一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法

摘要

本发明公开了一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括包括以下步骤：S1、溶液配制：混合对照品溶液配制和供试品溶液配制；S2、高效液相色谱‑电喷雾检测器联用进行含量分析：分别精密吸取经步骤S1制得的所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10～20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测。本发明的检测方法，能够满足中药企业日常样品的检验需求，为产品的质量提供保障。

说明书

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法。

背景技术

柴胡颗粒源自东汉张仲景《伤寒杂病论》的经典名方小柴胡汤，仅把人参改为党参，由柴胡、黄芩、姜半夏、党参、生姜、甘草、大枣七味药组成，主要用于解表散热，疏肝和胃。方中，柴胡和解少阳，透泄外邪，疏肝解郁为君药。小柴胡颗粒在2018年全国中成药类感冒药终端零售额占比持续上升至75.79％，是中成药类感冒药的绝对主导者。目前，小柴胡颗粒有近100家企业获得批准文号，其市售价格差异性较大，质量也参次不齐。

《中国药典》(2020版)仅对黄芩苷进行含量测定，未对制剂中君药柴胡进行含量限定规定，无法保证其有效性。《日本药典》(第17版)中相近品种小柴胡汤的质量标准中，采用了HPLC法对柴胡皂苷b

电喷雾检测器(CAD)是一种新型的通用型质量检测器。它不依赖于化合物的分子结构，能够检测大部分非挥发性和半挥发性的化合物，尤其适用于不含有发色基团的化合物。与蒸发光散射检测器(ELSD)相比，CAD具有高灵敏度、重现性及稳定性良好、动态检测范围宽等特点，操作简单、维护方便，是药物分析领域理想的检测手段之一。

因此，亟待建立一种简单、准确、实用的小柴胡颗粒中柴胡皂苷多组分的同时测定方法，有效可行地控制产品质量。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，能够满足中药企业日常样品的检验需求，为产品的质量提供保障。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

提供一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，备用；

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定，加水使其完全溶解，经活化好的C18固相萃取小柱，依次以含5％浓氨或1％NaOH的10％甲醇溶液、30％甲醇和分析纯甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至容量瓶，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取经步骤S1制得的所述混合对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸或0.01％甲酸的水溶液、10％乙腈-90％水溶液(含0.1mmol乙酸铵，pH为4.0)；流动相B：色谱纯乙腈、90％乙腈-10％水溶液(含0.1mmol乙酸铵，pH为4.0)，进行梯度洗脱；色谱柱Waters CORTECTS C18或色谱柱Thermo HypersilGOLD；柱温：25-35℃；流速：0.7-0.9mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：35-50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

优选地，S1中，所述C18固相萃取小柱先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡。

优选地，S2中，所述色谱柱Waters CORTECTS C18的柱长为15cm，内径为4.6mm，填料粒径为2.7μm。

优选地，S2中，所述色谱柱Thermo Hypersil GOLD的柱长为15cm，内径为4.6mm，填料粒径为3μm。

优选地，所述色谱柱Waters CORTECTS C18或色谱柱Thermo Hypersil GOLD采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。

优选地，当所述流动相A采用含0.01％乙酸或0.01％甲酸的水溶液，所述流动相B采用色谱纯乙腈时，所述洗脱梯度为：

0～55min，30～32％B；

55～58min，32～90％B；

58～61min，90～30％B；

61～70min，30％B。

优选地，当所述流动相A采用含0.1mmol乙酸铵(pH为4.0)的10％乙腈水溶液，所述流动相B采用含0.1mmol乙酸铵(pH为4.0)的90％乙腈水溶液时，所述洗脱梯度为：

0～35min，25～35％B；

35～37min，35～90％B；

37～45min，90～25％B；

45～50min，25％B。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

1、本发明采用高效液相色谱-电喷雾检测器联用技术(HPLC-CAD)同时测定小柴胡颗粒中7种柴胡皂苷的含量，方法简单、可靠、耐用性良好、先进可行。

2、采用本发明方法测定了市售的15批次小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量，结果表明本方法能够用于评估小柴胡产品批次间的一致性及工艺的可控性。本发明建立了多组分柴胡皂苷含量测定方法，可全面控制小柴胡颗粒的质量，为其质量提升提供参考。

附图说明

图1为本发明的HPLC-CAD典型色谱图(其中：A-空白溶剂；B-缺柴胡的阴性制剂；C-混合对照品溶液；D-供试品溶液；1-SSc；2-SSi；3-SSh；4-SSa；5-SSb

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

(1)标准曲线：

制备5个不同浓度的混合对照品溶液，各吸取10μL，注入液相色谱仪。以对照品溶液浓度对数值LogC为横坐标x，以峰面积的对数值LogA为纵坐标y进行线性回归。结果如表1所示：

表1线性回归方程和线性范围

由表1中数据可知，7个柴胡皂苷在各线性范围内呈良好的线性关系。

(2)精密度：

取混合对照品溶液，连续进样6次，连续进样3天，测定7个柴胡皂苷的峰面积，计算其相对标准偏差(RSD％)，考察日内和日间精密度。结果表明，内日及日间精密度的RSD％均不大于2.1％，方法精密度良好。

(3)重复性：

称取同一批次小柴胡颗粒6份，配制供试品溶液，进样，测定7个柴胡皂苷的峰面积，SSc、SSi、SSh、SSa、SSb

(4)准确度：

称取已知含量的小柴胡颗粒9份，加入各对照品的量相当于小柴胡颗粒中各柴胡皂苷含量的50％、100％、150％浓度水平，每个浓度平行3份。配制供试品溶液，进样，测定峰面积。以标准曲线法计算各成分含量，计算回收率。结果如表2所示：

表2回收率结果

应用例

15批样品的测定：

取15批小柴胡颗粒(广州白云山光华制药股份有限公司生产，批号：K90106、K90108、K90116、K90117、K90125、K90141、K90143、K90148、K90150、K90155、K90156、K90157、K90158、K90159、K90162)，按照上述方法进行测定，小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例2

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流速：0.7mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例3

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流速：0.9mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例4

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：25℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例5

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：35℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例6

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：35psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例7

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％甲酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例8

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含5％浓氨的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：10％乙腈-90％水(含0.1mmol乙酸铵，pH为4.0)，流动相B：90％乙腈-10％水(含0.1mmol乙酸铵，pH为4.0)，进行梯度洗脱：0～35min，25～35％B；35～37min，35～90％B；37～45min，90～25％B；45～50min，25％B；色谱柱Thermo HypersilGOLD(4.6×150mm，3μm)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

实施例9

一种小柴胡颗粒中柴胡皂苷类成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

对照品溶液配制：取柴胡皂苷C(SSc)、I(SSi)、H(SSh)、A(SSa)、B

混合对照品溶液配制：精密量取所述7种对照品溶液，配制成所需质量浓度的混合对照品溶液，即每l mL含SSc 10μg、SSi 10μg、SSh 10μg、SSa 30μg、SSb

供试品溶液配制：小柴胡颗粒适量，研细，精密称定3g，加6mL水使其完全溶解，经活化好的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(先用甲醇6mL预洗，再用水10mL平衡)，依次以含1％NaOH的10％甲醇溶液、30％甲醇和甲醇各10mL洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL容量瓶，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

S2、高效液相色谱-电喷雾检测器联用进行含量分析：

分别精密吸取所述混合对照品溶液10μL、20μL，所述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；采用电喷雾检测器进行色谱峰的检测；

色谱条件：流动相A：含0.01％乙酸的水溶液，流动相B：色谱纯乙腈，进行梯度洗脱：0～55min，30～32％B；55～58min，32～90％B；58～61min，90～30％B；61～70min，30％B；色谱柱Waters CORTECTS C18(4.6×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；

电喷雾检测器条件：电喷雾检测器，氮气压力：50psi，量程：100pA，电喷雾温度：50℃。

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量以每袋含柴胡皂苷C(C

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。