公开/公告号CN112501166A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-03-16
原文格式PDF
申请/专利权人 四川大学;纽奥维特(成都)生物科技有限公司;
申请/专利号CN202011331555.6
申请日2020-11-24
分类号C12N15/11(20060101);C12N15/10(20060101);C12Q1/70(20060101);C12Q1/686(20180101);C12Q1/6848(20180101);C12Q1/6844(20180101);
代理机构11246 北京众合诚成知识产权代理有限公司;
代理人赵浩竹
地址 610065 四川省成都市一环路南一段24号
入库时间 2023-06-19 10:16:30
技术领域
本发明涉及一种高稳定性RNA,具体涉及一种化学修饰的高稳定性RNA 及试剂盒和方法。
背景技术
核酸检测是诊断传染病、遗传病和肿瘤等疾病的重要手段,如新冠病毒 的检测和诊断。COVID-19的早期诊断对于预防和控制这种全球性流行病至 关重要。
实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)通常被认为是诊断COVID-19的最 有效策略。但是,最近的研究发现,由于大量的假阴性结果(大约40%), 当前的RT-PCR试剂盒提供的结果并不令人满意。假阴性结果极为危险,可 能会在COVID-19预防和流行控制中引起许多问题。由于这种病原体具有极 强的传染性和致命性,因此具有假阴性结果的人很容易感染周围的其他人, 从而导致病毒的广泛传播,并对人口造成严重影响。假阴性结果通常是由样 品收集、运输、存储和/或处理不当引起的,而不是检测试剂盒本身。但是, 有问题的RT-PCR试剂盒,例如对照不适当且逆转录失败的试剂盒,也可能 会导致假阴性。
RT-PCR是基础研究和疾病诊断中使用最广泛的RNA检测方法之一,它 分为两个步骤:(1)逆转录;和(2)定量实时聚合酶链反应。尽管它实际 上可以像检测DNA一样快速和灵敏地检测RNA,但RNA容易受到RNase 降解的影响,从而导致其固有的不稳定性(J.Houseley,D.Tollervey,The many pathways of RNA degradation,Cell 136(4)(2009)763-76)。更糟糕的是,RNase 在周围环境中几乎无处不在,很难消除,它们可以迅速降解RNA,包括RNA 样品和RNA对照。尽管从理论上讲RNA应当是阳性对照,但在商业RT-PCR试剂盒中,DNA通常在实践中通常用作阳性对照,以避免RNA生物降解并 面对短时间内制备大量灭活或重组病毒的挑战。然而,阳性对照DNA无法 检查和报告逆转录步骤失败的RT-PCR试剂盒,从而在基于RNA检测的疾病 诊断中造成假阴性结果的高风险,例如,RNA的假阴性。因此,对于使用 RT-PCR试剂盒检测病毒RNA而言,适当的对照至关重要,有任何问题的试 剂盒应由阳性对照进行识别和报告。同样,用RT-LAMP核酸恒温扩增法 (Reversetranscription Loop-mediated isothermal amplification)检测RNA也 面临着同样的假阴性风险。
RT-PCR检测中若未经严格控制、设计和维护会很容易引起气溶胶和/或 表面交叉污染以及信号误检测,增大假阳性的风险。阴性对照旨在监控污染 和错误检测,虽然阴性对照经常选择高纯度水,但非特异性RNA在理论上 是更好的选择,尤其是监测错误检测。但是,当非特异性的RNA被选择, 除了稳定性要求,排他性(或排他的特异性)是阴性对照的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种化学修饰的高稳定性RNA及试剂盒和方法, 解决了现有RT-PCR检测采用DNA作为对照易造成假阴性结果的问题,以 高稳定性RNA作为阳性或阴性对照,避免RT-PCR检测中出现假阴性的结果。
为了达到上述目的,本发明提供了一种化学修饰的高稳定性RNA,该高 稳定性RNA的磷酸酯中的氧原子被S或/和Se替代,其结构式如式(1)所 示:
式中,X表示S原子或Se原子;
优选地,该高稳定性RNA是以DNA为模板,经转录而获得的。
优选地,该高稳定性RNA是以pCOVID-19质粒DNA为模板,经核苷 酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR反应,再经转 录获得的。
优选地,该高稳定性RNA是经化学合成得到的。
本发明的另一目的是提供一种用于检测COVID-19的RT-PCR试剂盒, 该RT-PCR试剂盒中的阴性和阳性对照至少一个为权利要求1-4中任意一项 所述的高稳定性RNA。
本发明的另一目的是提供一种所述的高稳定性RNA的制备方法,该方 法包含:以pCOVID-19质粒DNA为模板,经过用SEQ ID.NO1和SEQ ID.NO2 所示核苷酸序列为引物,采用的核糖核苷酸的磷酸酯中的氧原子被S或Se 替代,通过PCR反应和转录获得高稳定性RNA。
优选地,所述模板为带有T7启动子的pCOVID-19质粒的DNA片段。
本发明的另一目的是提供种RT-PCR或RT-LAMP检测COVID-19的新 方法,该方法中的阴性或阳性对照中至少一个为所述的高稳定性RNA。
优选地,RT-PCR扩增反应体系包含:10X缓冲液Buffer、dNTPs、正向 和反向引物、分子探针、Taq DNA聚合酶、反转录酶、待测RNA核酸和ddH
优选地,RT-LAMP恒温扩增反应体系包含:10X缓冲液Buffer、dNTPs、 正向和反向引物、内引物和外引物、Bst DNA聚合酶、反转录酶、分子探针、 待测RNA核酸和ddH
本发明的化学修饰的高稳定性RNA及试剂盒和方法,解决了现有 RT-PCR检测采用DNA作为对照易造成假阴性结果的问题,具有以下优点:
现有的商业RT-PCR试剂盒通常采用DNA作为阳性对照,增加了假阴 性的风险。而且,在RT-PCR检测中以水作为阴性对照,难以监测污染和错 误检测。本发明采用高稳定性RNA作为阳性或阴性对照,该高稳定性RNA 为磷酸硒脂和硫代磷酸酯RNA(Se-RNA和S-RNA),Se-RNA和S-RNA 均可作为逆转录的良好模板,不仅具有很好的热稳定性、生物稳定性、抗核酸酶水解稳定性、化学稳定性,还具有分子选择、排他性和特异性,表明它 们作为RT-PCR试剂盒的阳性和阴性对照均具有潜力和应用前景。
本发明的高稳定RNA也可以在RT-LAMP核酸检测上用作为阳性对照, 本发明的Se-RNA、S-RNA和Se-S-RNA是RT-PCR和RT-LAMP试剂盒的有 效阳性对照,能减少RT-PCR和RT-LAMP检测中的假阴性结果。
附图说明
图1为本发明采用商业试剂盒中DNA作为阳性对照检测COVID-19的结 果。
图2为本发明采用商业试剂盒KitA不同批次及商业试剂盒Kit B的检测 COVID-19的结果。
图3为本发明图Se-RNA和S-RNA的转录、逆转录及RT-PCR检测结果。
图4为本发明的Se-RNA、S-RNA和Se-S-RNA和O-RNA的热稳定性、 生物稳定性和化学稳定性对比结果(图中标注与曲线是自上而下分别对应一 一对应的)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实验例1COVID-19RNA待测模板和引物的制备
1、COVID-19RNA待测模板
以含有COVID-19靶序列的质粒DNA(pCOVID-19质粒;买自Sangon, Shanghai,China)通过PCR制备带有T7启动子且含有COVID-19靶序列的 DNA片段。通过T7转录最终获得COVID-19RNA(序列如SEQ ID NO.1 所示)。
上述COVID-19RNA用作RT-PCR的待测模板或待测RNA核酸。临床COVID-19RNA样品也可用作RT-PCR的待测模板。
2、RT-PCR引物和探针
设计正向引物F、反向内部引物B和Taqman探针,它们最终通过化学 合成得到,具体序列如下:
正向引物F:GGGGAACTTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO.2);
反向内部引物B:GAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID NO.3);
Taqman探针:5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT(SEQ ID NO.4)。
实验例2采用商业试剂盒检测COVID-19
1、商业RT-PCR试剂盒的阳性对照
对于COVID-19RNA的检测,6种商业RT-PCR试剂盒被使用,用于实 时RT-PCR检测,根据样品(待测COVID-19RNA核酸)、阳性对照和阴性 对照的数量准备适当量的反应混合物(包括缓冲液、酶、引物和探针,试剂 盒中自带)。然后,将移液器模板(5μL)和反应混合物(20μL)移至每个 反应管中,再将反应液混合并低速离心,最后进行RT-PCR扩增。
具体地,RT-PCR扩增反应体系为:10X缓冲液Buffer、0.2mM dNTP(包 括dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、正向和反向引物各0.2μM、Taq DNA聚 合酶2.5U、反转录酶1U、适量的待测RNA核酸,然后补加ddH
具体地,RT-PCR扩增反应过程,为:(1)反转录反应:42℃,5min; 95℃,10sec;(2)PCR反应:95℃,5sec;60℃,20sec;重复45个循环。 采用荧光PCR仪实时监测反应体系的荧光变化(每个循环采集一次荧光信 号)。
2、RNaseA消化的阳性对照
将上述6种商业RT-PCR试剂盒的阳性对照DNA分别用RNaseA消化 后作为阳性对照,然后使用相应的RT-PCR试剂盒进行RT-PCR分析。
上述消化过程具体为:在含有20μL阳性对照、17μLRNase A和2μL反 应缓冲液(Reaction Buffer:100mM Tris-HCl、25mM MgCl
3、DNase I消化的阳性对照
将上述6种商业RT-PCR试剂盒的阳性对照分别用DNase I消化后作为 阳性对照,然后使用相应的RT-PCR试剂盒进行RT-PCR分析。
上述消化过程具体为:在含有20μL阳性对照、1μL DNase I和2μL反应 缓冲液的反应混合物中进行消化,并在37℃下孵育30分钟。然后在80℃灭 活5分钟。
4、RT-PCR检测结果对比
如图1所示,为6种商业RT-PCR试剂盒的阳性对照在未作处理以及酶 消化处理后RT-PCR结果对比,图中A-F为六种商用RT-PCR试剂盒,每个 图中,阳性和阴性对照分别来自相应的试剂盒,其中,曲线1:未消化阳性 对照的RT-PCR;曲线2:用RNaseA消化的阳性对照的RT-PCR;曲线3: 用DNase I消化的阳性对照的RT-PCR;曲线4:阴性对照。由图1可知,这 6种商业RT-PCR试剂盒的阳性对照均可以被DNase I消化,同时抵抗RNase A的消化,表明这6种商业RT-PCR试剂盒均采用的阳性对照均为DNA。
实验例3商业试剂盒KitA检测COVID-19RNA
采用商业试剂盒KitA的批次1(KitA,Batch-1)对COVID-19病毒RNA 样品(COVID-19RNA)进行了检测,而其阳性对照DNA被用作参考。如 图2所示,为商业试剂盒KitA不同批次及商业试剂盒Kit B的检测结果,每 个图中,曲线1:COVID-19阳性RNA样品1;曲线2:COVID-19阳性RNA 样品2;曲线3:相应试剂盒的阳性对照;曲线4:相应试剂盒的阴性对照。从图中可以看出,尽管DNA对照照常报告阳性结果,但商业试剂盒KitA的 批次1未能报告这些阳性病毒RNA样品的阳性结果,表明RT-PCR中的逆转 录步骤无效,但DNA聚合和PCR反应均正常运行。通过商业试剂盒B证实 了这些RNA样品的完整性(表1和图2),实验结果表明,带有DNA阳性 对照的试剂盒会导致假阴性,存在逆转录失败的问题,表明DNA作为阳性 对照不是RT-PCR试剂盒的理想策略,使用RNA阳性对照可能是更好的选择。
表1为使用商业试剂盒对COVID-19RNA的假阴性检测结果
注:均经重复了五次,结果是一致的;Ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经 历的循环数;COVID-19RNA样品1和COVID-19RNA样品2均为采用实验例1中的方法制备的。
实验例4制备本发明的S-RNA和Se-RNA
为了转录Se-RNA和S-RNA,以pCOVID-19质粒为模板进行PCR扩增 反应,引物F为:5'-taatacgactcactatagCTCTTCTCGTGTCTCTCATC-3'(SEQ ID NO.5),引物B为:5'-GCAGCAGATTTCTTAGTG-3'(SEQ ID NO.6), 并把T7启动子引入到产物DNA(COVID-19的N基因中210bp)。然后, 分别使用四个NTPαSe(Se修饰NTP),或四个NTPαS(S修饰NTP),或 这两类修饰NTP的混合物(购自纽奥维特SeNtInAll,中国成都),并用T7 RNA转录酶来制备Se-RNA和S-RNA。所有四个硒和硫修饰的NTP(NTPαSe 和NTPαS)都可通过T7 RNA聚合酶来产生稳定性更高的RNA,如下式:
转录后,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%PAGE)分析每种产物 (1μL),并用GelRed染色由凝胶成像仪显示。
实验例5本发明的S-RNA和Se-RNA逆转录
使用本发明制备的高稳定性RNA(实验例4制备的Se-RNA或S-RNA) 和MLV逆转录酶进行了逆转录实验,具体如下:
将Se-RNA或S-RNA(终浓度:1μM)、5'-FAM标记的引物(1μM)(5’ FAM-GCAGCAGATTTCTTAGTG,SEQ ID NO.6)、dNTP(100μM)、10U MLV逆转录酶、2U RNase抑制剂和1×RT Buffer,在55℃下孵育60分钟。 然后,将反应用尿素饱和的上样缓冲液淬灭,并通过变性PAGE(12%)分 析产物。
如图3中A所示(泳道1:DNA模板;泳道2:DNase I消化前转录的 Se-RNA;泳道3:DNase I消化后转录的Se-RNA;泳道4:DNase I消化前 转录的S-RNA;泳道5:DNase I消化后转录的S-RNA),为Se-RNA和S-RNA 转录,表明本发明的Se-RNA和S-RNA稳定性高。
如图3中B所示(泳道1:FAM标记的引物;泳道2:以S-RNA用作 cDNA反转录的模板;泳道3:以Se-RNA用作cDNA反转录的模板),本 发明的Se-RNA和S-RNA可以被MLV逆转录酶有效识别,从而产生cDNA。 而且,如图3中C所示,表明本发明的Se-RNA和S-RNA均可通过RT-PCR 扩增和检测。如表2所示,可以看出本发明的Se-RNA和S-RNA的检测限与 O-RNA(即无修饰的COVID-19RNA)的检测限相似,这进一步表明本发明 的Se-RNA、S-RNA和Se-S-RNA可作为阳性对照。
表2为标准RNA和修饰RNA的检测灵敏度
实验例6本发明的S-RNA和Se-RNA的稳定性
稳定性(生物稳定性和热稳定性)是阳性RNA对照的最重要属性,将 本发明的Se-RNA、S-RNA和Se-S-RNA与标准RNA(O-RNA)相比,验证 发明的S-RNA和Se-RNA的稳定性,采用的引物组和探针如实验例1所示。
1、热稳定性
在各种温度(55-95℃)下孵育1小时后,O-RNA在较高温度下会明显 分解,而Se-RNA几乎没有受到影响,S-RNA也保持稳定,本发明的RNA 在RT-PCR检测和Ct值上没有显示出显著的变化,表明本发明的Se-RNA、 S-RNA具有出色的热稳定性(参见图4的A-C,A-C分别是Se-RNA、S-RNA 和O-RNA在室温、55、72和95℃下1小时的热稳定性),热稳定性顺序为:Se-RNA>S-RNA>>O-RNA。
2、生物稳定性
参见图4的D-F(D-F分别是Se-RNA、S-RNA和O-RNA经RNase-T1、 血清和唾液处理后的生物稳定性),当用RNase T1(核糖核酸酶T1)、血 清和唾液分别处理时,RNase T1、血清和唾液几乎不会影响Se-RNA和 S-RNA,生物稳定性顺序为:Se-RNA>S-RNA>>O-RNA。
3、化学稳定性
参见图4的G-I图(它们分别描述的是Se-RNA、S-RNA和O-RNA在4℃ 下储存0-30天的化学稳定性),将本发明的Se-RNA和S-RNA与O-RNA在 4℃下保存0-30天,表明化学稳定性顺序为:Se-RNA>S-RNA>>O-RNA。
实验例7本发明的S-RNA和Se-RNA作为阴性对照
设计8组非特异性引物验证本发明的Se-RNA、S-RNA与O-RNA作为 阴性对照的排他性,如表3所示,本发明的Se-RNA、S-RNA比标准RNA (O-RNA)更具排斥性,它们的Ct值高于O-RNA,表明本发明的Se-RNA、 S-RNA作为阴性对照比标准RNA更好。因此,本发明的Se-RNA、S-RNA 和Se-S-RNA是RT-PCR试剂盒的有效阴性对照,能减少RT-PCR检测中的 假阳性结果。
表3为Se-RNA和S-RNA作为RT-PCR的阴性对照结果
注:Ct值≥36表示阴性检测;引物对1为,F:ACTTGTGCTAATGACCCTG(SEQ ID NO.7),B: CGCAGACGGTACAGACT(SEQ ID NO.8);引物对2为,F:GCGGTATGTGGAAAGGTT(SEQ IDNO.9),B:CTGACTGAAGCATGGGTT(SEQ ID NO.10);引物对3为,F:CAACTTGTGCTAATGACCCT(SEQ ID NO.11),B:CGCAGACGGTACAGACT(SEQ ID NO.8);引物对4为,F:AAGGTTATGGCTGTAGTTGT(SEQ ID NO.12),B:CTGACTGAAGCATGGGTT(SEQ ID NO.10); 引物对5为,F:CGTGGTATTCTTGCTAGTTA(SEQ ID NO.13),B:AGTACGCACACAATCGAA(SEQ ID NO.14);引物对6为,F:TAGTTACACTAGCCATCCTT(SEQ ID NO.15),B: AATATTGCAGCAGTACGC(SEQ IDNO.16);引物对7为,F:GTTACACTAGCCATCCTTAC(SEQ ID NO.17),B:AATATTGCAGCAGTACGC(SEQ ID NO.16);引物对8为,F: TTCGTGGTATTCTTGCTAGT(SEQ ID NO.18),B:GCAGTACGCACACAATCG(SEQ ID NO.19)。
实验例8本发明的RT-LAMP检测COVID-19
1、引物组
F3(正向内部引物):
GCCAAAAGGCTTCTACGCA(SEQ ID NO.20);
B3(反向内部引物):
TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA(SEQ ID NO.21);
FIP(正向外部引物):
TCCCCTACTGCTGCCTGGAGCGGCAGTCAAGCCTCTTC(SEQ ID NO.22);
BIP(反向外部引物):
TTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCTCTGTCAAGCAGCAGCAAAG(SEQ ID NO.23)。
2、RT-LAMP检测
(1)合成并配置引物混合物:先按照LAMP扩增原理并针对待测靶分 子进行引物的设计(上述引物组),再根据引物的设计合成出引物并配置成 固定浓度的引物混合物,该引物混合物包括16microM的正向内部引物、 16microM的反向内部引物、2microM的正向外部引物和2microM的反向外 部引物;
(2)配置混合物:将dATP、dCTP、dGTP和dTTP按规定比例混合;
(3)配置RT-LAMP反应体系:将RT-LAMP扩增缓冲液、引物混合物、 Bst 2.0DNA聚合酶和样本RNA配置成RT-LAMP反应体系,再补充dd H
(4)反应扩增分析:先将配置好的RT-LAMP反应体系放置于荧光恒温 仪中,接着在65℃恒温环境下孵育60-120分钟,并实时监测反应体系的荧 光变化,然后RT-LAMP对待测靶分子进行扩增,最后通过分析得出检测结 果,参见表4。
表4为RT-LAM检测COVID-19的灵敏度
综上所述,本发明的Se-RNA、S-RNA和Se-S-RNA能够作为RT-PCR 和RT-LAM检测中的阳性对照或阴性对照,避免了RT-PCR和RT-LAM检测 中的假阴性和假阳性结果。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识 到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述 内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的 保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 四川大学
纽奥维特(成都)生物科技有限公司
<120> 一种化学修饰的高稳定性RNA及试剂盒和方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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taggggaact tctcctgcta gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc ttgctttgct 120
gctgcttgac agattgaacc agcttgagag caaaatgtct ggtaaaggcc aacaacaaca 180
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机译: DSRNA的序列:ATN-RNA,使用IRNAI进行干预,DSRNA的序列:ATN-RNA的使用,一种治疗和抑制脑肿瘤的方法,一种抑制表达特那霉素的癌细胞的试剂盒,一种在小鼠体内制备试剂盒的方法脑瘤治疗
机译: DSRNA的序列:ATN-RNA,使用IRNAI进行干预,使用DSRNA的序列:ATN-RNA,治疗和抑制脑肿瘤的方法,一种抑制表达特那霉素的癌细胞的试剂盒,一种试剂盒的制备方法在脑部肿瘤治疗中
机译: DSRNA的序列:ATN-RNA,使用IRNAI进行干预,使用DSRNA的序列:ATN-RNA,治疗和抑制脑肿瘤的方法,一种抑制表达特那霉素的癌细胞的试剂盒,一种试剂盒的制备方法在脑部肿瘤治疗中