公开/公告号CN112501002A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-03-16
原文格式PDF
申请/专利权人 西湖大学;
申请/专利号CN202011414612.7
申请日2020-12-03
分类号C12M1/34(20060101);C12M1/00(20060101);C12Q1/18(20060101);B01L3/00(20060101);
代理机构33200 杭州求是专利事务所有限公司;
代理人万尾甜;韩介梅
地址 310000 浙江省杭州市西湖区转塘街道石龙山街18号
入库时间 2023-06-19 10:16:30
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及一种细菌药敏性检测的方法,尤其是涉及一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法。
背景技术
基于传统平板的纸片法检测细菌药敏性是经典的药敏检测方法,但是需要大量的人工操作,且通常需要24-48h才能得到检测结果
参考文献:
1.Matuschek,E.,et al.,Development of the EUCAST disk diffusionantimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routinemicrobiology laboratories.2016,20(4):p.O255-O266.
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发明内容
现有应用在细菌药敏性检测中的常用的两种浓度梯度芯片通常为树状芯片和扩散型芯片。树状芯片版面大,且容易阻塞,并且需要至少两个注射泵精密控制;扩散芯片的长时间不稳定性,且不能独立观察有交叉污染的风险;本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法。
本发明采用的技术方案如下:
一种浓度梯度芯片,包括主通道,在主通道两端分别开有入口和出口,在主通道上由前端至后端依次开有储液孔和若干均匀交错分布于主通道两侧的截留腔室,所述入口、出口、储液孔、截留腔室均与主通道连通,各截留腔室上均开有排气孔。
上述技术方案中,进一步的,所述的排气孔孔径应小于所述出口孔径,设置排气孔可以实现:当流体由主通道流向截留腔室时,避免腔内较大压力,从而让流体顺利充满截留腔室,控制排气孔孔径小于所述出口孔径可以起到阻碍流体流动的作用,这样待流体充满截留腔室后又能进一步的阻碍流体继续流动从而更好的实现截留的目的。
进一步的,所述截留腔室以及其入口宽度应满足能够让流体顺利流入截留腔室,也能在移除主通道溶液时在截留腔室内截留足量的样品溶液;所述截留腔室的优化参数如下:所述截留腔室半径为2mm,同侧相邻两截留腔室中心间距为10mm,截留腔室的入口宽度为1mm。其中可根据实验需要设计截留腔室的数量,以得到不同的浓度梯度;但截留腔室的尺寸设计和各截留腔室入口宽度会极大影响截留效果,确定截留腔室尺寸后优化其入口宽度,当宽度大于1.0mm时,腔室内的流体形成独立的微液滴需要更大的压力,因而会导致截流腔室内的溶液体积较小,当截留腔室入口宽度小于1.0mm,由于流阻作用影响增大,流体不易顺利流入腔室内。
基于上述的芯片可实现对细菌药敏性的检测,首先在储液孔储存药物溶液,利用注射泵将菌液从入口处注入到芯片主通道内,当菌液流经储液孔时,药物溶液扩散到菌液中,随着菌液的继续流入,截留腔室内将依次充满含有递减浓度药物的菌液,然后通过注射泵的抽取模式移除主通道内的菌液,各截留腔室内的菌液则被截留,培养后测定各截留腔室OD值观测细菌在不同浓度药物作用下的生长情况,从而确定菌株的最小抑制浓度和药敏性评级。
本发明借鉴微液滴形成原理,创新性设计了基于流阻原理的可产生浓度梯度的微液滴芯片,并利用其进行细菌的药敏性检测。该梯度产生芯片设计灵活、操作方便且可高通量产生相互独立的微液滴。因此该基于流阻式的独立液滴微流控芯片可避免实验交叉污染,简化设备集成等,对提高药敏性检测的精准性,简化实验操作等具有重要意义。相较于树状芯片、扩散性芯片以及传统微液滴芯片,有益效果如下:
(1)腔室内的菌液独立反应,避免交叉污染:芯片内设计的截流腔室能够有效截流菌液,形成独立的反应。
(2)形成的药物浓度梯度具有良好的可调节性:可通过设计芯片中截留腔室的数量,调节得到更密集或稀疏的浓度梯度。
(3)该芯片设计灵活小巧,避免占据较大的版面:该梯度芯片不需要设计多个流体交汇点进行溶液的稀释和浓度梯度的形成(如树状芯片),截留腔室均匀分布在主通道的两侧,节约了占用面积。
(4)简化了控制操作和设备集成:该芯片设计了储液孔,可将药物液滴预先存储,因而只需要准确控制样品溶液的输入,从而简化了操作,节约了成本。
附图说明
图1:基于光固化打印机制造的细菌药敏检测浓度梯度芯片;
图2:梯度芯片实物图;
图3:不同浓度的罗丹明模拟B和H值间的线性关系;
图4:罗丹明B模拟抗生素的浓度梯度形成过程;
图5:截留腔室入口宽度的优化设计示意图;
图6:E.coliMG1655在芯片里的生长;
图中:
11:光源,12:玻片,13:薄膜,14:支撑平台,15:紫外光,16:样品支撑台,17:模具,21:入口,22:储液孔,23:截留腔室,24:排气孔,25:出口。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例对本发明的技术方案做进一步的解释说明。
本发明的浓度梯度芯片是对流阻性梯度芯片的进一步创新型设计,简化了常规梯度芯片形成梯度的控制,可自动产生药物浓度并进行细菌药敏性检测,通常包括主通道,在主通道两端分别开有入口和出口,在主通道上由前端至后端依次开有储液孔和若干均匀交错分布于主通道两侧的截留腔室,所述入口、出口、储液孔、截留腔室均与主通道连通,各截留腔室上均开有排气孔。如图1、2所示,本实例的整个芯片尺寸为45mmx22mmx3mm在主通道的两侧均匀依次分布六个截留腔室,每个截留腔室半径为2mm,同侧相邻两腔室中心间距为10mm。排气孔半径为0.3mm,储液孔半径为0.4mm。其制备可以采用:将设计好的模型存储为STL格式,用光固化打印机进行打印,然后用配好的PDMS进行浇筑,80℃热固化一小时后,将PMDS取出,用等离子清洗机对PDMS表面进行30s等离子清洗;最后和玻璃进行键合,得到浓度梯度芯片。
储液孔用来预先存储少量高浓度药物溶液液滴(由于表面作用液滴会贮留于储液孔中),利用注射泵将菌液从入口处注入到芯片主通道内,当菌液流经储液孔时,药物溶液液滴于菌液接触从而扩散到菌液中,随着菌液的继续流入,截留腔室内将依次充满含有递减浓度药物的菌液,然后通过注射泵的抽取模式移除主通道内的菌液,各截留腔室内的菌液则被截留,形成浓度梯度(如图4);截留腔室的入口宽度经优化设计,取1.0mm最为合适,如图5所示,其达到的截留效果最佳;
下面以细菌对抗生素药敏性为例利用上述设计的芯片进行检测:
首先,用光固化打印机打印出用于制作芯片的模具;然后,以1:1的比例混合PDMS单体和固化剂,倾倒在模具中,热固化完成后,从模具中取下PDMS和玻璃键合,得到能够自动产生浓度梯度的PDMS芯片。
1.利用罗丹明模拟确定截留腔室内最终抗生素浓度
配置不同罗丹明B溶液(0.5-0.0039mg/mL),得到色相值H和浓度之间的关系,如图3所示,R=0.9878说明可以用色相值H表示罗丹明B的浓度。取2μL浓度为10mg/mL的罗丹明B水溶液注入到储液孔中,然后从入口处注入水溶液,后根据最终截留腔室中罗丹明B颜色的H值来判断每个截留腔室内的罗丹明B浓度。如图3;
2.利用该梯度芯片进行细菌药敏性检测
将微量高浓度抗生素溶液存贮在入口附近的储液孔中;接着,取过夜培养的大肠杆菌E.coli MG1655,用LB液体培养基稀释至~10
表1利用该浓度梯度芯片得到MG1655对卡那霉素的敏感度和最低抑制浓度(S:敏感,I:中性,R:耐药)
机译: 肽,规定的肽,成分,药物成分,瓶,消毒溶液,微生物的生长抑制,复制或感染的方法,细菌生长的抑制方法,细菌生长的抑制作用,治疗由微生物感染引起或与之有关的疾病的预防,疾病的抑制方法,一种细菌治疗方法的治疗和一种或多种细菌引起的疾病的治疗感染,预防由细菌感染引起的疾病或与之相关的疾病的方法,在受试者体内抑制病毒复制的方法以及对由细菌引起或与之相关的疾病的治疗在主题中,一种预防由对象中的病毒感染引起或与之相关的疾病的方法,一种用于对INA进行消毒的方法
机译: DNA芯片,用于检测或进行性传播疾病的细菌的基因检测试剂盒,用于抗药性的基因分型以及使用相同方法进行检测或基因分型的方法
机译: DNA芯片,用于检测或进行性传播疾病的细菌检测试剂盒,用于抗药性的基因分型以及使用相同方法进行检测或基因分型的方法。