猪伪狂犬病毒抗体ELISA试剂盒的研制及猪乙型脑炎病毒EIII蛋白的原核表达

摘要

猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的一种传染病，对世界养猪业造成严重危害。PRV属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，该病毒可感染许多种类的哺乳动物，但猪是PRV的自然宿主和唯一潜在的携带者。
　　流行性乙型脑炎（JE）是由流行性乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种蚊媒性人畜共患传染病。感染JEV可引起怀孕母猪流产、产死胎或木乃伊胎，也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育，严重影响养猪业的持续发展。
　　本研究采用PCR方法扩增PRVgE基因的主要抗原表位区，构建原核表达质粒pET-gE，及利用本实验室保存的原核表达质粒pET-EIII，使两种重组质粒在大肠杆菌中进行高效表达。在SDS-PAGE分析基础上，结合ImageJ和Graphpad prism5.0软件的分析，对影响重组gE蛋白和重组EIII蛋白表达的诱导温度，诱导起始OD600，及IPTG浓度等因素进行了优化。确定重组gE蛋白最佳表达条件为：当菌体浓度达到1.2左右时，加入终浓度为1.5mM的IPTG，16℃恒温摇床175rpm过夜振荡培养。重组EIII蛋白最佳表达条件为：当菌体浓度达到1.6左右时，加入终浓度为1mM的IPTG，16℃恒温摇床175rpm过夜振荡培养。为得到高纯度的重组gE蛋白和重组EIII蛋白，对纯化条件进行了探索，确定重组gE蛋白结合液中咪唑浓度为100mM，蛋白洗脱液中咪唑浓度为500mM。确定重组EIII蛋白结合液中咪唑浓度为100mM，蛋白洗脱液中咪唑浓度为300mM。纯化后的蛋白分别进行Western blot鉴定，重组gE蛋白只与PRV标准阳性血清反应，重组EIII蛋白只与JEV标准阳性血清反应，与阴性血清均不发生反应。表明纯化的重组gE蛋白和重组EIII蛋白具有良好的特异性和反应原性。
　　利用原核重组表达的gE蛋白作为包被抗原，并对各反应条件进行优化，建立了检测PRV血清抗体的间接ELISA方法。ELISA反应程序为：包被抗原以浓度0.5μg/mL37℃包被2h；封闭液为1%明胶+2.5%BD脱脂乳，37℃封闭2.5h；血清稀释10×，37℃孵育45min；酶标二抗的最佳稀释度为3μg/mL，37℃孵育60min；显色条件为37℃孵育15min；利用TG-ROC方法确定临界值为0.721，即当S/P≥0.721时，结果判定为阳性；S/P<0.721时，结果判定为阴性。以该方法检测PRV阳性血清和其他猪病病原阳性血清，除了PRV阳性血清呈阳性外，其他猪病病原阳性血清的检测结果均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。批内重复和批间重复的最大变异系数分别是5.95%和9.62%，表明该方法重复性良好。此外，使用该方法对250份临床血清进行检测，与国内外4种商品化试剂盒比较符合率最高为83.6%。该方法可以用于PRV的临床检测，为PRV流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。

目录

声明

英 文 缩 略 词 表

1 前言

1.1 猪伪狂犬病概述

1.2 猪乙型脑炎概述

1.3 ELISA概述

1.4 研究目的及意义

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 PRV gE基因的PCR扩增结果

3.2 重组质粒pET-gE的鉴定

3.3 重组蛋白的表达

3.4 重组gE蛋白和重组EIII蛋白表达条件优化结果

3.5 重组gE蛋白和重组EIII蛋白的纯化条件

3.6 重组gE蛋白和重组EIII蛋白大量纯化结果

3.7 重组gE蛋白和重组EIII蛋白抗原性鉴定结果

3.8 重组质粒pET-gE和pET-EIII的稳定性鉴定

3.9 重组gE蛋白间接ELISA方法的建立

3.10 ELISA方法的评价

4 讨论

4.1 重组蛋白gE和重组EIII蛋白的表达

4.2 gE-ELISA方法的建立

5 总结

致谢

参考文献

附录

硕士研究生期间所获科研成果