一种检测明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇含量的方法

摘要

本发明公开了一种检测明日叶中4‑羟基德里辛和黄当归醇含量的方法，所述方法包括待测样品溶液的制备、标准溶液配制、检测方法的色谱条件、待测样品定量检测等步骤。本发明通过简便、快速、高效的待测样品制备方法，并利用HPLC‑PDA通过外标法建立标准曲线，检测、计算得到不同产地、不同部位明日叶中4‑羟基德里辛和黄当归醇含量。该方法样品前处理相较于现有技术中复杂的前处理步骤更为便捷有效；建立的HPLC‑PDA检测4‑羟基德里辛和黄当归醇相较于现有技术出峰时间快，分离度好，线性范围大，能够实现快速准确定量。

说明书

技术领域

本发明属于食品分析化学技术领域，具体涉及一种明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇的含量检测方法。

背景技术

明日叶（Angelica keiskei Koidzumi）为伞形花科，当归属，宿根多年生长常绿直立草本植物，产于日本太平洋沿海地区，因生长迅速及再生特性，而得名。主要作为食物使用，在日本有治疗流感、发烧等疾病的传统习俗，但未被FDA批准用于医疗用途。我国部分地区自2008年开始引种明日叶，现已在山东、海南、江苏、四川、贵州、云南、广东、辽宁等多省种植。民间通常用其嫩茎叶凉拌、炒食、榨汁、汆汤，或以炒茶、干磨粉的方式食用。2019年，经我国卫健委批准成为新资源食品。

其中4-羟基德里辛（4-HD）和黄当归醇（XAG）是明日叶中重要的查尔酮类物质。明日叶含有在植物界罕见的查尔酮类活性物质，食用明日叶对糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、癌症等多种疾病有预防和治疗作用。目前不同产地明日叶成分含量鲜有报道，有研究表明不同部位明日叶中查尔酮类成分含量有区别。

当前也有诸多针对明日叶中查尔酮类物质的研究，但是明日叶前处理步骤都比较复杂，对于处理大量的样本来说非常不便，无法进行实际应用。目前文献记载液相色谱检测明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇分离度差,分析时间长。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于HPLC-PDA检测不同产地明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇含量的方法，以弥补现有技术的不足。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

基于HPLC-PDA检测4-羟基德里辛和黄当归醇含量的方法，该方法中的色谱条件为：硅胶色谱柱Thermo NO.30005-254630 (4.6mm*250mm*5um)；流动相：0．1％甲酸溶液(A)一甲醇(B)，梯度洗脱程序如下：0～10min，10％A；10～15.0 min，60％A；15.00～15.10min，10％A;15.10～18.00min，10％A。流速1.0 mL／min；柱温40℃；检测波长370 nm；进样量5uL；检测时间18.00 min。

检测波长的选择 ：对 4-羟基德里辛和黄色当归醇的标准品溶液在 HPLC-PDA 中进行分离扫描，370 nm 处显示有最大吸收值，作为扫描波长。

一种检测明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇含量的方法，该方法包括以下步骤：

（1）明日叶样品经甲醇匀浆提取，过滤膜，备用；

（2）使用甲醇配制标准溶液；

（3） HPLC-PDA条件：硅胶色谱柱；流动相：0．1％甲酸溶液(A)一甲醇(B)，梯度洗脱程序如下：0～10min，10％A；10～15.0 min，60％A；15.00～15.10min，10％A;15.10～18.00min，10％A。流速1.0 mL／min；柱温40℃；检测波长370 nm；进样量5 uL；检测时间18min；

（4）根据步骤（2）配制的标准液按步骤（3）的液相色谱条件进行检测，并绘制标准曲线；

（5）将步骤（1）制备得到的提取液按步骤（3）的液相色谱条件进行检测，利用步骤（4）得到的标准曲线得到样品中4-羟基德里辛和黄当归醇的含量。更进一步的，称取5g明日叶样品，用10mL甲醇匀浆，过0．45 um滤膜，备用。

进一步的，所述步骤（2）具体为：标准储备溶液制备 准确称取4-羟基德里辛9.90mg，XAG11.30 mg，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超声溶解得标准储备液。各吸取1mL储备液，配成混合储备液。分别准确吸取混合储备液200、150、100、 50、5 uL置于1 mL小瓶中，加甲醇定容，摇匀，配制成一系列梯度浓度的工作溶液。

进一步的，所述步骤（4）标准曲线中回归方程为 Y=7.45515X-48.70171，R2=0.9993。黄色当归醇的回归方程为 Y=7.20151X+6.95512，R2=0.99988。

基于上述方法，能够快速简便检测大量明日叶样品，具有巨大的实际应用价值。

一般情况下，目标化合物极性大于色谱柱固定相的极性，采取反相色谱，流动相将极性较强的组分最先冲出来，但由于本实验的两种目标化合物极性相近，不容易进行分离，目前反相色谱常用的C18柱分离效果不理想，本发明采用硅胶柱进行分离，分离4-羟基德里辛和黄当归醇效果好。

本发明的优点和技术效果为：

1.本发明使用甲醇作为样品前处理溶剂相较于现有技术中复杂的前处理步骤更为便捷有效；

2.本发明建立的HPLC-PDA检测4-羟基德里辛和黄当归醇相较于现有技术能够实现快速准确定量，目标化合物在11分钟内出峰完全，18分钟内完成一次检测分析。两个峰之间的分离度 R=5.3，分离效果良好；

3.本发明提供的检测方准确性好，平均回收率分别为98.4%和102.3%；

4. 本发明提供的检测方法线性浓度范围大，4-HD、XAG在4.95μg/mL-495μg/mL、5.65μg/mL -565μg/mL浓度范围内线性关系良好；

5.黄色当归醇峰面积的 RSD 值为1.93%，4-羟基德里辛峰面积的 RSD 值为1.87%，精密度良好。

附图说明

图1为具体实施例中混合标准品溶液HPLC 色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。

实施例1：一种基于HPLC-PDA检测不同产地明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇含量的方法，该方法包括以下步骤：

（1）明日叶样品前处理：称取5g明日叶样品，用10mL甲醇匀浆，过0.45 um滤膜，备用；

（2）标准溶液配制：准确称取4-羟基德里辛9.90mg，XAG11.30 mg，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超声溶解得标准储备液。各吸取1 mL储备液，配成混合储备液。分别准确吸取混合储备液200、150、100、 50、5 uL置于1 mL小瓶中，加甲醇定容，摇匀，配制成一系列梯度浓度的工作溶液；

（3）确定HPLC-PDA检测方法的色谱条件：硅胶色谱柱Thermo NO.30005-254630(4.6mm*250mm*5um) ；流动相：0.1％甲酸溶液(A)一甲醇(B)，梯度洗脱程序如下：0～10min，10％A；10～15.0 min，60％A；15.00～15.10min，80％A， 15.10～18.00min，10％A。流速1.0 mL／min；柱温40℃；检测波长370 nm；进样量5 uL；检测时间18.00 min；

（4）根据步骤（2）配制的标准液基于步骤（2）提供的液相色谱方法进行检测，并绘制标准曲线；

（5）将步骤（1）制备得到的基于步骤（2）提供的液相色谱方法进行检测，利用步骤（4）得到的标准曲线得到样品中4-羟基德里辛和黄色当归醇的含量。

实施例2：该实施例以多个地区明日叶为取材样品，对其4-羟基德里辛和黄色当归醇含量进行测定。

1.1 材料与仪器

标准品：黄色当归醇XAG（上海诗丹德标准技术有限公司，纯度99.3%）,4-羟基德里辛4-HD（上海诗丹德标准技术有限公司，纯度93.3%）；甲醇（色谱纯，德国默克公司），乙腈（色谱纯，美国Burdick & Jackson）；

样品：新鲜明日叶植株，产地分别为山东日照（R）、山东青岛（Q）、江苏（J）、广西（G）、浙江（Z）、福建（F），不同来源的明日叶样品见表1。采集时间为2020年5月。样品粉碎分装后在-20℃条件下贮存；

仪器：高效液相色谱仪(PDA检测器及ChemiStation色谱工作检测站) 美国安捷伦公司； 氮气吹干仪（美国Organomation公司N-EVAP），MultiReax漩涡振荡器(德国Heidolph公司)，匀浆机3-30KS冷冻离心机（德国Sigma公司），Milli-Q超纯水机，XS205Du电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，粉碎机。

表1不同来源的明日叶样品。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线配制

标准储备溶液制备 准确称取4-HD9.90mg、XAG11.30 mg，分别置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超声溶解得标准储备液。各吸取1 mL储备液，配成混合储备液。分别准确吸取混合储备液200、150、100、 50、5uL置于1 mL小瓶中，加甲醇定容，摇匀，配制成一系列混合工作溶液；

1.2.2样品前处理

现有技术中样品前处理方式均较为复杂，而本方法根据目标物极性，使用甲醇作为提取溶剂；称取5g样本，用10mL甲醇匀浆，过0．45 um滤膜，备用；

1.2.3 仪器工作参数

检测波长的选择 ：对 4-羟基德里辛和黄色当归醇标准品溶液在 HPLC-PDA 中进行分离扫描，370 nm 处显示有最大吸收值，则作为扫描波长；

色谱条件 ：硅胶色谱柱Thermo NO.30005-254630 (4.6mm*250mm*5um)；流动相：0．1％甲酸溶液(A)一甲醇(B)，梯度洗脱程序如下：0～10min，10％A；10～15.0 min，60％A；15.00～15.10min，80％A，15.10～18.00min，10％A。流速1.0 mL／min；柱温40℃；检测波长370 nm；进样量5 uL；检测时间18.00 min。

实验结果分析：

2.1 标准曲线

4-羟基德里辛的回归方程为 Y=7.45515X-48.70171，R2=0.9993；黄色当归醇的回归方程为 Y=7.20151X+6.95512，R2=0.99988。结果表明 4-HD、XAG在4.95μg/mL-495μg/mL、5.65μg/mL -565μg/mL浓度范围内线性关系良好；4-HD、XAG混合标准溶液工作溶液的高效液相色谱图见图1；由图1-a可知，4-HD、XAG 两个峰之间的分离度 R=5.3，色谱条件适用于4-HD、XAG 分离和检测，分离效果良好。

2.2 精密度

分别称取同一样品6份，称样量5.00g，进行前处理后分别进样测定，得黄色当归醇峰面积的 RSD 值为1.93%，4-羟基德里辛峰面积的 RSD 值为 1.87%，精密度良好。

2.3 加标回收试验

分别称取6份芹菜样品（模拟空白基质）适量共 6 份，称样量5.00g。分别加入混合标准品溶液(CXAG=1130µg/mL;C4-HD=990µg/mL)100µL，进样测定，得黄色当归醇的平均回收率为102.3%，4-羟基德里辛的平均回收率为 98.4%，RSD 值均小于2%，回收率良好。

2.4检出限

分别称取6份芹菜样品（模拟空白基质）适量共 6 份，称样量5.00g；分别加入混合标准品溶液(CXAG=1130µg/mL;C4-HD=990µg/mL)10 µL，进样测定，在2mg/kg浓度下前处理上机后S/N均大于3；经改进的前处理方法处理上机后，在该浓度下能够有效的避免基质干扰，准确定性。

2.5实际样品的检测

新鲜明日叶植株，产地分别为山东日照（R）、山东青岛（Q）、江苏（J）、广西（G）、浙江（Z）、福建（F）；对植株不同部位进行了测定，结果见表2；经检测，从不同地域看，南方地区（如广西）明日叶中4-羟基德里辛含量和黄当归醇含量明显较高，但江苏的样品含量明显低，可能和江苏样本生长时间较短有关；日照样品中两种功效成分的含量高于青岛地区。从明日叶不同部位看，4-羟基德里辛、黄色当归醇主要分布在茎、根中，分布规律为：鲜根＞鲜茎＞鲜叶。

表 2不同地区、不同部位明日叶中 4-羟基德里辛和黄色当归醇的含量。

本方法建立了一种明日叶中4-羟基德里辛和黄当归醇的快速检测方法。方法验证结果表明，4-羟基德里辛的线性范围为4.95μg/mL-495μg/mL，线性相关系数r2为0.9993；平均回收率为 98.4%；最低检出限为2μg/g。

黄当归醇线性范围为5.65μg/mL -565μg/mL，其线性相关系数为0.99988；方法重复性好，平均回收率分别为102.3%。最低检出限为2μg/g；样品前处理简单，适合于明日叶功效组分快速检测。

对测定6地区样品中功效成分4-羟基德里辛和黄当归醇进行了检测。

经检测，从不同地域看，南方地区（如广西）明日叶中4-羟基德里辛含量和黄当归醇含量明显较高，但江苏的样品含量明显低，可能和江苏样本生长时间较短有关；日照样品中两种功效成分的含量高于青岛地区；从明日叶不同部位看，4-羟基德里辛、黄色当归醇主要分布在茎、根中，分布规律为：鲜根＞鲜茎＞鲜叶；本方法对明日叶中功效成分提取产业化发展提供了参考依据。