高唾液酸化的自身抗体及其用途

摘要

本发明涉及抗天然髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的同种型G抗体，包含：‑表现高唾液酸化的Fc片段，和‑能够结合自身抗原的Fab片段。它还涉及包含这种抗体的组合物，及其在治疗中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及抗自身抗原，优选抗天然髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的同种型G抗体，包含：

-表现高唾液酸化的Fc片段，和

-能够结合自身抗原的Fab片段。

本发明还涉及包含这种抗体的组合物，及其在治疗中，特别在预防和/或治疗多发性硬化中的用途。

背景技术

当免疫应答错误靶向组织和器官的天然成分时，发生自身免疫疾病。产生的炎症反应干扰器官的天然功能，引起严重组织损伤，导致疾病表现。T和B淋巴细胞的激活对所有自身免疫疾病而言都是常见的，并导致有害的细胞和体液炎症反应。由于存在T淋巴细胞受体和B淋巴细胞，这些反应是抗原特异性的，在自身免疫的情况下，其对组织来源的自身抗原施加靶向攻击。这是因为从病灶分离的抗体和T淋巴细胞容易与发炎组织中存在的自身抗原反应。

器官特异性自身免疫疾病的治疗目前基于保守治疗方法，其旨在耗尽免疫细胞、阻止其迁移至组织损伤、中和效应细胞因子，或甚至静脉施用免疫球蛋白(IVIG)。但是，即使这些治疗有效，一旦治疗结束，疾病的自然病程就恢复了。

旨在治愈免疫介导的炎症性疾病的未来疗法必须提高其有效性，以持续超过治疗时间。在器官特异性自身免疫疾病的情况下，这涉及重新训练免疫系统以恢复免疫耐受性。

一种器官特异性自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)。

MS是中枢神经系统(CNS)疾病。CNS由大脑和脊髓组成。在微观水平上，中枢神经系统主要由星形胶质细胞、负责髓鞘形成的少突胶质细胞以及神经元组成，每个神经元由细胞体和由髓鞘包围的延伸物(轴突)组成。

该髓鞘用于隔离和保护神经纤维，并在沿神经元携带信息的神经冲动的传播速度中起作用。

MS的特征在于大脑和脊髓中白质的局灶性病变。疾病的病理标志包括脱髓鞘、少突胶质细胞凋亡、轴突结疤以及最终神经元缺失。这种组织损伤由炎症引起，如淋巴细胞和髓样细胞浸润到病变中所示。这种病理生理学导致轴突内神经冲动的传导困难，其导致运动、感觉和认知障碍。从长远来看，这些疾病可发展为不可逆的障碍。

最常见地，MS开始于复发缓解阶段，在此期间，积极的临床缺陷时期之后是延长的缓解时期。在病变内，炎症消失并且修复机制(髓鞘再生)允许患者重新获得适当的神经传导。但不幸的是，在某些晚期MS或严重的炎症发作期间，髓鞘再生机制被压垮，并且出现不可逆的神经冲动传导障碍并伴有相应的神经系统体征。临床上，这些患者发展为以逐步发展为特征的继发性进行性病程。

MS被认为是自身免疫疾病。在MS中，免疫系统攻击CNS中的抗原靶标，包括髓鞘。涉及免疫应答的所有组分：淋巴细胞、髓样细胞、还有由免疫细胞合成和释放的细胞因子，其有时促进发作，有时减轻发作。无论是抗原特异性还是致病机制方面，MS的免疫应答都不是静态的，其是复合的并随时间发展。如今使用的DMARD直接作用于淋巴细胞，或通过耗尽它们，或通过抑制其向CNS迁移来限制炎性发作的程度。

尽管当前的治疗减少复发并改进患者的生活质量，但是它们在控制疾病发展上不够有效。

因此，需要有效治疗MS，特别是能够减慢和/或减少疾病发展。

更一般地，需要有效治疗自身免疫疾病，特别是器官特异性自身免疫疾病。

发明内容

本发明解决了该问题。

其涉及抗自身抗原的同种型G抗体，包含：

-表现高唾液酸化的Fc片段，和

-能够结合自身抗原的Fab片段。

更优选地，其涉及抗天然髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的同种型G抗体，包含：

-表现高唾液酸化的Fc片段，和

-能够结合天然MOG的Fab片段。

实际上，如实施例所证实，发明人已经鉴定能够减慢和/或减少疾病发展的特异性抗MOG IgG抗体。该抗体衍生自致病性克隆8-18C5(由Merck Millipore以参考号MAB5680商业可得)；它能够结合天然人或鼠MOG蛋白，但不结合线性片段MOG

此外，与致病性克隆8-18C5相比，该抗体已被修饰，特别因为它包含高唾液酸化的Fc片段。更精确地，其Fc在第294位包含谷氨酸的点缺失(编号为EU索引中的编号或Kabat中的等效编号)，与不存在该缺失的Fc相比，这为其提供增加的唾液酸化。

特别地，这种缺失赋予变体与FcγRIII和FcγRIIB的结合亲和力降低，而与FcRn的结合不受影响；以及抗炎性能。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型中，该抗体减轻疾病的严重程度。

本申请中使用的定义如下：

“Fc片段”或“Fc区”是指全长免疫球蛋白(抗体)的恒定区，不包括免疫球蛋白的第一恒定区结构域(即CH1-CL)。因此，Fc片段是指同型二聚体，每个单体包含IgG的最后两个恒定结构域(即CH2和CH3)以及这些结构域的N端柔性铰链区。根据本发明的抗体的Fc片段优选是人Fc片段，并且可以选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc片段。优选地，在本发明中，使用IgG1的Fc片段，其由N末端柔性铰链和CH2-CH3结构域组成，即从氨基酸C226到C末端的部分，其编号根据EU索引或Kabat中的等效项指定。优选地，使用人IgG1的Fc片段(即，根据EU索引或Kabat中的等效项的氨基酸226-447)。在这种情况下，根据EU索引或Kabat中的等效项，下铰链是指第226-230位，CH2结构域是指第231-340位，并且CH3结构域是指第341-447位。根据本发明使用的Fc片段还可以在第226位的上游包含一部分上铰链区。在这种情况下，优选地，使用包含一部分该区的人IgG1的Fc片段。位于第216-226位(根据EU索引)。在这种情况下，人IgG1的Fc片段是指从氨基酸216、217、218、219、220、221、222、223、224或225到C末端的部分。

优选地，根据本发明的抗体的Fc片段是IgG1的Fc片段。

根据本发明的抗体的Fc片段优选是人的。

在本申请中，Fc片段的残基编号是EU索引中的编号或Kabat中的等效编号(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。该编号仅适用于人Fc片段。

鼠(即小鼠或大鼠)Fc片段的该编号的等效项由美国生物化学和分子生物学学会描述于Zauner et al,Molecular&Cellular Proteomics 12.4,2013。特别地，该文章在图2中描述了人和鼠Fc之间糖基化的差异。

“氨基酸突变”在本文中是指多肽的氨基酸序列的变化。特别地，突变选自取代、插入和缺失。

“取代”是指用相同数量的其他氨基酸代替亲本多肽序列中特定位置的一个或多个氨基酸。优选地，取代是精确的，即，它仅涉及单个氨基酸。例如，N434S取代是指亲本多肽的变体，其中根据EU索引或Kabat中的等效项的Fc片段第434位的天冬酰胺被丝氨酸代替。

“插入”是指在亲本多肽序列的特定位置添加至少一个氨基酸。例如，插入G>235-236表示将甘氨酸插入第235位和第236位之间。

“缺失”是指在亲本多肽序列的特定位置去除至少一个氨基酸。例如，E294del表示去除第294位的谷氨酸。

“亲本多肽”和“亲本抗体”分别是指随后被修饰以产生变体的多肽或未修饰的抗体。所述亲本多肽或抗体可以是天然来源的、天然存在的多肽或抗体的变体、天然多肽或抗体的修饰形式或合成的多肽或抗体。优选地，亲本多肽或抗体包含选自野生型Fc片段、其片段和其突变体的Fc片段。因此，与野生型Fc片段相比，亲本多肽或抗体可以任选地在Fc片段中包括预先存在的氨基酸修饰。因此，优选地，亲本多肽或抗体的Fc片段已经包含至少一个额外的突变(即，预先存在的修饰)，优选地选自P230S、T256N、V259I、N315D、A330V、N361D、A378V、S383N、M428L、N434Y。

优选地，亲本多肽或抗体的Fc片段选自序列SEQ ID NO:1、2、3、4和5。优选地，亲本多肽或抗体的Fc片段具有序列SEQ ID NO:1。

SEQ ID NO:1、2、3、4和5所示序列不含N末端铰链区。

SEQ ID NO:6、7、8、9和10所示序列分别对应于具有其N-末端铰链区的SEQ ID NO:1、2、3、4和5所示序列。同样，在具体实施方案中，亲本多肽或抗体的Fc片段选自序列SEQ IDNO:6、7、8、9和10。

优选地，亲本多肽或抗体的Fc片段具有对应于序列SEQ ID NO:6的第1-232、2-232、3-232、4-232、5-232、6-232、7-232、8-232、9-232、10-232或11-232位的序列。

“变体”是指通过至少一个氨基酸修饰而与亲本多肽的序列不同的多肽序列。

优选地，变体的序列与亲本多肽的序列具有至少80％的同一性，并且更优选地，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同一性。

贯穿本申请，在本发明的含义内，两个氨基酸序列之间的表述“同一性百分比”旨在表示在最佳比对之后获得的待比较的两个序列之间相同氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布并且分布在整个长度上。“最佳比对”或“优化比对”是指如下测定的同一性百分比最高的比对。传统上，两个氨基酸序列之间的序列比较通过将这些序列最佳比对后比较这些序列来进行，所述比较通过片段或“比较窗”进行，以鉴定和比较序列相似性的局部区域。除了手动之外，还可以通过Smith和Waterman(1981,J.Mol Evol.,18:38-46)的局部同源性算法、通过Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法、通过Pearson和Lipman(1988,PNAS,85:2444-2448)的相似性搜索方法、通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLASTN、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)来实现用于比较的序列的最佳比对。

更优选地，根据本发明的抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，优选为IgG1。

根据本发明的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。

术语“嵌合”抗体旨在表示包含衍生自给定物种的抗体的天然可变区(轻链和重链)结合对给定物种而言异源的物种的抗体的轻链和重链的恒定区的抗体。有利地，如果抗体是嵌合的，它包含人恒定区。从非人抗体(特别是鼠)开始，可以使用本领域技术人员众所周知的基因重组技术来制备嵌合抗体。例如，可以通过克隆重链和轻链的重组DNA来生产嵌合抗体，所述重组DNA包含启动子和编码非人抗体可变区的序列，以及编码人抗体恒定区的序列。对于制备嵌合抗体的方法，可以参考例如Verhoeyn等人的文献(Verhoeyn etal.BioEssays,8:74,1988)。

术语“人源化”抗体应理解为表示包含衍生自非人源的抗体的互补决定区(CDR)的抗体，该抗体分子的其他部分源自一种(或多种)人抗体。另外，可以修饰框架区(或“框架”或“FR”)的一些残基以保留结合亲和力(Jones et al.Nature,321:522-525,1986；Verhoeyen et al.1988；Riechmann et al.Nature,332:323-327,1988)。可以通过本领域技术人员已知的技术来制备人源化抗体，例如“CDR接枝”、“重整”、“Human stringcontent”、“FR文库”、“引导选择”、“FR改组”和“人化”，如Almagro等人的综述所总结的(Almagro et al.Frontiers in Bioscience 1 3,1619-1633,January 1,2008)。

“人”抗体是指其整个序列是人源的抗体，也就是说，其编码序列通过编码抗体的人基因的重组产生。事实上，现在可以产生转基因动物(例如小鼠)，一旦免疫，它们能够在不存在内源性产生免疫球蛋白的情况下产生完整的人类抗体库(参见Jakobovits et al,Proc Natl Acad Sci USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al,Nature 362:255-258(1993)；Bruggermann et al,Year in Immuno,7:33(1993)；Duchosal et al.Nature 355:258(1992)；专利US5,591,669；US5,598,369；US5,545,806；US5,545,807；US6,150,584)。人抗体也可以从噬菌体展示文库获得(Hoogenboom et al,J.Mol.Biol,227:381(1991)；Marks et al,J.Mol.Biol,222:581-5597(1991)；Vaughan et al.Nature Biotech 14:309(1996))。

根据本发明的抗体抗自身抗原。“自身抗原”是指一种抗原，尽管是正常组织的组分，其是体液或细胞免疫应答的靶标，如自身免疫疾病的情况一样(参见Miller-Keane百科全书中的定义)。

优选地，根据本发明的抗体抗选自天然髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、葡萄糖-6磷酸酶的催化2亚基(IGRP，由G6PC2基因编码；Uniprot中的Q9NQR9)、2型胶原蛋白和水通道蛋白-4(Uniprot中的P55087)的自身抗原。

这些自身抗原与预防和/或治疗选自以下的自身免疫疾病特别相关：

-涉及抗MOG抗体的脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症；

-Devic视神经脊髓炎(NMO/NMOSD)，通过靶向水通道蛋白-4(AQP-4)和/或MOG；

-1型糖尿病，通过靶向葡萄糖-6磷酸酶(IGRP)的催化2亚基。IGRP特异于胰岛；和

-类风湿性关节炎，通过靶向2型胶原蛋白。

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)是髓鞘和神经元中几种抗原之一，在MS中可检测到免疫反应性。该糖蛋白是分离CNS的轴突的髓鞘的次要成分。

该天然人蛋白质的序列可以在Uniprot中找到，其中登录号为Q16653。成熟的(天然)人蛋白质包含218个氨基酸(即在裂解29个氨基酸的信号肽后)。

同样，可在Uniprot中使用登录号Q61885获得天然小鼠MOG序列。成熟的(天然)小鼠蛋白质含有218个氨基酸(即在裂解28个氨基酸的信号肽后)。天然人和小鼠MOG蛋白具有89％的同一性。

优选地，本发明涉及抗天然MOG的同种型G抗体，包含：

-表现高唾液酸化的Fc片段，和

-能够结合天然MOG的Fab片段。

特别地，如Breithaupt等人在2003年8月5日的PNAS，第100卷第16期中详述的，天然MOG表位由位于MOG膜远侧，特别是序列SEQ ID NO:26的水平残基101-108(R101DHSYQEE108，对应于成熟人MOG的218上的101-108位残基)上的三个环组成；这些残基包含形成推定的配体结合位点的上边缘的环。

优选地，本发明涉及抗天然MOG的同种型G抗体，包含：

-表现高唾液酸化的Fc片段，和

-能够结合天然MOG，特别是序列SEQ ID NO:26的残基101-108的Fab片段。

优选地，根据本发明的抗体抗天然MOG。优选地，其包含鼠抗体8-18C5的6个CDR。优选地，其包括以下6个CDR：

H-CDR1:SEQ ID NO:11,

H-CDR2:SEQ ID NO:12,

H-CDR3:SEQ ID NO:13,

L-CDR1:SEQ ID NO:14,

L-CDR2:GAS,和

L-CDR3:SEQ ID NO:15。

根据具体实施方案，本发明的抗天然MOG的抗体是嵌合的，并且包含SEQ ID NO：16的序列作为VH，并且包含SEQ ID NO：17的序列作为VL。根据具体实施方案，本发明的抗体是嵌合的，并且包含SEQ ID NO：24作为重链，其中在EU索引中的编号或Kabat中的等效编号的第294位缺失谷氨酸，并且包含序列SEQ ID NO：25作为轻链。

本申请还描述了抗天然MOG的鼠抗体；典型地，其包含序列SEQ ID NO：19作为重链，该序列包含第171位的谷氨酸的缺失，以及包含序列SEQ ID NO：20作为轻链。鼠Fc上第171位对应于索引编号EU或Kabat中的等效编号的人Fc上第294位。

有利地，根据本发明的抗天然MOG的抗体的每条轻链的可变区由与鼠序列SEQ IDNO：17具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少99％的同一性的序列编码，并且根据本发明的抗天然MOG的抗体的每条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQID NO：16具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少99％的同一性的序列编码。

本发明的抗体还应理解为是指抗具有8-18C5抗体的CDR(互补决定区)区域结合FR区域(框架，可变区的高度保守区域，也称为“构架”)的天然MOG的任何抗体。这种抗体与鼠8-18C5抗体具有非常可比的，优选相同的亲和力和特异性。

优选地，如上所述，根据本发明的抗天然MOG的抗体包含鼠抗体8-18C5的6个CDR。优选地，其包括以下6个CDR：

H-CDR1:SEQ ID NO:11,

H-CDR2:SEQ ID NO:12,

H-CDR3:SEQ ID NO:13,

L-CDR1:SEQ ID NO:14,

L-CDR2:GAS,和

L-CDR3:SEQ ID NO:15。

有利地，根据本发明的抗天然MOG的抗体的VL区的FR区由与鼠序列SEQ ID NO：17的FR区具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少99％的同一性的序列编码，并且根据本发明的抗天然MOG的抗体的VH区的FR区由与鼠序列SEQ ID NO：16的FR区具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少99％的同一性的序列编码。

有利地，根据本发明的抗天然MOG的抗体包含人Fc区作为Fc区，其优选选自SEQ IDNO:1-10，优选地由SEQ ID NO:1编码的Fc区，并包含EU索引中的编号或Kabat中的等效编号的第294位的谷氨酸缺失。

根据本发明的抗自身抗原，特别是抗天然髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的同种型G抗体可以通过在噬菌体库中选择来获得，特别是如Nixon等人在Drugs derived fromphage display,From candidate identification to practice,mAbs 6:1,73–85；January/February 2014中所述。

本发明还涉及如上所述的同种型G的抗体组合物，其包含表现高唾液酸化的Fc片段。与亲本抗体组合物相比，对Fc的这种高唾液酸化典型地增加或改进。

“增加的唾液酸化”或“改进的唾液酸化”是指基于所述亲本抗体组合物的Fc的唾液酸化，所获得的抗体组合物的Fc的唾液酸化增加至少10％、优选至少15％、优选至少20％、优选至少25％、优选至少30％、优选至少35％、优选至少40％、优选至少45％、优选至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选为至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％。

蛋白质的唾液酸化是众所周知的糖基化机制(特别参见Essentials ofGlycobiology,2nd edition,Varki et al,2009)。它对应于通过共价键在蛋白质的糖基化链中添加至少一种唾液酸(即，N-乙酰神经氨酸及其衍生物，如N-糖基神经氨酸、N-乙酰基糖基神经氨酸)。

优选地，通过Fc片段的突变获得其上的唾液酸化。

因此，优选地，Fc片段，特别是人Fc片段相对于亲本抗体的Fc片段被修饰并且包含选自所述Fc片段的第240-243、258-267和290-305位氨基酸的至少一种氨基酸突变，编号为索引EU中的编号或Kabat中的等效编号。

优选地，突变在位于第240、241、242、243、243、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304或305位的Fc片段的至少一个氨基酸上进行，编号为索引EU中的编号或Kabat中的等效编号。

优选地，所述突变选自V262del、V263F、V263K、V263W、V264K、V264P、D265A、D265E、D265G、D265L、D265S、D265V、V266A、V266P、V266S、V266T、S267N、S267P、S267R、S267W、P291C、P291V、P291Y、P291W、R292A、R292del、R292T、R292V、R292Y、E293del、E293F、E293P、E293W、E293Y、E294del、E294D、E294N、E294W、E294F、E293del/E294del、Q295D、Q295del、Q295F、Q295G、Q295K、Q295N、Q295R、Q295W、Y296A、Y296C、Y296del、Y296E、Y296G、Y296Q、Y296R、Y296V、S298del、S298E、S298F、S298G、S298L、S298M、S298N、S298P、S298R、S298T、S298W、S298Y、Y300D、Y300del、Y300G、Y300N、Y300P、Y300R、Y300S、R301A、R301F、R301G、R301H、R301I、R301K、R301Q、R301V、R301W、R301Y、V302del、V302A、V302F、V302G、V302P、V303A、V303C、V303P、V303L、V303S、V303Y、S304C、S304M、S304Q、S304T、V305F和V305L，编号为索引EU中的编号或Kabat中的等效编号。

更优选地，根据本发明的抗体的Fc片段相对于亲本抗体的Fc片段被修饰并且至少包含E294del突变，编号为索引EU中的编号或Kabat中的等效编号。

优选地，根据本发明的抗体，特别是人抗体的Fc片段相对于亲本抗体的Fc片段被修饰并且由E294del突变组成，编号为索引EU中的编号或Kabat中的等效编号。

根据本发明，当根据本发明的抗体的Fc片段是小鼠Fc时，其相对于亲本抗体，特别是序列SEQ ID NO:18的Fc片段被修饰并且由突变E171del组成。

优选地，根据本发明的抗体，特别是人抗体的Fc片段相对于亲本抗体的Fc片段被修饰并由Y300del突变组成，编号为EU索引中的编号或Kabat中的等效编号。优选地，这种抗体在HEK细胞中产生。

优选地，相对于亲本抗体的效应子活性，根据本发明的抗体表现出至少一种由所述降低的Fc片段介导的效应子活性。

特别地，“由Fc片段介导的效应子活性”是指依赖于抗体的细胞细胞毒性(ADCC或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、补体依赖性细胞毒性(CDC或补体依赖性细胞毒性)、依赖于抗体的细胞吞噬作用(ADCP)、内吞活性或细胞因子的分泌。优选地，在本发明中考虑的由Fc片段介导的效应子活性选自抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子的分泌。

“降低的”效应子活性是指降低或消除的效应子活性。因此，根据本发明的抗体可以表现出由消除的Fc片段介导的至少一种效应子活性。优选地，根据本发明的抗体表现出由Fc区介导的效应子活性，其相对于亲本抗体，降低至少10％、优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

优选地，根据本发明的抗体缺乏由所述Fc片段介导的任何效应子活性。

根据另一方面，根据本发明的抗体对Fc区(FcR)的至少一个受体表现出由Fc片段介导的亲和力，该亲和力相对于亲本抗体的亲和力降低。

特别地，“Fc区的受体”或“FcR”是指C1q和Fcγ受体(FcγR)。“Fcγ受体”或“FcγR”是指称为CD64(FcγRI)、CD32(FcγRII)和CD16(FcγRIII)的IgG受体，特别是五个表达的受体FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb。除作为抑制人免疫细胞活化的受体人FcγRIIb外，均为效应细胞的受体激活剂(Muta T et al.,Nature,1994,368:70-73)。

C1q补体参与CDC活性。

FcgRIIIa(CD16a)受体参与ADCC；它在第158位呈现V/F多态性。

FcgRIIa(CD32a)受体参与血小板活化和吞噬作用；它在第131位显示H/R多态性。

最后，FcgRIIb(CD32b)受体参与细胞活性的抑制。

“降低的”亲和力是指降低或消除的亲和力。相对于包含Fc片段的亲本抗体，亲和力优选降低至少10％、优选降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

优选地，对于选自补体C1q和FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)和FcgRIIb(CD32b)受体的Fc区(FcR)的至少一种受体，根据本发明的抗体表现出由相对于亲本抗体的亲和力降低的所述Fc片段介导的亲和力。优选地，根据本发明的抗体对两个受体C1q和CD16a表现出由所述Fc片段介导的亲和力，该亲和力相对于亲本抗体的亲和力降低。

包含Fc片段的抗体对FcR的亲和力可以通过现有技术中众所周知的方法来评估。例如，本领域技术人员可以使用例如表面等离振子共振(SPR)或

优选地，根据本发明的IgG型抗体抗天然MOG，并且包含：

-以下6个CDR：

H-CDR1:SEQ ID NO:11,

H-CDR2:SEQ ID NO:12,

H-CDR3:SEQ ID NO:13,

L-CDR1:SEQ ID NO:14,

L-CDR2:GAS,和

L-CDR3:SEQ ID NO:15；和

-相对于亲本抗体的修饰的人Fc片段，包含至少一个选自所述Fc片段的第240-243、258-267和290-305位氨基酸的氨基酸突变，编号为EU索引或Kabat中的等效编号；优选由亲本抗体的人Fc片段修饰的人Fc片段，其至少包含E294del突变(或至少Y300del突变)，编号为EU索引中的编号或Kabat中的等效编号。

优选地，根据本发明的IgG型抗体抗天然MOG，并且包含：

-以下6个CDR：

H-CDR1:SEQ ID NO:11,

H-CDR2:SEQ ID NO:12,

H-CDR3:SEQ ID NO:13,

L-CDR1:SEQ ID NO:14,

L-CDR2:GAS,和

L-CDR3:SEQ ID NO:15；和

-由亲本抗体的小鼠Fc片段修饰的小鼠Fc片段，至少包含E171del突变(其对应于人Fc片段上的E294del，其中编号为EU索引中的编号或Kabat中的等效编号)。优选地，小鼠Fc片段具有序列SEQ ID NO:18并且包含E171del突变。

在一个优选实施方案中，如上文所定义的IgG型抗体抗天然MOG，并且包含：

-重链的可变结构域，其包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：序列SEQID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107，和/或

-轻链的可变结构域，其包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：序列SEQID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQID NO:42、SEQ ID NO:44SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108。

在一个优选实施方案中，如上定义的IgG型抗体抗天然MOG，并且包含如下序列的重链可变结构域和轻链可变结构域：

-SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30,

-SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32,

-SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34,

-SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36,

-SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38,

-SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40,

-SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42,

-SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44,

-SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46,

-SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48,

-SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50,

-SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52,

-SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54,

-SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56,

-SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58,

-SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60,

-SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62,

-SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64,

-SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66,

-SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68,

-SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70,

-SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72,

-SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74,

-SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76,

-SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78,

-SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80,

-SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82,

-SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84,

-SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86,

-SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88,

-SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90,

-SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92,

-SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94,

-SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96,

-SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98,

-SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100,

-SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102,

-SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104,

-SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106,或

-SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108.

本申请中描述的序列可以总结如下(作为参考，根据Kabat第294位的Fc的谷氨酸在人序列中用黑体字显示)：

本发明的目的还在于一种获得根据本发明的抗体的方法，包括以下步骤：

i)提供编码IgG重链的核酸序列，所述重链包含(a)在可变域中，结合自身抗原的3个CDR，和(b)在Fc片段中，选自第240-243、258-267和290-305位氨基酸的氨基酸突变，优选至少E294del或Y300del突变，编号为EU索引或Kabat中的等效项；

ii)提供编码IgG轻链的核酸序列，所述轻链在可变域中包含与i)中靶向的相同的自身抗原的3个结合CDR；和

iii)在宿主细胞中表达在i)和ii)中获得的核酸序列，并回收抗体。

编码IgG重链的核酸序列(多核苷酸或核苷酸序列)包含具有突变的Fc片段。可以化学合成编码IgG重链的核酸序列(Young L and Dong Q.,2004,Nucleic Acids Res.,Apr1 5；32(7),Hoover,DM and Lubkowski,J.2002,Nucleic Acids Res.,30,Villalobos A,et al.,2006.BMC Bioinformatics,Jun 6；7:285)。也可以使用合适的引物通过PCR扩增编码IgG重链的核苷酸序列。也可以将编码IgG重链的核苷酸序列克隆到表达载体中。

例如，可以使用核酸序列SEQ ID NO：27(编码重链SEQ ID NO：19)。

这些技术在参考手册中有详细描述：Molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition-Sambrook and Russel eds.(2001)and Current Protocols in MolecularBiology-Ausubel et al.eds(2007)。

然后，修饰i)中提供的编码亲本多肽的核酸序列(多核苷酸)，以获得编码变体的核酸序列。

该步骤是实际的突变步骤。可以通过现有技术已知的任何方法进行，特别是通过定点诱变。

优选地，使用对应于插入的修饰的寡核苷酸通过定点诱变、通过组装PCR技术进行氨基酸取代和缺失(例如，参见Zoller and Smith,1982,Nucl.Acids Res.10):6487-6500；Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:488)。

在步骤ii)中，提供了编码IgG轻链的核酸序列，所述轻链在可变域中包含与i)中靶向的相同的自身抗原的3个结合CDR。

例如，可以使用核酸序列SEQ ID NO：28(编码轻链SEQ ID NO：20)。

最后，在步骤iii)中，在宿主细胞中表达在i)和ii)中获得的核酸序列，并回收由此获得的抗体。

可以将在i)和ii)中获得的核酸序列插入双顺反子载体。

所述细胞宿主可以选自原核或真核系统，例如细菌细胞，但也可以是酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。也可以使用昆虫细胞或植物细胞。

优选的宿主细胞是大鼠品系YB2/0、仓鼠品系CHO，特别是CHO dhfr-和CHO Lec13品系、PER.C6

优选地，当根据本发明的抗体，特别是人抗体的Fc片段相对于亲本抗体的Fc片段被修饰并且由Y300del突变组成时，其在HEK细胞(例如HEK293细胞)中产生。

编码重链和轻链的多核苷酸还可包含优化的密码子，特别是针对其在某些细胞中的表达优化的密码子(步骤iii)。密码子优化的目的是将天然氨基酸替换为在所考虑的细胞类型中携带氨基酸的转移RNA(tRNA)最为常见的密码子。动员经常遇到的tRNA的事实的主要优势在于增加信使RNA(mRNA)的翻译速度，因此增加最终滴度(Carton JM et al,Protein Expr Purif,2007)。密码子优化还影响二级mRNA结构的预测，这可能减慢通过核糖体复合物的读取。密码子优化还影响G/C百分比，该百分比与mRNA的半衰期直接相关，因此也与其翻译潜能相关(Chechetkin,J.of Theoretical Biology 242,2006922-934)。

密码子优化可以通过使用哺乳动物，特别是智人的密码子频率表(密码子使用表)替换天然密码子来完成。算法可在互联网上获得并通过合成基因(DNA2.0,GeneArt,MWG,Genscript)的供应商使用，其允许进行此序列优化。

优选地，编码重链和轻链的多核苷酸包含针对其在HEK细胞，例如HEK293细胞、CHO细胞或YB2/0细胞中的表达而优化的密码子。更优选地，编码重链和轻链的多核苷酸包含针对其在YB2/0细胞中的表达而优化的密码子。

本发明的目的还在于一种组合物，其在生理上可接受的介质中包含根据本发明的单克隆抗体。

单克隆抗体的“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”或“mAb”是指包含具有相同和独特抗原特异性的抗体分子的组合物。存在于组合物中的抗体分子均由相同的重链和轻链序列编码，因此具有相同的蛋白质序列。

本发明的目的还在于根据本发明的抗体，或如上所述的组合物作为药物的用途。

可以将根据本发明的抗体与药学上可接受的赋形剂组合，并且任选地与缓释基质(例如可生物降解的聚合物)组合以形成治疗组合物。

药物组合物可以经口、舌下、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、眼内、脑内、透皮、经肺、局部或直肠施用。然后可以将活性成分以单位施用形式与常规药物载体混合施用。单位施用形式包括口服形式，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒和口服溶液剂或混悬液、舌下和经颊施用形式、气雾剂、皮下植入物、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下、鞘内、鼻内施用形式和直肠施用形式。

优选地，药物组合物包含用于能够被注射的制剂的药学上可接受的载体。特别地，它们可以是等渗的无菌配方、盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)、或冻干组合物，其在适当添加无菌水或生理血清的过程中允许构成注射溶液。

适用于可注射使用的剂型包括无菌水溶液或分散体、包括芝麻油、花生油的油性制剂和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且在必须通过注射器注射的范围内必须是流体。它必须在生产和储存条件下稳定，并且必须被保存以防微生物(例如细菌和真菌)的污染。

根据本发明的分散体可以在甘油、液体聚乙二醇或其混合物或油中制备。在正常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

药学上可接受的载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、这些的合适混合物和/或植物油。可以例如通过使用表面活性剂(例如卵磷脂)来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸或甚至硫柳汞。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的活性物质与上文所列的几种其他成分掺入适当的溶剂中，然后通过过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将无菌活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含基本分散介质和所需的来自上文所列的其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干。在制剂中，将以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效量施用溶液。所述制剂易于以多种剂型施用，例如上述的可注射溶液，但是也可以使用药物释放胶囊等。例如，对于以水溶液肠胃外施用，应适当缓冲溶液，并用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可将一定剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，然后加入1000ml适当的液体中，或在建议的输注位点注射。取决于待治疗受试者的情况，可以对剂量的采取某些变化。

可以将本发明的药物组合物配制成包含每剂量约0.0001-1.0毫克，或约0.001-0.1毫克，或约0.1-1.0毫克，或甚至约10毫克或更多的治疗混合物。也可以施用多次剂量。特定患者的特定治疗有效剂量水平可能取决于多种因素，包括患者的正在治疗的疾病和疾病的严重程度、所用特定化合物的活性、所用特定组合物、年龄、体重、总体健康、性别和饮食、施用时间、施用途径、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间或同时使用的药物。

优选地，本发明涉及根据本发明的抗体在预防和/或治疗自身免疫疾病中的用途。它还涉及包含根据本发明的单克隆抗体的组合物用于预防和/或治疗自身免疫疾病的用途。

优选地，自身免疫疾病选自：

-涉及抗MOG抗体的脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症；

-Devic视神经脊髓炎(NMO/NMOSD)，特别通过靶向水通道蛋白-4(AQP-4)和/或MOG；

-1型糖尿病，特别通过靶向葡萄糖-6磷酸酶(IGRP)的催化2亚基。IGRP特异于胰岛；和

-类风湿性关节炎，尤其通过靶向2型胶原蛋白。

优选地，根据本发明的抗体或组合物用于预防和/或治疗涉及抗MOG抗体的脱髓鞘疾病。

这样的疾病优选选自急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、Devic视神经性脊髓炎(NMO/NMOSD)和多发性硬化症(MS)。

事实上，主要发生在儿童中的40％的急性播散性脑脊髓炎(ADEM)患者对抗MOG抗体呈血清阳性。在Devic视神经脊髓炎(NMO/NMOSD)中，成人抗水通道蛋白-4(AQP-4)血清阴性患者亚组显示高滴度的抗MOG抗体。

附图说明

图1：在具有MOG

在第7天将小鼠注射50μg在YB2/0细胞中产生的8-18C5-Del抗体(“Del”,n＝4)、在HEK细胞中产生的8-18C5-WT(“WT”,n＝4)或等体积的PBS("PBS",n＝4)。A)临床得分，B)Kaplan Meier生存曲线。

图2：浸润用HEK细胞中产生的8-18C5-WT抗体("WT",n＝3)、细胞YB2/0中产生的8-18C5-Del变体("Del")(n＝2)或等体积的PBS("PBS",n＝4)处理的小鼠的CD45

图3：浸润用HEK细胞中产生的8-18C5-WT抗体(“WT”,n＝3)、在YB2/0细胞中产生的8-18C5-Del变体(“Del”)(n＝2)或等体积的PBS("PBS",n＝4)处理的小鼠的活CD4+ Th1.2+T细胞上的CNS的激活的Foxp3+调节性T淋巴细胞的绝对数量的柱状图。数据以平均值+/-SEM绘制。

图4：对不同抗体使用α2.6唾液酸特异性的凝集素(SNA)的蛋白质印迹：在YB2/0细胞中产生的8-18C5-Del抗体(“Del(YB2/0)”)、在YB2/0细胞中产生的抗体8-18C5-WT("WT(YB2/0)")和在HEK细胞中产生的8-18C5-WT抗体("WT(HEK)")。

图5：在具有MOG

在第9天将小鼠注射50μg的抗体8-18C5-Del(“Del”,n＝8)、8-18C5-WT(“YB2”,n＝8)或等体积的PBS("PBS",n＝7)。A)临床得分，B)Kaplan Meier生存曲线。

具体实施方式

为了阐明本发明的各种实施方案，给出以下实施例。

从编码IgG1的重组鼠mAb 8-18C5克隆的DNA载体进行Fc工程化。发明人通过将编码共有恒定结构域的序列与mAb 8-18C5的可变结构域(Fab)结合来产生电子克隆构建体。Fab 8-18C5片段的结晶结构可以登录号1PKQ在PDB(蛋白质数据库)中获得。对于恒定结构域，发明人选择了在线数据库IMGT(免疫遗传学)中列出的鼠IgG1(小家鼠，IGHG1*01)的共有序列。将对应于重链和轻链的序列体外合成，并克隆入单独的pCDNA3载体(例如Geneart)中。然后，将这两个序列亚克隆入单个哺乳动物双顺反子载体中，从而产生鼠mAb 8-18C5(8-18C5-WT)。

然后，发明人创建了与人E294Del缺失同源的缺失(编号为EU索引或Kabat中的等效项)：他们删除了重组8-18C5 mAb的SEQ ID NO：18(恒定区)第171位的谷氨酸，以获得8-18C5-Del变体。

在HEK细胞中产生重组8-18C5鼠抗体8-18C5-WT。

在YB2/0细胞中产生鼠8-18C5重组8-18C5-WT和变体8-18C5-Del抗体，以优化唾液酸化水平(50-90％)。有利地，YB2/0细胞系可获得唾液酸化水平非常高的8-18C5-Del变体。

在YB2/0细胞(或对于8-18C5-WT而言是HEK细胞)中生产后，将8-18C5-WT和8-18C5-Del抗体在蛋白G上纯化，并通过SDS-PAGE和SEC表征，以进行验证其纯度(>97％)和完整性(聚集率<2％)。

然后，将它们通过FcRn和各种FcγR上的ELISA表征：

通过标准ELISA测试测量8-18C5-WT和8-18C5-Del抗体与FcRn的结合。为此，用重组人或鼠FcRn蛋白包被Maxisorp免疫板。用5％PBS-LE饱和板后，将8-18C5-WT或8-18C5-Del抗体溶液以不同浓度(从5ng/mL到0.5μg/mL)添加到每个孔中，并在37℃下孵育1h30。然后将山羊抗人(或抗鼠)IgG HRP F(ab')2以1/2500于37℃孵育1小时30分钟。然后，用TMB(Pierce)显示ELISA板，并在450nm处读取吸光度。

室温下在温和搅拌下用山羊抗人IgG HRP的F(ab')2孵育2h后(每个分子的最终浓度为0.5μg/ml)，通过ELISA测量8-18C5-WT和8-18C5-Del抗体与人或鼠FcγR的结合。然后，将聚集在F(ab')2上的IgG在温和搅拌下在预先包被有FcγR并用4％PBS-BSA饱和的Maxisorp或NiNTA免疫板上于30℃下孵育1h。然后，用TMB(Pierce)显示ELISA板，并在450nm处读取吸光度。

8-18C5-WT和8-18C5-Del抗体的ELISA表征证实，在Fc结构域中引入点缺失不影响抗原的识别(使用重组MOG蛋白，rMOG)。如下表1所示，令人惊讶地，与FcRn的结合不受影响，而与FcγRIII和FcγRIIB的结合减少：

由于鼠IgG1同种型不结合FcγRIA(CD64)和FcγRIV，这表明8-18C5-Del变体不再结合任何鼠I型Fc受体(FcR)。另外，通过使用α2.6唾液酸特异性的凝集素(SNA)的Western印迹证实了由引入“Del”突变引起的唾液酸化的增加(图4)。为此，在SDS-PAGE电泳步骤之后，将抗体转移到硝酸纤维素膜上，然后进行Western Blot SNA：条件如下：

饱和：TBS+BSA 1％+Tween-20 0.05％，在4℃过夜，

洗液：Phy Water+Tween-20 0.05％，5x 5分钟，第一次孵育：以1/1000

第二次孵育：以1/2000

化学发光检测

完整的血脑屏障阻止抗体渗入CNS的实质。因此，在CNS中诱导轻度自身免疫炎症以“装填(prime)”组织是必不可少的。这允许抗体进入实质并行使其免疫功能。

选择的实验模型是实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)，一种严重的中枢神经系统自身免疫炎性疾病。自1933年对其进行描述以来，它已成为过敏症的原型模型(尤其是IV型)和多发性硬化症(MS)的临床前模型，其中大多数当前市售的疾病改善治疗均已得到验证。最常见的形式是活性EAE，其中通过用C57Bl/6小鼠中MOG蛋白的线性35-55肽免疫诱导脱髓鞘疾病(Ramadan A,Lucca LE,Carrie N,Desbois S,Axisa PP,Hayder M,Bauer J,LiblauRS,Mars LT.In situ expansion of T cells that recognize distinct self-antigenssustains autoimmunity in the CNS.Brain(2016)139:1433-1446)。MAb 8-18C5对MOG的构象表位而言具特异性(Breithaupt C,Schafer B,Pellkofer H,Huber R,Linington C,Jacob U.Demyelinating myelin oligodendrocyte glycoprotein-specificautoantibody response is focused on one dominant conformational epitoperegion in rodents.J Immunol(2008)181:1255-1263)：

MAb 8-18C5不识别用于免疫的线性MOG35-55肽，并且仅与CNS中存在的完整天然MOG蛋白相互作用。因此，mAb 8-18C5诱导的免疫介导作用是在炎症性病变内局部结合天然MOG的结果。

在先导实验中测定8-18C5-WT(在HEK中产生)和8-18C5-Del抗体对实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)麻痹性疾病的影响，其结果如图1和5所示。

测试1：

通过在包含600μg灭活的结核分枝杆菌H37RA的CFA(完全弗氏佐剂)中用50μgMOG35-55免疫的C57Bl/6小鼠中进行EAE诱导，然后在第0天(200ng)和第2天(400ng)注射2次百日咳毒素。

免疫后7天，将每种抗体以50μg/小鼠的单次剂量注射。2.5mg/kg剂量的8-18C5抗体故意低于治疗相同疾病的IVIg剂量(总共4g/kg：4x 1g/kg)。

结果如下：

与注射PBS的对照小鼠相比，用8-18C5-WT(WT)抗体处理的小鼠表现出更差的EAE，这导致所有这些小鼠在注射后5-6天死亡(图1B)。

8-18C5-Del变体提供了相反的结果：该变体不仅丧失了其固有的致病性(在这种情况下，疾病的严重程度与用PBS处理的小鼠相似)，而且降低了疾病的严重程度。与PBS的4只小鼠中的2只相比，用8-18C5-Del变体处理的小鼠均未死亡(图1B)，EAE的严重程度停滞在临床得分为2，这反映了澄清的延迟。从未达到最严重的瘫痪阶段(>3)(图1A)。

测试2：

通过在包含100μg灭活的结核分枝杆菌H37RA的CFA(完全弗氏佐剂)中用100μgMOG35-55免疫的C57Bl/6小鼠中进行适度EAE诱导，然后在第0天(200ng)和第2天(200ng)注射2次百日咳毒素。

在第9天，第11天EAE诱导的前两天，将每种抗体(在YB2/0(YB2)细胞中产生的鼠8-18C5、携带E171(Del)缺失(对应于人Del294缺失)的变体)以50μg/小鼠的单剂量注射，将PBS注入对照小鼠中。

结果如下：

与注射PBS的对照小鼠相比，用8-18C5-WT抗体(YB2)处理的小鼠表现出更差的EAE，这导致免疫后约15天38％的小鼠死亡(图5B和表2)。

8-18C5-Del(Del)变体丧失了其固有的致病性(在这种情况下，疾病的严重程度与用PBS处理的小鼠相似)，并且降低了疾病的严重程度。EAE的严重程度停滞在2分，并且从未达到最严重的瘫痪阶段(图5A)。

最后，8-18C5-Del(Del)变体允许所有小鼠的完全临床恢复，而PBS处理允许57％的小鼠临床恢复，并且8-18C5抗体的处理仅允许38％的动物的临床恢复(表2)。

结论：

-8-18C5-Del变体以单剂量改进EAE，其比IVIG弱400倍，并且比重组唾液酸化变体F241A弱40倍(描述于Fiebiger BM,Maamary J,Pincetic A,Ravetch JV.Protection inantibody-and T cell-mediated autoimmune diseases by antiinflammatory IgG Fcsrequires type II FcRs.Proc Natl Acad Sci USA(2015)112:E2385-E2394)。这些参数之间的关键差异是8-18C5抗体识别与疾病相关的自身抗原。

-注射时间，即就在疾病发作之前，强烈表明8-18C5-Del变体对正在进行的病理机制有作用。另外，这种作用很可能在发炎的组织中局部发生，因为8-18C5抗体仅识别天然的MOG蛋白，其仅在中枢神经系统中表达。

通过低剂量自身抗原诱导的机制恢复免疫耐受性经常导致FoxP3+调节性T细胞的积聚。为了确定8-18C5-Del变体是否可以促进FoxP3+调节性T细胞的富集，发明人进行了实验，期间他们评估了实施例2中处理的小鼠脑中FoxP3+调节性T细胞应答的幅度。

免疫后第16天，发明人使用Percoll梯度分离了浸润脑的单核细胞，并通过流式细胞术分析了免疫浸润物的细胞组成。

如图2所示，与PBS对照组相比，在浸润巨噬细胞的比例和总数较低的情况下，用8-18C5-Del变体处理的小鼠的炎症活性降低。

与巨噬细胞减少相伴的是，与用PBS处理的EAE小鼠相比，用8-18C5-Del变体处理的小鼠的CNS浸润显示活化的Foxp3+调节性T细胞的比例和绝对数量的显著增加(图3)。

这些研究与8-18C5-Del变体通过驱动对靶MOG抗原具有特异性的调节性T淋巴细胞的扩增来重新训练免疫系统的情况一致。该机制可能要求MOG自身抗原由致耐受性抗原呈递细胞(APC)呈递，该细胞优先激活调节性T细胞，从而损害效应T细胞的致病性反应。

这将根据本发明的8-18C5-Del变体鉴定为用于将自身抗原选择性转移至表达II型Fc受体的致耐受性APC的独特载体。

在选择步骤中，使用标准程序(Smith GP,Science 228:1315(1985))将人scFv文库(MG-UmAb)表达在噬菌体M13的表面上。在30℃下将含有待表达并克隆到载体pMG72中的文库的大肠杆菌XL1-Blue细菌在60ml的添加有100μg/ml的氨苄西林、15μg/ml的四环素和1％(p/v)葡萄糖的2YT培养基中培养。然后，在37℃下用辅助噬菌体M13(M13K07，Biolabs，细菌/噬菌体比＝1/3)感染细胞20分钟，并在26℃下以230rpm 2YT/氨苄青霉素/葡萄糖以及0.5mM IPTG和50μg卡那霉素/ml继续过夜生产噬菌体-scFv。第二天，使用标准方案将噬菌体用PEG6000沉淀，重悬于1ml pH 7.4的PBS缓冲液中，并滴定感染XL1-Blue细胞。

对于固相选择，将在PBS/4％脱脂乳/0.1％Tween 20中稀释的噬菌体-scFv在Maxisorp板的8孔中孵育(1-2x10

对于液相选择，首先将4x10

为确保选择特异性scFv，在不同条件下(4-6固相和/或4-6液相)进行几轮选择。为了选择最密切相关的scFv，逐渐降低靶标浓度(重组人MOG蛋白)。还对同源鼠和食蟹猕猴MOG重组蛋白进行几轮选择，以获得也能识别这些蛋白的scFv(第二轮或第三轮选择的相似筛选条件)。最后，为了获得靶向与参照抗体818-C5类似的表位的scFv，该抗体在高级选择步骤(自第四轮选择起)用作直接竞争者。

使用重组MOG蛋白(R&D system)使用ELISA测定来确定在筛选期间分离的噬菌体表面上表达的scFv的结合特性。与所选克隆一起，噬菌体-scFv-8-18C5被表达作为ELISA的阳性对照。简而言之，将噬菌体-scFv以在800μl感染有辅助噬菌体M13K07的2YT/氨苄青霉素/葡萄糖培养物中(如前所述)的96孔板上分离的克隆形式生产。然后，以3000g离心30分钟后，将在26℃过夜产生的噬菌体回收到上清液中。将这些上清液直接在PBS/4％BSA/0.1％Tween 20中稀释1/2，然后在Maxisorp免疫板上测试，所述免疫板预先包被有0.5μg人或鼠MOG或PBS(BSA中的背景对照(bdf))/孔，并用PBS中4％BSA封闭。在37℃下孵育2小时后，将孔用PBS/0.1％Tween-20洗涤3次，并用抗M13 HRP抗体(GE Healthcare)检测结合的噬菌体-scfv。在酶标仪(TECAN)上以450nm(OD)读取该板。结果表示为比率：靶标上的OD/ODbdf(用BSA饱和的未包被板上的OD)，并将该比率与阳性对照所获得的比率进行比较。

上述产生的克隆的比率高于8-18C5阳性对照的比率；因此它们更好地结合MOG蛋白。

此外，还可以进行以下实验：

免疫后第16天，发明人使用Percoll梯度分离了浸润脑的单核细胞，并通过流式细胞术分析了免疫浸润物的细胞组成。可以测定调节性(Foxp3+)和致病性(Th1/Th17)T淋巴细胞的反应幅度以正式表明在用8-18C5-Del处理的小鼠中，致病性反应的收缩与扩张性调节性T细胞反应是否相关。

使用抗原加强实验，MHC四聚体和T细胞表达对MOG35-55具有特异性的转基因TCR，可以建立调节性T细胞和致病性T细胞反应的特异性。目的是建立MOG自身抗原在介导单克隆抗体8-18C5的治疗作用中的中心作用。

在疾病改进过程中，可以想象m8-18C5-Del变体(不与I型受体结合)将结合II型FcR，其尤其包括C型凝集素的CD209受体(SIGN-R1)和CD23。为了鉴定8-18C5-Del抗体的靶细胞，可以有利地开发2种方法：

-用不同的荧光染料标记8-18C5-Del和8-18C5-WT，并通过流式细胞仪分析与任一抗体或两种抗体结合的浸润脑的免疫细胞。

-使用流式细胞仪方法建立I型或II型Fc受体在浸润脑的免疫细胞上的分布。

特别注意DC-SIGN+巨噬细胞/免疫调节性小胶质细胞和抗炎M2巨噬细胞/小胶质细胞Arg-1+CD45+CD11B+F4/80+CD68+。骨髓来源的抑制细胞和浆细胞样DC是较差的候选者，因为据报道它们会加剧EAE。

与上述策略类似，这些方法在免疫后第16天通过使用Percoll梯度分离浸润到脑的单核细胞来进行。

CNS分离后，将致耐受性亚群与转基因TCR T细胞共培养，以证明MOG抗原的呈递导致调节性T细胞的扩增。其次，在体内使用中和抗体方法来延迟所涉及细胞的诱导或功能。