

将上一步获得的鉴定为阳性克隆的菌液送至上海生工生物工程技术服务公司进行测序，测序引物为M13，并进行序列比对分析。测序结果经blast比对分析，本发明所述的PCR方法扩增的基因序列与PRV gE毒株的同源性在100％，说明本发明提供的引物对扩增的目的基因为PRV gE。构建获得的质粒可作为试剂盒构建中的阳性质控品。在研发阶段，将该质粒作为标准品对方法进行开发和验证。

三、标准曲线的绘制

将2.8中鉴定为阳性重组菌的菌液提取质粒，Nano Drop2000测浓度C(218.8ng/μL),将提取的质粒计算出拷贝数(拷贝数的计算公式为：copies/μL＝(6.02×10

反应结束后逐渐加温，每加温一度，读一次荧光信号。以温度为横坐标，荧光信号的变化为纵坐标，绘制伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR扩增熔解曲线见图3，Tm值为84.5℃，熔解曲线为单峰，说明扩增的产物特异性好。

实施例2：伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR测定方法优化

使用48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃的温度梯度对反应进行优化，通过优化反应条件，确认以下的反应体系和扩增程序为最佳条件：

最佳反应程序：20μL的反应体系，包括：

(1)10μmol/L SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的正向引物0.4μL；和10μmol/L SEQID

NO:2所示核苷酸序列的反向引物0.4μL；50×ROX reference Dye2 0.4μL；

(2)待测样品DNA模板2μL；

(3)2×ChamQ SYBR qPCR Master mix预混液10μL；

(4)ddH

最佳扩增程序为：

(1)预变性阶段：95℃预变性30s；

(2)循环阶段：95℃变性5s，48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃退火30s，40个循环；

(3)溶解曲线阶段：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

实施例3：伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的试剂盒制备

本发明提供的伪狂犬病毒野毒株核酸检测试剂盒，包括：2×ChamQ SYBR qPCRMaster mix预混液、50×ROX reference Dye2、ddH

本试剂盒制备过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)，其余购自天根生化科技(北京)有限公司、北京化工厂。所述试剂盒的制备过程如下：

1、PCR反应液制备

(1)引物设计与合成

根据GenBank已发表的PRV gE基因序列，用MEGA 6.0软件进行序列比对找出保守序列。根据伪狂犬病毒野毒株保守序列用Primer Premier 5.0软件设计检测伪狂犬病毒野毒株定量PCR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物包括：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的正向引物，和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向引物。

(2)引物的溶解

取合成好的引物(SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的正向引物，和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向引物)干粉管，12,000rpm离心1min，按照引物溶解说明书加入ddH

(3)PCR反应液配制：

按下述比例配制PCR反应液：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的正向引物(10μmol/L)0.4μL，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向引物(10μmol/L)0.4μL，50×ROX referenceDye2 0.4μL、2×ChamQ SYBR qPCR Master mix预混液10μL，ddH

2、阴性质控品制备

阴性质控品的作用是用来防止因污染而产生的假阳性。本发明采用ddH2O作为阴性质控品，对整个实验过程进行监控。

3、阳性质控品制备

阳性质控品的作用是监控试剂是否失效及性能是否下降。本发明采用PRVgE型的阳性重组质粒作为阳性质控品。按照本技术领域中常用的分子克隆技术，阳性重组质粒的构建和提取方法如下：

首先利用SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的正向引物，和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的反向引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；然后采用北京天根生化科技有限公司胶回收试剂盒回收PCR产物作为目的片段；采用大连宝生物的pMD18-T Cloning Vector试剂盒，将上述目的片段插入pMD18-T载体中，构建重组质粒，通过转化及筛选，得到含插入有上述目的片段的重组质粒的阳性克隆菌；该阳性克隆菌经过扩大培养后，用天根质粒提取试剂盒提取培养菌液中的质粒并用Nano Drop2000进行定量。

4、质控标准：

阴性质控品：阴性；

阳性质控品：阳性。

以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

5、分析判断：

SYBR Green I实时荧光定量PCR检测荧光强弱，根据熔解曲线Tm值判定阴阳性，并且可以根据样品的CT值和绘制的标准曲线，对样品中的病毒核酸进行绝对定量。

实施例4：伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法特异性试验

利用本发明建立的伪狂犬病毒野毒株PCR检测方法分别以PRV野毒株、PRV(Bartha-K61)、PPV、PDCoV、JEV、PRRSV、PEDV核酸、阳性对照、阴性对照为模板进行PCR扩增。

结果说明：应用本申请提供的伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法对PRV(Bartha-K61)、PPV、PDCoV、JEV、PRRSV、PEDV的检测结果均为阴性，只有PRV野毒株gE的PCR检测结果呈阳性，表明该PCR检测方法的特异性良好(SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法需要根据溶解曲线Tm值来判定阴阳性)。

实施例5：伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法敏感性试验

将实施例1中获得的阳性重组菌提取质粒，提取方法为：12,000rpm离心2min，弃上清后参照质粒小提试剂盒说明书(北京天根)提取质粒，提取后通过超微量分光光度计NanoDrop2000测定提取的重组质粒的浓度，再根据重组质粒分子质量和阿伏伽德罗常数将质粒浓度换算成单位体积分子拷贝数，并将重组质粒以1.0×10

结果表明：本发明提供的伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的最低检测量为1.0×10

实施例6：伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法重复性试验

利用本发明所述的伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，以不同浓度的PRV gE型阳性质粒DNA为模板，进行三次扩增(间隔五天)，以确定检测结果的重复性，结果见表4。

表4：伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR重复性试验结果

结果说明：利用本发明所述的伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法以不同浓度的PRV gE型阳性质粒在不同时间点进行测定，进行三次扩增(间隔两天)，批内和批间重复性试验结果统计学分析显示其变异系数范围均小于0.5％，表明本发明所述的方法重复性良好。

实施例7：伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法对临床样品的检测

利用本发明所述的伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法对采自江西32个猪场256份样品(猪的肺、淋巴结或脾脏)进行检测，以验证该方法的实用性。结果5份检测样品呈阳性，检出的阳性率为1.95％。经测序验证为临床PRV野毒毒株。

结果表明：本发明所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法在临床实践上具有可行性。

实施例8：伪狂犬病毒野毒株SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法对环境样品的检测

利用本发明所述的伪狂犬病毒野毒株的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法对采自河南21个猪场的189份环境样品(污水、猪舍地板拭子、食槽拭子、水槽拭子、饲料)，以验证该方法的实用性。结果4份检测样品呈阳性，检出的阳性率为2.12％。经测序验证为临床PRV野毒毒株。

结果表明：本发明所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法在临床实践上具有可行性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南宏信检测技术有限公司

<120> 猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物对及试剂盒

<130> MP2022554

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagatgacg ttggccgagc tgcgccagaa gctcgccacc atcgcagaag aacaataaaa 60

aggtggtgtt tgcataattt tgtgggtggc gttttatctc cgtccgcgcc gt 112

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagatgacg ttggccgagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acggcgcgga cggagataaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgatcgtcg tcctcctgat c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagaaagggc cgcatggtct ca 22