一种基于SPR技术检测沙丁胺醇的方法

摘要

本发明公开了一种基于SPR技术检测沙丁胺醇的方法，本方法中通过引入了不同巯基和羧基的硫醇SAMs来调节表面羧基官能团的浓度，用双巯基双羧酸的双巯基丁二酸(DMSA)来代替传统的连接分子，并使用MoS2和AuNPs来增强SPR信号，提高SPR生物传感器检测灵敏性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于SPR技术检测沙丁胺醇的方法，属于化学分析领域。

背景技术

表面等离子体共振技术最初主要通过光学上的折射率变化应用于大分子间相互作用，如考察抗原-抗体、受体-配体，适配体-识别物之间的亲和力，但由于其快速、无标记、灵敏度高的优点逐渐应用到小分子检测领域。其中SPR免疫传感器是应用最为广泛的，其检测模式主要为竞争反应，即在SPR芯片表面通过单分子层固定抗原或抗体，然后通入抗原/抗体以及检测靶标物竞争抗体上的识别位点，随着靶标物浓度的不同，其SPR芯片表面折射率发生变化，并且靶标物浓度与折射率之间具有一定计量关系，进而对靶标物进行定量。

SPR免疫传感器研制中，抗原/抗体在SPR芯片上的固定是非常关键的一步。硫醇分子是一种包含巯基和羧基的双功能分子，通过巯基与金形成Au-S键，在金膜表面形成单分子层(SAMs)，有效减少蛋白质在金片上的非特异性吸附。同时，羧基通过碳二亚胺法与抗原/抗体中的氨基共价偶联，从而将抗原/抗体结合在具有基底金膜的芯片表面。作为连接分子，硫醇中羧基基团的密度极大的影响着抗原/抗体结合，进而影响传感器灵敏度和检测性能。

现在通常用来作为检测SPR芯片连接分子的是单巯基单羧酸的MPA，在使用MPA作为SAMs过程中，其羧基基团的密度极大，远远超过固定化抗原所需要的的活性位点，这势必影响着抗原/抗体结合，进而影响传感器的灵敏度和检测性能。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种基于SPR技术检测沙丁胺醇的方法，本方法中通过引入了不同巯基和羧基的硫醇SAMs来调节表面羧基官能团的浓度，用双巯基双羧酸的双巯基丁二酸(DMSA)来代替传统的连接分子，并使用MoS

一种基于SPR技术检测沙丁胺醇的方法，包括如下步骤：

S1制作MoS

S2取1-1.2g猪肉加入10-12mL乙腈，均质取上清液，氮气吹干，使用2-2.3mL正己烷溶解，加入1-1.2mLPBS溶液，充分混合后80-85℃水浴温育2-3min，收集底部溶液，通过滤膜过滤，作为待测液体；

S3利用SAL-Ab溶液和不同浓度的SAL标准溶液制作标准曲线；

S4取240-250μL步骤S2中的待测液体用于装备有步骤S1制作的MoS

进一步的，步骤S3中所述的SAL-Ab溶液浓度为75μg/mL；所述的不同浓度的SAL标准溶液的浓度分别为5、10、20、30、40、60、80、100、150ng/mL。

进一步的，上述方法中步骤S1所述的制作MoS

1)取10-15mg MoS

2)取步骤1)中制备的分散液190-200mL，涂在SPR芯片上；

3)将经过步骤2)处理过的芯片浸泡在1,6-己二硫醇(HDT)溶液中，浸泡后使用乙醇和水分别冲洗一次，氮气吹干，将处理后的芯片放入AuNPs溶液中过夜，用去离子水冲洗干净，氮气吹干；

4)将经过步骤3)处理过的芯片分别置于0.5mmol/L DMSA溶液中，反应23-24h，反应结束后，用乙醇和去离子水分别冲洗SPR芯片，并用氮气吹干；

5)将经过步骤4)处理过的SPR芯片置于400mmol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)羰基二酰亚胺盐酸盐(EDC)和100mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，反应25-30min，结束后去离子水冲洗氮气吹干；

6)取180-200μL SAL抗原溶液涂覆在步骤5)处理好的SPR芯片中，使用乙醇胺溶液封闭未封闭未反应的活性位点，最后用PBS溶液冲洗，MoS

进一步的，上述步骤1)中所述的一次离心的条件为：转速2000rpm，时间20min；所述二次离心的条件为：转速6000rpm，时间20min。

进一步的，步骤3)中所述的1,6-己二硫醇(HDT)溶液的浓度为0.01mol/L，所述浸泡的时间为24h。

进一步的，步骤3)中所述的AuNPs溶液为25nm的AuNPs溶液。

进一步的，步骤4)中所述的DMSA溶液浓度为0.5mmol/L。

进一步的，步骤5)中所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)羰基二酰亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合比例为4:1。

进一步的，步骤6)中所述的SAL抗原溶液的浓度为1mg/mL。

有益效果：

本研究中通过引入了不同巯基和羧基的硫醇SAMs来调节表面羧基官能团的浓度，用双巯基双羧酸的双巯基丁二酸(DMSA)来代替传统的连接分子如单巯基单羧酸的MPA，解决抗原/抗体结合中的空间位阻问题，实现控制抗体的构型和取向、提高灵敏度。

附图说明

图1在不同SAL-Ab浓度下芯片折射率变化。

图2 SPR免疫传感器检测SAL的标准曲线。

图3 DMSA-SPR免疫传感器特异性分析。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1制备SPR芯片

一、实验方法

1、MoS

2、AuNPs对SPR芯片的修饰：首先将MoS

3、自组装单分子层对SPR芯片的修饰：将AuNPs修饰的SPR芯片分别置于0.5mM巯基丙酸(MPA)、二氢硫辛酸(DHLA)和DMSA溶液中，反应24h。反应结束后，用乙醇和去离子水冲洗SPR芯片，并用氮气干燥。

4、SPR芯片上沙丁胺醇抗原的组装：将上述SPR芯片置于400mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)羰基二酰亚胺盐酸盐(EDC)和100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液中，室温下反应30min。反应结束后，用去离子水冲洗SPR芯片，并用氮气干燥。用200μL SAL抗原(SAL-BSA)溶液(1mg/mL)涂覆(2)中处理好的SPR芯片，并用乙醇胺溶液(1.0M，pH 8.5)封闭未反应的活性位点，最后用PBS溶液冲洗，得到MoS

5、最佳SAL单克隆抗体(SAL-Ab)浓度的选择：优化不同种类浓度的SAL-Ab，以25ug/mL作为最佳反应浓度。

6、最佳自组装单分子层的选择：使用SPR传感器研究MoS

二、实验结果

由图1可知，当SAL-Ab浓度同为75μg/mL时，三个芯片可结合的SAL-Ab的浓度已经饱和，此时MoS

实施例2检测样品中沙丁胺醇验证方法可靠性

1、样品处理：将1g猪肉加入10mL乙腈，均质提取1min，取1mL上清液于5mL离心管中，氮气吹干，再用2mL正己烷溶解，然后加入1mL PBS溶液，充分振荡均匀，并在85℃的水浴中温育3min，收集底部液体作为测试液体，待测液体通过0.22μm滤膜过滤，取250μL用于SPR免疫传感器检测，每个样品水平重复3次。

2、方法学验证：将最佳浓度的SAL-Ab和不同浓度的SAL标准溶液(5、10、20、30、40、60、80、100、150ng/mL)等体积混合在37℃条件下温育30min，每个浓度重复测定3次，记录折射率变化，制作标准曲线。结果表明在5-150ng/mL之间本方法具有良好的线性范围和检测灵敏度，如图2所示。线性回归方程y＝0.008x

为了验证SPR方法的准确性和可靠性，将猪肉用作样品基质，添加浓度为5、10和20μg/kg时的添加回收实验(n＝3)。结果如表1所示，本文方法检测SAL的回收率为94.9％～108.0％，RSD为1.30-5.58％，与UPLC-MS/MS方法的结果相比，具有良好的一致性。说明此方法可用于实际猪肉样品中沙丁胺醇的快速检测。

表1猪肉样品中沙丁胺醇的DMSA-SPR免疫传感器和UPLC/MS/MS测定结果

为了考察本文方法的识别特异性，选取了莱克多巴胺，盐酸克伦特罗，盐酸马布特罗和西马特罗为SAL的结构类似物。如图3所示，浓度在120ng/mL时，SAL的抑制率明显高于其他化合物，而且与混合物的抑制率相差不大。因此，本方法具有很好的特异识别性能。