基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂、以及细胞制剂的制造方法

摘要

一种离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，通过对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂以及细胞制剂的制造方法。

本申请要求基于2018年3月29日在日本申请的特愿2018-66174号要求优先权，其内容援引入本文。

背景技术

在想要向真核细胞的基因组的特定位点插入特定基因而将目标基因组DNA完全替换为期望的碱基序列的情况下，一般利用同源重组。具体地，实施在想要插入的外源DNA的两端(5’末端以及3’末端)使用具备具有与基因组上的进行插入的位点同源的序列的DNA(以下，称为同源臂。)的基因导入用载体(以下，称为靶向载体。)的操作。如果将涉及的载体导入靶细胞，则在基因组DNA与载体之间会发生同源重组，能够替换目标基因组DNA的期望的碱基序列。该替换的特点是无错误。

但是，在来源于哺乳类的细胞中，由于这种同源重组发生的频率极低，为百万分之一，因此，同源重组的实用化，特别是在医疗应用方面的实用化是非常困难的。

近年来，基因组编辑核酸酶的发现使得在基因组上的任意位置处切割DNA双链成为可能。其结果为，在基因组DNA与导入外源基因之间诱导同源重组变得容易(例如，参照专利文献1、非专利文献1至2)。

在专利文献1中，公开了一种利用Cas9蛋白切割1细胞期胚胎的细胞的基因组，使用具备分别与目标序列的5’末端以及3’末端杂交的同源臂和与该同源臂相邻的核酸插入物(导入外源基因)的靶向载体，将所述核酸插入物导入所述细胞中的方法。

在非专利文献1中公开了针对来源于β-地中海贫血患者的造血干细胞，利用组合了Cas9蛋白和腺病毒相关载体的CRISPR/Cas9系统，通过同源重组导入正常HBB(haemoglobin beta：血红蛋白β)基因。

但是，在近年来的技术中，非同源重组的发生频率比同源重组的发生频率高，同源重组的发生频率即使在最高的情况下也只有十分之一左右。因此，为了实现同源重组的实用化，需要进一步提高同源重组频率。

作为提高同源重组的频率的尝试，例如有人提出了非专利文献3至4中举出的方法。

在非专利文献2中，探索了在通过使用了CRISPR/Cas9系统的同源重组而进行的基因导入中，抑制非同源末端结合或者促进同源重组的低分子量化合物。公开了使用Scr7、L755507以及白藜芦醇作为这种低分子量化合物，促进了猪胎儿成纤维细胞中的同源重组。

非专利文献3中公开了一种通过RNA干扰抑制KU70、DNA连接酶IV等的表达而降低非同源重组的频率，从而相对地提高同源重组的频率的方法。

在非专利文献4中公开了一种通过在使用了CRISPR/Cas9系统的基因组编辑中，针对在Cas9从双链DNA解离之前非对称地释放的、与sgRNA不互补的切割DNA的3’末端提供互补的单链DNA，从而提高同源重组的频率的方法。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/081923号。

非专利文献

非专利文献1：Nature.2016Nov 17；539(7629)：384-389.CRISPR/Cas9 β-globingene targeting in human haematopoietic stem cells.Dever D.et al.

非专利文献2：Sci Rep.2017；7：8943.Small molecules enhance CRISPR/Cas9-mediated homology-directed genome editing in primary cells Guoling Li,et al.

非专利文献3：Nat Biotechnol.2015May；33(5)：543-548.Increasing theefficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise geneediting in mammalian cells.ChuVT.,et al.

非专利文献4：Nat Biotechnol.2016；34：339-344,Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9using asymmetric donor DNA.Richerdson C,et al.

发明内容

发明要解决的问题

然而，即使利用非专利文献3至4中的方法，同源重组的频率仍然较低，还存在改善的余地。

关于针对DNA双链切割的DNA修复机制，已知非同源末端结合和同源重组。非同源末端结合比同源重组以更短时间进行。因此，为了提高同源重组的频率，需要想办法相对地降低非同源末端结合的发生频率。但是，如果抑制非同源末端结合的结构本身，则会大大地损害针对DNA的双链切割的细胞的修复能力，因而，对生物体的危害(无法生存、肿瘤化)变得过大。其结果为，在该方向性上的实用化以及临床应用很困难。

本发明的目的在于提供一种能够在不损害细胞本来具有的非同源末端结合的能力的情况下提升同源重组的频率的基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂以及细胞制剂的制造方法。

用于解决课题的技术手段

发明人们发现如果在外源DNA的5’末端和3’末端将通常不用于同源重组的较短的同源臂用于靶向载体，则在切割目标基因组DNA的双链时，相对于非同源重组的同源重组的频率显著更高，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将在5’末端和3’末端具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。

(2)根据(1)所述的基因组编辑方法，其中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将外源DNA导入所述目标基因组。

(3)根据(1)或(2)所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为血细胞或未分化细胞。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为干细胞。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为造血干细胞。

(6)根据(1)所述的基因组编辑方法，其中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的一个末端进行同源重组，对另一个末端进行非同源重组，从而将外源DNA导入所述目标基因组。

(7)一种离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，通过对外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。

(8)根据(7)所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为血细胞或未分化细胞。

(9)根据(7)或(8)所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为干细胞。

(10)根据(7)至(9)中任一项所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为造血干细胞。

(11)一种组合物，其特征在于，含有外源DNA，所述外源DNA在其两端具有小于500bp的长度的同源臂。

(12)根据(11)所述的组合物，其中，还含有目标基因组DNA切割酶或编码所述酶的DNA或mRNA。

(13)根据(11)或(12)所述的组合物，其中，所述组合物是药用的。

(14)根据(11)至(13)中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗严重联合免疫缺陷病。

(15)一种用于治疗严重联合免疫缺陷病的细胞制剂的制造方法，其特征在于，在细胞中，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂且具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

(16)根据(15)所述的细胞制剂的制造方法，其中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将外源DNA导入目标基因组DNA。

(17)根据(15)或(16)所述的细胞制剂的制造方法，其中，所述细胞为血细胞或未分化细胞。

(18)根据(15)至(17)中任一项所述的细胞制剂的制造方法，其中，所述细胞为干细胞。

(19)根据(15)至(18)中任一项所述的细胞制剂的制造方法，其中，所述细胞为造血干细胞。

(20)根据(15)所述的细胞制剂的制造方法，其中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的一个末端进行同源重组，对另一个末端进行非同源重组，从而将外源DNA导入目标基因组DNA。

(21)一种用于治疗严重联合免疫缺陷病的细胞制剂的制造方法，其特征在于，在细胞中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂且具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

(22)根据(21)所述的细胞制剂的制造方法，其中，所述细胞为血细胞或未分化细胞。

(23)根据(21)或(22)所述的细胞制剂的制造方法，其中，所述细胞为干细胞。

(24)根据(21)至(23)中任一项所述的细胞制剂的制造方法，其中，所述细胞为造血干细胞。

(25)一种细胞，其特征在于，在细胞的目标基因组中的外源DNA插入位点的5’末端或3’末端具有来源于外源DNA的片段。

(26)一种细胞制剂，其特征在于，含有(25)所述的细胞。

发明的效果

根据本发明，实现了在不损害细胞本来具有的非同源末端结合的能力的情况下，在目标基因组中比非同源重组高的同源重组频率。

附图说明

图1是通过同源重组修复SCID猪的IL2RG基因突变的示意图。通过具备较短同源臂的靶向载体仅检测出了同源重组。

图2是通过基因组PCR确认了来源于SCID猪的造血干细胞的IL2RG基因突变仅通过同源重组得以修复的电泳结果。

图3是通过基因组PCR确认了以下情况的电泳结果：在自体移植了通过本发明的基因组编辑方法进行基因组修复后的造血干细胞的SCID猪中，该造血干细胞植入，仅检测出了通过同源重组进行基因组修复后的血液细胞。

图4是通过仅在外源DNA的一个末端发生同源重组而修复SCID猪的IL2RG基因突变的示意图。通过非同源重组外源DNA的5’末端、同源重组修复3’末端而修复。在该情况下，在该目标基因组中的外源DNA插入位点5’末端残留来源于外源DNA的片段。

图5是通过基因组PCR确认了来源于SCID猪的骨髓基质细胞的IL2RG基因突变的5’末端通过同源重组得以修复，3’末端通过非同源重组得以修复的电泳结果。

图6是通过基因组PCR确认了GFP基因仅通过同源重组插入了小鼠造血干细胞基因组的Rosa26区域的电泳结果。

图7A是显微注射了本发明的基因组编辑工具的小鼠受精卵的荧光图像。在检测出GFP的受精卵中，GFP基因的至少5’末端通过同源重组插入于β-Actin(Actb)基因座。

图7B是通过基因组PCR确认了GFP基因的5’末端通过同源重组，3’末端通过非同源重组插入于小鼠受精卵的Actb基因座的电泳结果。

图8是通过基因组PCR确认了GFP基因仅通过同源重组插入于人T细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)的hypoxanthine phosphoribosyltransferase(HPRT)基因座的电泳结果。

图9A是通过基因组PCR确认了GFP基因仅通过同源重组插入于人胎儿肾细胞株(HEK293T细胞)的Lamin B1(LMNB1)基因座的电泳结果。

图9B是在HEK293T细胞的LMNB1基因座插入了GFP基因的HEK293T细胞的荧光图像。通过同源重组，LMNB1和GFP的融合蛋白进行表达，其局部存在于核膜。由于在全部的GFP阳性细胞中GFP局部存在于核膜，可以得知GFP基因是仅通过同源重组插入LMNB1基因座的。

图9C是通过流式细胞术确认了GFP基因插入到HEK293T细胞中的LMNB1基因座的插入效率的结果。

图10是通过基因组PCR确认了GFP基因仅通过同源重组插入于人源性骨髓基质细胞的HPRT基因座的电泳结果。

图11是通过基因组PCR确认了GFP基因仅通过同源重组插入于人iPS细胞的HPRT基因座的电泳结果。

图12是通过基因组PCR确认了即使在使用了ZFN以及TALEN的情况下，在小鼠造血干细胞中也发生仅由同源重组进行的基因插入的电泳结果。

具体实施方式

[基因组编辑方法]

本发明的基因组编辑方法是通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组的方法。

<第一实施方式>

在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，该方法是细胞中的基因组编辑方法，通过在切割目标基因组DNA的双链时外源DNA的5’末端和3’末端中的同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

在本实施方式中，首先，在目标基因组DNA上的想要导入外源DNA的位置处，切割涉及的目标基因组DNA的双链。作为用于切割目标基因组DNA的双链的系统，没有特别限定，可举出CRISPR-Cas9系统、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)系统、以及锌指核酸酶系统等。作为这些系统的导入到细胞的方法，没有特别限定，可以将目标基因组DNA切割酶本身导入到细胞，也可以将目标基因组DNA切割酶表达载体导入到细胞。用于切割目标基因组DNA的双链的系统与外源DNA同时或者在外源DNA之前或之后导入到细胞。

例如，在CRISPR-Cas9系统中，可举出将Cas9表达载体和在想要切割的位置处编码诱导Cas9的向导RNA的表达载体导入到细胞的方法、将经表达纯化的重组Cas9蛋白和向导RNA导入到细胞的方法等。向导RNA可以分为tracrRNA和crRNA两个，也可以是连接为一条的sgRNA。

在本实施方式中，用于切割目标基因组DNA的双链的系统优选为CRISPR-Cas9系统。

在本实施方式中，作为将外源基因、核酸以及蛋白质导入到细胞的方式，没有特别限定，可以是使用病毒载体的方法、或非病毒导入法、或其他公知方法中的任一种。作为使用病毒载体的方法，例如，可举出：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体、辛德毕斯病毒载体等。作为非病毒导入法，例如，可举出：磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法、显微注射法、晶须法、等离子体法、激光注射法、基因枪法以及农杆菌法等。

在本实施方式中，作为本发明的基因组编辑方法的对象的细胞没有特别限定。优选为离体细胞，可举出动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母以及霉菌等的真菌、以及大肠杆菌等的细菌等。

作为动物细胞的例子，可举出动物来源的干细胞、生殖细胞、生殖系列细胞、株化细胞、原代培养细胞、以及从干细胞诱导的细胞或从原代培养细胞制备的细胞。所述干细胞可以是被株化了的细胞，也可以是原代培养细胞。

本发明的基因组编辑方法不一定限于离体细胞。动物个体本身或者个体内的体细胞、干细胞也可以作为对象。

作为动物来源的细胞，优选为干细胞。动物来源的干细胞具有如下特征：(i)具有自我复制能力，(ii)具有多向分化能力。

动物的干细胞根据其分化能力的不同，可分为：多能性(pluripotent)干细胞、多能性(multipotent)干细胞、少能性(oligopotent)干细胞、以及单能性(unipotent)干细胞。

作为动物干细胞的例子，可举出：ES细胞以及EG细胞等的胚胎干细胞、诱导多能性(induced pluripotent)干细胞(iPS细胞)等的ES样干细胞、胎生干细胞、多系分化持续应激细胞、胎盘干细胞、造血干细胞、间充质干细胞(牙髓来源间充质干细胞、脂肪来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞以及滑膜来源间充质干细胞等)、毛囊干细胞、乳腺干细胞、神经干细胞、卫星细胞以及肠上皮干细胞等的成体干细胞、以及GS细胞等的生殖系干细胞。

动物干细胞可以是对干细胞进行了基因修饰的细胞。作为这样的细胞，例如，可举出通过改组人白细胞抗原(HLA)而抑制了免疫排斥反应的多能性干细胞等。

作为动物细胞，优选为造血干细胞。

作为生殖细胞、生殖系列细胞的例子，可举出卵子、卵母细胞、卵原细胞、精子、精母细胞、精原细胞、精子干细胞(精原干细胞)、原始生殖细胞等。可以是卵子与精子受精之后得到的受精卵。此外，可以是受精卵分裂之后的2细胞至8细胞胚胎，也可以是着床之前的桑椹胚至囊胚(胚盤胞)。

动物的株化细胞没有特别限定。作为动物的株化细胞的例子，可举出：中国仓鼠卵巢组织来源的细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾来源的株化细胞(Vero细胞)、人肝癌来源的细胞(HepG2细胞)、犬肾小管上皮细胞来源的细胞株(MDCK细胞)、人胎儿肾细胞株(HEK293细胞)以及人肝癌组织来源的永生化细胞株(huGK-14)等。

动物的原代培养细胞没有特别限定，可以是正常组织来源或疾病组织来源的任一种。作为动物的原代培养细胞的例子，可举出毛乳头细胞、内皮细胞、上皮细胞、表皮角化细胞、黑色素细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、骨骼肌成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肝细胞、神经细胞、以及控制性T细胞、杀伤性T细胞和γδT细胞等的免疫细胞等。

从动物干细胞诱导的细胞可以是干细胞，也可以是已分化的细胞。作为从动物干细胞诱导的细胞的例子，可举出：iPS细胞来源的视网膜色素上皮细胞、iPS细胞来源的神经细胞、iPS细胞来源的杀伤性T细胞等的iPS细胞来源的免疫类细胞、iPS细胞来源的心肌祖细胞以及iPS细胞来源的肝细胞等。

从动物的原代培养细胞制备的细胞没有特别限定。典型地，从动物的原代培养细胞制备的细胞是对动物的原代培养细胞进行了基因修饰的细胞。作为从动物的原代培养细胞制备的细胞的例子，可举出CAR(chimeric antigen receptor，嵌合抗原受体)-T细胞等。

如后面实施例中所述，本发明人发现，同源重组发生的容易程度不依赖于动物种类、目标基因座、导入基因、切割目标基因组的核酸酶的种类。

在本实施方式中，优选为血细胞或未分化细胞。作为未分化细胞，更优选为干细胞，特别优选为造血干细胞。

植物细胞没有特别限定。作为植物细胞的例子，可举出来源于植物的分裂组织或种子的细胞以及愈伤组织等。愈伤组织可以是从植物组织片诱导得到的组织、损伤诱导性组织、细菌诱导性组织、种间杂交中形成的组织、以及培养细胞这多种中的任一种。典型地，来源于植物的分裂组织或种子的细胞以及愈伤组织具有表达PLT1、PLT5、LBD16、LBD17、LBD18、LBD29、ARR1、ARR21、ESR1、ESR2、WIND1、WIND2、WIND3、WIND4、LEC1、LEC2、AGL15、BBM、RKD1、RKD2、以及WUS等的多能性标记中的至少一种的特征。后面将描述植物细胞中的基因组编辑方法。

接着，在本实施方式中，将在外源DNA的两端具备小于500bp的同源臂的靶向载体导入细胞。同源臂是指在欲插入的外源DNA的5’末端以及3’末端设置的、具有与进行基因组上的插入的位点同源的序列的DNA。

同源臂的长度的上限值为小于500bp，优选为300bp以下，更优选为100bp以下，特别优选为50bp以下，可以为10bp以下。被导入的同源臂有助于5’末端以及3’末端这两个末端的同源重组。

同源臂的长度的下限值优选为5bp以上，更优选为10bp以上。

同源臂的长度优选为5至499bp，更优选为5至300bp，进一步优选为5至100bp，特别优选为5至50bp，最优选为10至50bp。

外源DNA的长度只要是能够插入到基因组上的长度即可，没有特别限定。作为所述外源DNA的长度，例如，可举出50bp至10kbp、100至5kbp、100至1kbp以及100至500bp等。作为外源DNA的例子，可举出目标序列的野生型DNA、密码子优化序列DNA、带标签的外源DNA、启动子序列、转录终止序列、功能基因序列、荧光蛋白标记基因序列、药物选择基因序列、多克隆位点序列、以及这些的组合等。

在本实施方式中，使用的靶向载体的种类没有特别限定，可以使用质粒载体、病毒载体等现有公知的载体。

作为病毒载体，可举出逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体、辛德毕斯病毒载体等。

作为靶向载体的例子，可举出利用了CRISR/Cas9系统的用于编辑基因组的各种载体，例如，可举出利用了HITI(homology-independent targeted integration：不依赖同源性的靶向整合)系统的靶向载体。

通常，从提高同源区域的比例的观点出发，可认为用于同源重组的基因靶向载体中的同源臂的长度较长的能高效率地进行同源重组。但是，本发明人们发现获得了完全意料之外的结果，即：在切割目标基因组DNA的双链时，在5’末端以及3’末端这两个末端具备较短的同源臂的外源DNA以比非同源重组显著更高的频率发生同源重组。

根据本实施方式的基因组编辑方法，能够在外源DNA的5’末端以及3’末端这两个末端实现相对于非同源重组的极高的频率的同源重组。具体地，在本发明的方法中，通过使用使用了小于500bp的较短的同源臂的靶向载体，能够在维持细胞对于DNA的双链切割的修复能力的情况下，实现比非同源重组显著更高的同源重组的频率，并且不会抑制细胞本来具有的非同源末端结合的结构。

因此，本实施方式的基因组编辑方法拓宽了基因组编辑技术在医疗以及产业的应用可能性。本发明能够制备能够用于治疗患有由基因突变引起的疾病的个体的血液细胞。由基因突变引起的疾病没有特别限定，例如，可以是先天性免疫缺陷病(除了实施例的X-SCID之外，还有腺苷脱氨酶[ADA]缺乏症、慢性肉芽肿病、X连锁无γ-球蛋白血症[XLA]、ZAP-70缺陷病、高IgM综合征、IgA缺陷病、IgG亚类缺陷病、Bloom综合征、Wiscott-Aldrich综合征、Ataxia telangiectasia、DiGeorge综合征)、Fanconi贫血、地中海贫血、镰刀形红细胞贫血症、脑白质营养不良、血友病、黏多糖病等的任一种。由于本发明实现了比非同源重组更高的同源重组频率，因此，对于难以通过非同源重组治疗而期待通过同源重组治疗的各种疾病，例如，在巨型基因存在突变的疾病(肌营养不良等)和、基因突变长且大的疾病(亨廷顿氏病等的三联体重复病等)的治疗极其有用。本发明的适用不一定限于由基因突变引起的疾病的治疗。例如，本发明可以广泛用于间充质干细胞和T细胞的功能修饰。例如，间充质干细胞和CAR-T细胞的HLA基因座的修饰等。这些由本发明制成的基因组修饰细胞可以用于治疗各种癌症、白血病、造血功能障碍、骨髓增生异常综合征、心肌梗塞·脑梗塞·闭塞性动脉硬化症等的缺血性疾病、伯格氏病、外周病(末梢疾患)、严重下肢缺血、肺高血压、自身免疫性疾病、狼疮性肾炎、克隆病、角膜疾病、角膜障碍、青光眼、视神经障碍、视网膜色素变性、黄斑变性等。本发明的应用不限于医疗。例如，可举出本发明的动物细胞的基因组编辑方法在生产含有大量高度不饱和脂肪酸且味道优异的食肉牛以及增加了大腹部的比例的金枪鱼等中的应用可能性等。

<第二实施方式>

在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，该方法是细胞中的基因组编辑方法，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的其中一个末端进行同源重组，另一个末端进行非同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入到所述细胞的基因组中。

作为本实施方式的例子，可举出小鼠受精卵和猪骨髓基质细胞等。

作为提高本实施方式的基因组编辑的效率的一种方法，外源DNA中的一个同源臂的长度优选为另一个同源臂的长度的2倍以上，更优选为3倍以上，进一步优选为4倍以上，特别优选为5倍以上。

作为较短同源臂的长度，优选为50bp以下，更优选为30bp以下，特别优选为10bp以下，也可以是0bp。作为较长同源臂的长度，优选为30bp以上，更优选为40bp以上，特别优选为50bp以上。

被导入的较短同源臂有助于非同源重组，较长同源臂有助于同源重组。在本实施方式中，非同源重组是指非同源末端结合。

作为外源DNA的长度，只要是能够插入到基因组上的长度，则没有特别限定，例如可举出100bp至10kbp。

本实施方式的基因组编辑方法中的单侧同源重组的发生机制尚不清楚，如下地进行了推测。较短同源臂与较长同源臂相比更难发生同源重组，基因组DNA的双链被切割的位置与较短同源臂通过非同源重组的机制(非同源末端结合)连接。这样，导入基因的一端与基因组DNA连接，由此，此处成为支点，另一端的较长同源臂位于基因组上的同源序列附近，同源重组变得容易发生。即，可认为外源DNA的一端首先通过非同源重组而连接，之后通过另一端侧的同源重组而将外源DNA整合到基因组中。

<第三实施方式>

在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，该方法是离体细胞中的基因组编辑方法，通过对外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。

在本实施方式中，作为靶向载体，使用即使不对目标基因组DNA进行双链切割也能引起同源重组的载体。作为涉及的靶向载体，可举出包含单链DNA的AAV载体。

除了不对目标基因组DNA进行双链切割这一点以外，与第一实施方式相同。

[组合物]

本发明的组合物含有外源DNA，该外源DNA在其两端具有小于500bp的长度的同源臂。

本发明的组合物可以含有目标基因组DNA切割酶或编码所述酶的DNA或mRNA，也可以不是DNA切割酶，而是在双链DNA的单侧引入切口的切口酶、将双链DNA分离为单链的解旋酶。

在本发明中，作为目标基因组DNA切割酶，可举出Cas9、Transcriptionactivator-like effector nuclease(TALEN)、锌指核酸酶等。此外，作为编码所述酶的DNA或mRNA，可举出编码这些蛋白质的DNA或mRNA。

在使用Cas9作为目标基因组DNA切割酶的情况下，组合物优选含有诱导Cas9的向导RNA。此外，组合物也可以含有编码向导RNA的表达载体。

在本发明中，设置在外源DNA的两端的同源臂的长度小于500bp，优选为300bp以下，与上述[基因组编辑方法]中的相同。

在本发明中，外源DNA与上述[基因组编辑方法]中的外源DNA相同，本发明的组合物可以包括含有外源DNA的靶向载体。靶向载体与上述[基因组编辑方法]中的相同。

在本发明中，上述外源DNA可以包含在一种载体中，也可以包含在多种载体中。载体没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的相同。

本发明的组合物优选是药用的，更优选包含药学上可接受的载体。本实施方式的药用组合物例如以片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液体剂、混悬剂、乳剂等的形式口服给药，或者以注射剂、栓剂、皮肤外用剂等的形式非口服给药。

作为药学上可接受的载体，可以没有特别限制地使用通常用于药物组合物的制剂。更具体地，例如，可举出：明胶、玉米淀粉、黄蓍胶以及阿拉伯橡胶等的粘合剂；淀粉以及结晶纤维素等的赋形剂；海藻酸等的溶胀剂；水、乙醇以及甘油等的注射剂用溶剂；橡胶基胶黏剂以及硅基胶黏剂等的胶黏剂等。药学上可接受的载体单独一种使用或混合两种以上使用。

本发明的组合物可以还包括添加剂。作为添加剂，可举出：硬脂酸钙和硬脂酸镁等的润滑剂；蔗糖、乳糖、糖精和麦芽糖醇等的甜味剂；薄荷以及白珠油(アカモノ油)等的香味剂；苯甲醇以及苯酚等的稳定剂；磷酸盐和乙酸钠等的缓冲剂；安息香酸苄酯和苯甲醇等的溶解助剂；抗氧化剂；防腐剂等。

添加剂可以单独一种使用或混合两种以上使用。

本发明的组合物优选用于治疗严重联合免疫缺陷病。在严重联合免疫缺陷病(SCID)中，频率最高的病型是X-连锁型，由IL-2受体γ基因(IL2RG)的突变引起。

在本发明中，用于治疗X-连锁严重联合免疫缺陷病的组合物中包含的外源DNA优选包含野生型IL-2受体γ基因的至少一部分。此外，在使用Cas9作为目标基因组DNA切割酶的情况下，优选含有与目标基因组上的IL-2受体γ基因杂交的向导RNA或编码向导RNA的表达载体。

通过使用本发明的组合物，能够提供本发明的基因组编辑方法。

[基因治疗方法]

本发明的基因治疗方法是将药物组合物对对象进行给药的方法，所述药物组合物含有：切割具有突变的目标基因组DNA的酶或编码所述酶的DNA或mRNA，以及在两端具备小于500bp的长度的同源臂的、具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA。

在本发明中，突变是由于目标基因组DNA的外显子以及内含子、或目标基因组DNA的表达调节区域中的一部分或全部的缺失、替换、任意序列的插入等产生的。

在本发明中，给药方法没有特别限定，根据患者的症状、体重、年龄、性别等适当确定即可。例如，片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液体剂、混悬剂、乳剂等为口服给药。此外，注射剂为单独地或者与葡萄糖、氨基酸等常规辅料混合而静脉内给药，还可以根据需要，骨髄内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内给药。

在本发明中，药物组合物的给药量根据患者的症状、体重、年龄、性别等而有所不同，不能一概而定。在口服给药的情况下，按照例如每日1μg至10g、例如每日0.01至2000mg的有效成分进行给药即可。此外，在注射剂的情况下，按照例如每日0.1μg至1g、例如每日0.001至200mg的有效成分进行给药即可。

[细胞]

在第二实施方式中，本发明的细胞的特征在于，在其目标基因组中的外源DNA插入基因组的位点的5’末端或3’末端残留有外源DNA来源的片段。根据上述第二实施方式的基因组编辑方法，外源DNA的一端首先通过非同源重组与由切割双链产生的目标基因组DNA的一端连接。因此，本发明的细胞在外源DNA插入基因组的位点的5’末端或3’末端带有外源DNA来源的片段。如图4的结果所示，在目标基因组DNA的5’末端发生了非同源重组的情况下，在外源DNA插入基因组的位点的5’末端具有外源DNA来源的片段。在目标基因组DNA的3’末端发生了非同源重组的情况下，在外源DNA插入基因组的位点的3’末端具有外源DNA来源的片段。

[细胞制剂]

通过利用上述第二实施方式的基因组编辑方法，本发明的细胞制剂例如含有具有突变的目标基因组DNA被编辑为野生型的细胞。此外，如上面[细胞]部分所述，本发明的细胞制剂包含这样的细胞，该细胞中，在其目标基因组上，在外源DNA插入基因组的位点的5’末端或3’末端残留有外源DNA来源的片段。

[细胞制剂的制造方法]

本发明的细胞制剂的制造方法是用于治疗严重联合免疫缺陷病的细胞制剂的制造方法，在细胞中，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂且具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞制剂的制造方法，该制造方法是用于治疗严重联合免疫缺陷病的细胞制剂的制造方法，在细胞中，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂且具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞制剂的制造方法，该制造方法是用于治疗严重联合免疫缺陷病的细胞制剂的制造方法，在细胞中，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的一个末端进行同源重组，对另一个末端进行非同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂且具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞制剂的制造方法，该制造方法是用于治疗严重联合免疫缺陷病的细胞制剂的制造方法，在细胞中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂且具有所述目标基因组DNA的野生型DNA的至少一部分的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

作为细胞制剂的宿主的细胞没有特别限定，可举出与上述[基因组编辑方法]中相同的细胞，也可以是从人体取出的骨髄来源的细胞。

以这种方式，在使进行了基因组编辑的细胞在体外增殖之后，作为细胞制剂，通过静脉注射等向患者给药。

通过使用本发明的细胞制剂的制造方法，在目标基因组中，实现了比非同源重组高的同源重组频率。其结果为，能够高效率地制造细胞制剂。

通过本发明的细胞制剂的制造方法，能够提供这样一种细胞制剂，该细胞制剂通过同源重组，将严重联合免疫缺陷病患者的骨髄来源的细胞中的具有突变的目标基因组DNA无错误地修复成健康的碱基序列，从而根治严重联合免疫缺陷病。

[植物细胞的基因组编辑方法]

在一个实施方式中，提供了一种方法，该方法是植物细胞中的基因组编辑方法，通过在切割目标基因组DNA的双链时，外源DNA的5’末端和3’末端处的同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入所述细胞的基因组中。

在本实施方式中，用于切割目标基因组DNA的双链的系统没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的系统相同。这些系统的导入到细胞中的方法也没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的方法相同。

在本实施方式中，将外源基因导入细胞的方式没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的方式相同。

植物细胞没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的植物细胞相同。作为植物细胞，优选来源于植物的分裂组织或种子的细胞以及愈伤组织等。

同源臂的长度的上限值小于500bp，优选为300bp以下，更优选为100bp以下，特别优选为50bp以下，也可以为10bp以下。同源臂的长度的下限值优选为5bp以上，更优选为10bp以上。同源臂的长度在该上限值与下限值之间的范围内没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的相同。

作为外源DNA的长度，只要是能够插入到基因组上的长度，则没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的相同。

在本实施方式中，使用的靶向载体的种类没有特别限定，与上述[基因组编辑方法]中的相同。

植物细胞中的基因组编辑可以在体外培养系统中进行，也可以在植物体内进行。在体外培养系统中的基因组编辑方法中，对于愈伤组织或组织片，外源基因、核酸以及蛋白的向细胞的导入使用农杆菌法、基因枪法以及晶须法等公知的方法进行。在植物体内的基因组编辑方法中，对于裸露的未成熟胚和成熟胚的茎尖，外源基因、核酸以及蛋白的向细胞的导入使用公知的方法进行。对于小麦、稻谷、玉米或大豆等谷物类，从导入植物体的效率考虑，优选使用基因枪法导入成熟种子胚中的方法。此外，适用于作为谷物类的大麦、土豆，作为蔬菜类的西红柿、油菜，或作为花卉类的康乃馨、玫瑰、香豌豆、菊等。

本实施方式的植物细胞中的基因组编辑方法拓宽了基因组编辑技术在农业领域的应用可能性。具体地，可举出碳水化合物少、不易让人宿醉的酒米的生产等。

[实施例]

以下，通过实验例进一步详细说明本发明，但是本发明不被这些例子限定。

<实验例1>

[供体质粒的构建]

为了修复Watanabe M et al.，PloS One.，2013Oct 9；8(10)：e76478.中记载的SCID模型猪来源的造血干细胞的基因组上的Inter leukin-2receptor gamma基因(以下，也称为IL2RG。)中的从5’控制区域到外显子1中间的突变(85bp以及1bp的缺失、2bp以及1bp的碱基取代)，使用供体质粒(HITI靶向载体)制作了供体质粒。供体质粒的结构如图1所示。供体质粒具有在包含突变位点的155bp的外源DNA添加了以下组合的同源臂的结构：

(a)5’末端为10bp、3’末端为50bp的同源臂

(b)5’末端和3’末端均为50bp的同源臂

(c)5’末端为50bp、3’末端为10bp的同源臂

(d)5’末端和3’末端均为10bp的同源臂。

5’侧的10bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GGCCCAGGTT-3’(序列号1)。

包含5’侧的50bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-CAAAAGGAAATGTGTGGGTGGGGAGGGGTAGTGGGTAAGGGGCCCAGGTT-3’(序列号2)。

外源DNA的碱基序列如下所示。另外，小写字母为SCID猪中缺失的5’控制区域，大写字母为密码子优化的Ex1(外显子1)的碱基序列：

5’-cctgacacagtctacacccaggaaacaaggagtaagcgccATGCTCAAACCCCCCCTCCCCGTCAAGTCTCTCCTCTTCCTCCAGCTCCCTCTGCTCGGCGTCGGCCTCAATCCTAAGGTCCTCACCCACAGCGGCAACGAGGACATCACCGCTG-3’(序列号3)

3’侧的50bp的同源臂的碱基序列如下所示:

5’-GTGGGAAACTGGGACGTTGGGGGTAGGGTTGGTGAGCCGGGGGAGGCTGG-3’(序列号4)。

3’侧的10bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GTGGGAAACT-3’(序列号5)。

添加在同源臂的两端的HITI碱基序列如下所示：

5’-CCTTCGGGTTCAGTCCCACCCCA-3’(序列号6)。

[使用了CRISPR-Cas9的、野生型IL2RG-Ex1基因向IL2RG缺失猪造血干细胞的导入]

将Cas9蛋白、序列号7(5’-UGGGGUGGGACUGAACCCGAGUUUUAGAGCUAUGCU-3’)所示的crRNA、tracrRNA(Alt-R(注册商标)CRISPR-Cas9 tracrRNA、目录号1072534、IntegratedDNA Technologies公司制)、以及上述供体质粒通过电穿孔导入IL2RG缺失猪造血干细胞中。猪造血干细胞使用了猪骨髄中的各种(CD3、CD16、以及CD45RA)分化标记阴性细胞(Lin-)。

[通过基因组PCR进行的插入的确认]

在电穿孔7天后，从细胞纯化基因组DNA，并实施通过PCR进行的外源DNA插入的确认。用于插入确认的引物使用图1所示的A和B的组合、以及C和D的组合。如果发生5’末端的同源重组，则通过使用引物A和B的组合的PCR扩增335bp的DNA。如果发生3’末端的同源重组，则通过使用引物C和D的组合的PCR扩增197bp的DNA。

图2示出了对扩增后的PCR产物进行电泳的结果。如图2所示，仅看到了表示在5’末端以及3’末端发生了同源重组的大小的条带。图2中，NHEJ(Non-homologous end joining，非同源末端连接)表示相当于非同源重组的条带大小，HDR(Homology directed repair，同源定向修复)表示相当于同源重组的条带大小。

[由测序进行的重组方法的确认]

将TA克隆的PCR产物导入到大肠杆菌，进行所形成的各个菌落的测序。

所使用的同源臂的组合如下所示：

(a)5’末端为10bp、3’末端为50bp的同源臂

(b)5’末端和3’末端均为50bp的同源臂

(c)5’末端为50bp、3’末端为10bp的同源臂

(d)5’末端和3’末端均为10bp的同源臂。

确认了在5’末端，在发生了重组的(a)4号克隆、(b)8号克隆、(c)7号克隆、(d)6号克隆中的全部克隆中均发生同源重组，在3’末端，在发生了重组的(a)8号克隆、(b)7号克隆、(c)8号克隆、(d)10号克隆中的全部克隆中均发生同源重组，在5’末端和3’末端均以极高的频率(100％)发生同源重组。此外，确认了通过这样的同源重组修复的突变序列是编码野生型IL2RG的Ex1(外显子1)的序列(无错误的修复)。

[导入了IL2RG-Ex1基因的IL2RG缺失猪造血干细胞往SCID猪的移植以及检测]

将进行了上述基因组修复的IL2RG缺失猪造血干细胞自体移植到同一个体的IL2RG缺失猪中。移植4周之后，取该个体的外周血来源的细胞，通过PCR分析确认了通过同源重组进行了基因组修复的细胞的有无。其结果为，仅检测到了相当于同源重组的条带，而没有检测到相当于非同源重组的条带(图3)。此外，对得到的PCR产物进行序列分析之后，确认了SCID猪的基因突变通过同源重组无错误地被修复成健康碱基序列。这表明该猪的基因异常仅通过靶向载体的同源重组得以修复。

<实验例2>

[供体质粒的构建]

为了修复Watanabe M et al.,PloS One.,2013Oct 9；8(10)：e76478.中记载的SCID模型猪来源的骨髓基质细胞的基因组上的IL2RG，制造了图4所示的供体质粒(靶向载体)。

5’侧的同源臂(10bp)的碱基序列与序列号1相同。

Ex1(外显子1)的碱基序列与序列号3相同。

3’侧的同源臂(50bp)的碱基序列与序列号4相同。

添加在同源臂的两端的HITI碱基序列与序列号6相同。

[使用了CRISPR-Cas9的、野生型IL2RG-Ex1基因向IL2RG缺失猪细胞的插入]

将Cas9蛋白、序列号7所示的crRNA、tracrRNA、以及上述供体质粒通过电穿孔导入。猪来源的骨髓基质细胞使用了通过液体培养猪骨髄单核细胞得到的贴壁细胞。

[通过基因组PCR进行的插入的确认]

从电穿孔3天后的细胞纯化基因组DNA，并实施通过PCR进行的DNA插入的确认。用于插入确认的引物使用了图4所示的A和B的组合、以及C和D的组合。通过使用引物A和B的组合的PCR，如果发生非同源重组，则389bp的DNA被扩增。通过使用引物C和D的组合的PCR，如果发生非同源重组则399bp的DNA被扩增，如果发生同源重组则301bp的DNA被扩增。

图5示出了对PCR产物进行电泳的结果。如图5所示，在5’末端看到了相当于非同源重组的大小的条带，在3’末端看到了相当于同源重组以及非同源重组的大小的条带。图5中，NHEJ表示相当于非同源重组的条带大小，HDR表示相当于同源重组的条带大小。即，猪来源的骨髓基质细胞发生了在外源DNA的5’末端是非同源重组、在3’末端是同源重组的单侧同源重组。这表明在同源臂较短侧的5’末端(10bp)发生了非同源重组，在同源臂较长侧的3’末端(50bp)发生了同源重组。

[通过测序进行的重组方法的确认]

将TA克隆的PCR产物导入到大肠杆菌，进行所形成的各个菌落的测序。确认了在5’末端，在5号克隆中的全部克隆中均发生非同源重组，在3’末端，在7号克隆中以6号克隆的高频率发生同源重组。

<实验例3>

为了将MCS(Multicloning Site)、GFP、blasticidin S deaminase(BSR)基因敲入小鼠造血干细胞基因组的Rosa26区域、β-Actin(Actb)基因座，制备了包含两端10bp的同源臂的供体质粒、包含两端50bp的同源臂的供体质粒、以及包含两端100bp的同源臂的供体质粒。小鼠造血干细胞使用了小鼠骨髄中的各种(CD5、CD45R、CD11b、Gr-1、7-4、以及Ter-119)分化标记阴性细胞(Lin-)。

靶向Rosa26区域的5’侧的10bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-TGCAACTCCA-3’(序列号8)。

靶向Rosa26区域的5’侧的50bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-TGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCA-3’(序列号9)。

靶向Rosa26区域的5’侧的100bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-AATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCA-3’(序列号10)。

靶向Rosa26区域的3’侧的10bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-ACAGGTGTAA-3’(序列号11)。

靶向Rosa26区域的3’侧的50bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-ACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGT-3’(序列号12)。

靶向Rosa26区域的3’侧的100bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-ACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAAGGAAAATGGGAGGATAGGTAGT-3’(序列号13)。

包含GFP基因的外源DNA的碱基序列如下所示：

5’-actagttctagcatctgtagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcgcatgcggatccggtaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAgaattc-3’(序列号14)。

在靶向Rosa26区域的情况下，添加在同源臂的两端的HITI碱基序列如下所示：

5’-CCATCTTCTAGAAAGACTGGAGT-3’(序列号15)。

利用与实验例1以及2相同的方法，将Cas9蛋白、靶向Rosa26区域的序列号16(5’-ACUCCAGUCUUUCUAGAAGAGUUUUAGAGCUAUGCU-3’)表示的crRNA、tracrRNA、以及上述供体质粒通过电穿孔导入小鼠造血干细胞中。

电穿孔3天后，从细胞纯化基因组DNA，实施通过PCR进行的DNA插入的确认。如图6所示，在5’末端以及3’末端仅看到了相当于同源重组的大小的条带。即，GFP基因仅通过同源重组插入到小鼠造血干细胞基因组的Rosa26区域。

<实验例4>

为了将GFP基因敲入小鼠受精卵的Actb基因座，制备了包含两端100bp的同源臂的供体质粒。由于在5’末端的同源臂的外侧(5’末端侧)具备终止密码子，因此在5’末端发生了同源重组的情况下GFP进行表达。

5’侧的100bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GGATCGGTGGCTCCATCCTGGCCTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTACGATGAGTCCGGCCCCTCCATCGTGCACCGCAA-3’(序列号17)。

3’侧的100bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GGACTGTTACTGAGCTGCGTTTTACACCCTTTCTTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGAAAAAAAAAAAATAAGAGACAACATTGGCATGGCTTTGTTTTT-3’(序列号18)。

添加在同源臂的两端的HITI碱基序列如下所示：

5’-AGTCCGCCTAGAAGCACTTGCGG-3’(序列号19)。

包含GFP基因的外源DNA的碱基序列与实验例3相同。

将Cas9蛋白、序列号20(5’-AGUCCGCCUAGAAGCACUUGGUUUUAGAGCUAUGCU-3’)所示的crRNA、tracrRNA、以及上述供体质粒通过显微注射导入小鼠受精卵中。

显微注射6天后，从细胞提取基因组DNA，实施通过PCR进行的DNA插入的确认。如图7A所示，由于通过荧光显微镜观察时细胞呈现绿色荧光，因此确认了在5’末端GFP基因通过同源重组被敲入。此外，如图7B所示，在5’末端看到了相当于同源重组的大小的PCR条带，在3’末端看到了相当于非同源重组的大小的PCR条带。即，通过单侧同源重组被敲入小鼠受精卵中。结果表明，对于单侧同源重组，同源臂的长度在两端不必一定不同。

<实验例5>

为了将GFP基因敲入人T细胞白血病细胞(Jurkat细胞)基因组的HPRT基因座中，制备了包含两端约60bp的同源臂的供体质粒、包含两端约240bp的同源臂的供体质粒。

5’侧的60bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GATGAACCAGGTTATGACCTTGATTTATTTTGCATACCTAATCATTATGCTGAGGATTTG-3’(序列号21)。

5’侧的244bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-CCGGCCTGTTGTTTTCTTACATAATTCATTATCATACCTACAAAGTTAACAGTTACTAATATCATCTTACACCTAAATTTCTCTGATAGACTAAGGTTATTTTTTAACATCTTAATCCAATCAAATGTTTGTATCCTGTAATGCTCTCATTGAAACAGCTATATTTCTTTTTCAGATTAGTGATGATGAACCAGGTTATGACCTTGATTTATTTTGCATACCTAATCATTATGCTGAGGATTTG-3’(序列号22)。

3’侧的61bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GAAAGGGTGTTTATTCCTCATGGACTAATTATGGACAGGTAAGTAAGATCTTAAAATGAGG-3’(序列号23)。

3’侧的239bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GAAAGGGTGTTTATTCCTCATGGACTAATTATGGACAGGTAAGTAAGATCTTAAAATGAGGTTTTTTACTTTTTCTTGTGTTAATTTCAAACATCAGCAGCTGTTCTGAGTACTTGCTATTTGAACATAAACTAGGCCAACTTATTAAATAACTGATGCTTTCTAAAATCTTCTTTATTAAAAATAAAAGAGGAGGGCCTTACTAATTACTTAGTATCAGTTGTGGTATAGTGGGACTC-3’(序列号24)。

包含GFP基因的外源DNA的碱基序列如下所示：

5’-gaattcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTtCAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGcGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAcCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGgTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAggatcc-3’(序列号25)。

添加在同源臂的两端的HITI碱基序列如下所示：

5’-ACCCTTTCCAAATCCTCAGCATAATG-3’(序列号26)。

将共表达Cas9蛋白和带有序列号27(5’-UUAUGCUGAGGAUUUGGAAA-3’)所示的识别序列的sgRNA的质粒(px330-HPRT)、以及上述供体质粒通过电穿孔导入Jurkat细胞中。

在电穿孔3天后，从细胞纯化基因组DNA，实施通过PCR进行的DNA插入的确认。如图8所示，在5’末端以及3’末端看到了相当于同源重组的大小的条带。即，在人T细胞白血病细胞中，确认到通过两侧同源重组进行的敲入。通过下述的测序确认了该敲入是通过无错误的同源重组而实现的。

将TA克隆的PCR产物导入到大肠杆菌，进行所形成的各个菌落的测序。在60bp臂的情况下，确认了在5’末端，在8号克隆中的全部克隆中发生同源重组，在3’末端，在7号克隆中的全部克隆中发生同源重组。在240bp臂的情况下，在5’末端，在6号克隆中的全部克隆中发生同源重组，在3’末端，在8号克隆中的全部克隆中发生同源重组。

<实验例6>

为了将GFP基因敲入人胎儿肾细胞株(HEK293T)基因组的LMNB1基因座，制备了包含两端101bp的同源臂的供体质粒。

5’侧的101bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-CGCCGGTTTGTGCCTTCGGTCCCCGCTTCGCCCCCTGCCGTCCCCTCCTTATCACGGTCCCGCTCGCGGCCTCGCCGCCCCGCTGTCTCCGCCGCCCGCCA-3’(序列号28)。

3’侧的101bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-acCCCCGTGCCGCCGCGGATGGGCAGCCGCGCTGGCGGCCCCACCACGCCGCTGAGCCCCACGCGCCTGTCGCGGCTCCAGGAGAAGGAGGAGCTGCGCGA-3’(序列号29)。

包含GFP基因的外源DNA的碱基序列如下所示：

5’-gatcTGACAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTtCAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGcGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAcCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGgTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCCGGCTCCGgtac-3’(序列号30)。

添加在同源臂的两端的HITI碱基序列如下所示：

5’-GGGGTCGCAGTCGCCATGGCGGG-3’(序列号31)。

添加在同源臂的两端的rcHITI碱基序列(HITI的reverse complement，即，包含PAM序列的向导RNA识别序列在外源DNA两端与基因组为同方向)如下所示：

5’-CCCGCCATGGCGACTGCGACCCC-3’(序列号32)。

将共表达Cas9蛋白和带有序列号33(5’-GGGGUCGCAGUCGCCAUGGC-3’)所示的识别序列的sgRNA的质粒(px330-LMNB1)、以及上述供体质粒通过脂质体转染导入。

如图9A所示，不管是在具备HITI或rcHITI这二者中的哪一个的向导RNA识别序列的情况下，都仅看到了相当于同源重组的条带。

如图9B所示，脂质体转染4天后，通过FACS纯化GFP阳性细胞，再培养一周之后，由于通过荧光显微镜观察时核膜呈现出绿色，因此确认了GFP局部存在于核膜。上述供体质粒被设计为，如果两端发生同源重组则LMNB1基因与GFP基因融合，其产物局部存在于核膜，因此在5’末端以及3’末端发生同源重组这一情况也从荧光图像得到了确认。

此外，如图9C所示，脂质体转染后一周，利用流式细胞术对GFP表达细胞进行定量，确认了如下情况，即，在使用添加了HITI或rcHITI的碱基序列的供体质粒的情况下，以8.9至9.2％发生了同源重组。

<实验例7>

为了将GFP基因敲入人来源的骨髓基质细胞的HPRT基因座中，制备了包含两端10bp的同源臂的供体质粒、包含两端约60bp的同源臂的供体质粒、包含两端约240bp的同源臂的供体质粒。

5’侧的10bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-TGAGGATTTG-3’(序列号34)。

3’侧的10bp的同源臂的碱基序列如下所示：

5’-GAAAGGGTGT-3’(序列号35)。

两端约60bp至约240bp的同源臂的碱基序列、HITI的碱基序列、以及外源DNA的碱基序列与实验例6相同。

将共表达Cas9蛋白和带有序列号27所示的识别序列的sgRNA的质粒(px330-HPRT)、以及上述供体质粒通过脂质体转染导入人来源的骨髓基质细胞中。

脂质体转染3天后，从细胞纯化基因组DNA，实施通过PCR进行的DNA插入的确认。如图10所示，在5’末端以及3’末端，看到了相当于同源重组的大小的条带。即，人来源的骨髓基质细胞中的敲入是两侧同源重组。

<实验例8>

为了将GFP基因敲入人iPS细胞的HPRT基因座，制备了包含两端10bp的同源臂的供体质粒、包含两端约60bp的同源臂的供体质粒、包含两端约240bp的同源臂的供体质粒。

两端10bp至约240bp的同源臂的碱基序列、HITI的碱基序列、以及外源DNA的碱基序列与实验例7相同。

与实验例1相同地，将Cas9蛋白、序列号36(5’-UUAUGCUGAGGAUUUGGAAAGUUUUAGAGCUAUGCU-3’)所示的crRNA、tracrRNA、以及上述供体质粒通过电穿孔导入人iPS细胞中。

电穿孔4天后，从细胞纯化基因组DNA，实施通过PCR进行的DNA插入的确认。如图11所示，在5’末端以及3’末端，看到了相当于同源重组的大小的条带。此外，通过测序确认了是同源重组。即，人iPS细胞中的敲入是两侧同源重组。

<实验例9>

使用ZFN、TALEN，进行<实验例3>中的实验。使用了包含两端100bp的同源臂的供体质粒。结果如图12所示。在使用了ZFN和TALEN的情况下，也同样地，在5’末端以及3’末端，看到了相当于同源重组的大小的条带。在本发明中，已经明确了作为目标基因组DNA切割酶，不限于CRISPR/Cas9，也可以使用ZFN或TALEN这两种中的任一种。

在上述实验例中，与<实验例1>相同，通过测序确认重组方法的结果如表1所示。括号内表示同源重组的效率。

如表1所示，确认了无论动物种类、目标基因座如何，都通过同源重组进行敲入。

[表1]

根据本发明，能够在不损害细胞本来具有的非同源末端结合的能力的情况下，在目标基因组中实现比非同源重组高的同源重组频率。

序列表

<110> 学校法人自治医科大学

<120> 基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂、以及细胞制剂的制造方法

<130> PC27495

<150> JP2018-66174

<151> 2018-03-29

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

ggcccaggtt 10

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

caaaaggaaa tgtgtgggtg gggaggggta gtgggtaagg ggcccaggtt 50

<210> 3

<211> 155

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Exon1 of IL2RG

<400> 3

cctgacacag tctacaccca ggaaacaagg agtaagcgcc atgctcaaac cccccctccc 60

cgtcaagtct ctcctcttcc tccagctccc tctgctcggc gtcggcctca atcctaaggt 120

cctcacccac agcggcaacg aggacatcac cgctg 155

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

gtgggaaact gggacgttgg gggtagggtt ggtgagccgg gggaggctgg 50

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

gtgggaaact 10

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL2RG HITI

<400> 6

ccttcgggtt cagtcccacc cca 23

<210> 7

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL2RG crRNA

<400> 7

ugggguggga cugaacccga guuuuagagc uaugcu 36

<210> 8

<211> 10

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 8

tgcaactcca 10

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9

tgggcctggg agaatccctt ccccctcttc cctcgtgatc tgcaactcca 50

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

aatacctttc tgggagttct ctgctgcctc ctggcttctg aggaccgccc tgggcctggg 60

agaatccctt ccccctcttc cctcgtgatc tgcaactcca 100

<210> 11

<211> 10

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 11

acaggtgtaa 10

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 12

acaggtgtaa aattggaggg acaagacttc ccacagattt tcggttttgt 50

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 13

acaggtgtaa aattggaggg acaagacttc ccacagattt tcggttttgt cgggaagttt 60

tttaataggg gcaaataagg aaaatgggag gataggtagt 100

<210> 14

<211> 853

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP

<400> 14

actagttcta gcatctgtag ggcgcagtag tccagggttt ccttgatgat gtcatactta 60

tcctgtccct tttttttcca cagctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg catgcggatc 120

cggtaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 180

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 240

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 300

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 360

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 420

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 480

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 540

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 600

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 660

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 720

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 780

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 840

caagtaagaa ttc 853

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Rosa26 HITI

<400> 15

ccatcttcta gaaagactgg agt 23

<210> 16

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Rosa26 crRNA

<400> 16

acuccagucu uucuagaaga guuuuagagc uaugcu 36

<210> 17

<211> 100

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 17

ggatcggtgg ctccatcctg gcctcactgt ccaccttcca gcagatgtgg atcagcaagc 60

aggagtacga tgagtccggc ccctccatcg tgcaccgcaa 100

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 18

ggactgttac tgagctgcgt tttacaccct ttctttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 60

aaaaaaaaat aagagacaac attggcatgg ctttgttttt 100

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actb HITI

<400> 19

agtccgccta gaagcacttg cgg 23

<210> 20

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actb crRNA

<400> 20

aguccgccua gaagcacuug guuuuagagc uaugcu 36

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

gatgaaccag gttatgacct tgatttattt tgcataccta atcattatgc tgaggatttg 60

<210> 22

<211> 244

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

ccggcctgtt gttttcttac ataattcatt atcataccta caaagttaac agttactaat 60

atcatcttac acctaaattt ctctgataga ctaaggttat tttttaacat cttaatccaa 120

tcaaatgttt gtatcctgta atgctctcat tgaaacagct atatttcttt ttcagattag 180

tgatgatgaa ccaggttatg accttgattt attttgcata cctaatcatt atgctgagga 240

tttg 244

<210> 23

<211> 61

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

gaaagggtgt ttattcctca tggactaatt atggacaggt aagtaagatc ttaaaatgag 60

g 61

<210> 24

<211> 239

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

gaaagggtgt ttattcctca tggactaatt atggacaggt aagtaagatc ttaaaatgag 60

gttttttact ttttcttgtg ttaatttcaa acatcagcag ctgttctgag tacttgctat 120

ttgaacataa actaggccaa cttattaaat aactgatgct ttctaaaatc ttctttatta 180

aaaataaaag aggagggcct tactaattac ttagtatcag ttgtggtata gtgggactc 239

<210> 25

<211> 732

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP

<400> 25

gaattcatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 120

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 180

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 240

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 300

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 360

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 420

gggcacaagc tggagtacaa cttcaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 480

aagaacggca tcaaggcgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 540

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 600

aaccactacc tgaccaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 660

atggtcctgg tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 720

aagtaaggat cc 732

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HPRT HITI

<400> 26

accctttcca aatcctcagc ataatg 26

<210> 27

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HPRT gRNA

<400> 27

uuaugcugag gauuuggaaa 20

<210> 28

<211> 101

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28

cgccggtttg tgccttcggt ccccgcttcg ccccctgccg tcccctcctt atcacggtcc 60

cgctcgcggc ctcgccgccc cgctgtctcc gccgcccgcc a 101

<210> 29

<211> 101

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

acccccgtgc cgccgcggat gggcagccgc gctggcggcc ccaccacgcc gctgagcccc 60

acgcgcctgt cgcggctcca ggagaaggag gagctgcgcg a 101

<210> 30

<211> 740

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP

<400> 30

gatctgacaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 60

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 120

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 180

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 240

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 300

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 360

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 420

ctggggcaca agctggagta caacttcaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 480

cagaagaacg gcatcaaggc gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 540

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 600

gacaaccact acctgaccac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 660

cacatggtcc tggtggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 720

tacaaggccg gctccggtac 740

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LMNB1 HITI

<400> 31

ggggtcgcag tcgccatggc ggg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rcHITI

<400> 32

cccgccatgg cgactgcgac ccc 23

<210> 33

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LMNB1 gRNA

<400> 33

ggggucgcag ucgccauggc 20

<210> 34

<211> 10

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

tgaggatttg 10

<210> 35

<211> 10

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

gaaagggtgt 10

<210> 36

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HPRT crRNA

<400> 36

uuaugcugag gauuuggaaa guuuuagagc uaugcu 36