一种用于CpG岛甲基化表型检测的试剂盒及其应用

摘要

本申请公开了一种用于CpG岛甲基化表型检测的试剂盒及其应用。本申请的试剂盒，包括CACNA1G基因甲基化检测试剂、IGF2基因甲基化检测试剂、NEUROG1基因甲基化检测试剂、RUNX3基因甲基化检测试剂和SOCS1基因甲基化检测试剂中的至少一种，以及内参β‑Actin基因检测试剂。五个靶标基因的检测试剂各自包括特异性上下游引物、甲基化探针和非甲基化探针，内参β‑Actin基因检测试剂包括内参基因特异性上下游引物和探针。本申请的试剂盒，能够检测五个靶标基因的甲基化情况，高灵敏度、高准确性的实现CpG岛甲基化表型检测；为患者个体化精准用药指导、药效评估以及靶向治疗动态监测提供了重要的参考依据。

说明书

技术领域

本申请涉及核酸甲基化检测领域，特别是涉及一种用于CpG岛甲基化表型检测的试剂盒及其应用。

背景技术

基因组DNA甲基化水平可以决定一类基因的表达或者抑制，对于细胞正常功能有着重要作用。肿瘤组织中存在着基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化的现象。抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化是许多肿瘤发生的早期重要事件，可致使相关基因表达下调，从而影响细胞内及细胞间正常生长凋亡。原癌基因的低甲基化，可以引起原癌基因的转录激活。

近年来的研究表明，DNA甲基化状态可作为生物标记应用于癌症治疗全程，如早期诊断、病理分型、监测疾病进展，预测治疗效果和预后等，尤其在早期诊断方面具有显著的优势。

结直肠癌是世界上第三大最常见的恶性肿瘤。1999年，日本学者Toyota提出了CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype，CIMP)结直肠癌，这是一类基因组中有高比例的基因发生了DNA甲基化的结直肠癌类型。研究发现CIMP型结直肠癌的致病机理及其在治疗上的反应和预后效果都与其它类型的结直肠癌存在很大差异，例如预后较差，对化疗药物5-FU和西妥昔单抗不敏感等，因此，研究CIMP具有重要的科学和临床意义。

另外，有研究显示，CpG岛甲基化表型涉及多个基因启动子同时甲基化，具有肿瘤特异性，与多种肿瘤的发生或预后相关。因此，CpG岛甲基化表型检测对肿瘤的发生或预后的研究具有重要意义。

目前主要是通过术后检测肿瘤组织DNA的甲基化状态进行CIMP分型，而临床上许多样本获取肿瘤组织比较困难，因此利用血液游离DNA，即循环DNA (circulating freeDNA，缩写cfDNA)，进行分子分型具有比较大的临床意义。但是，目前尚没有高灵敏度、高准确性的能够准确有效检测cfDNA中的CpG岛甲基化表型的方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于CpG岛甲基化表型检测的试剂盒及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种用于CpG岛甲基化表型检测的试剂盒，包括CACNA1G基因甲基化检测试剂、IGF2基因甲基化检测试剂、NEUROG1基因甲基化检测试剂、RUNX3基因甲基化检测试剂和SOCS1基因甲基化检测试剂中的至少一种，以及内参β-Actin基因检测试剂；CACNA1G基因甲基化检测试剂包括CACNA1G基因扩增引物和甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针，CACNA1G基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.3所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.4所示序列；IGF2基因甲基化检测试剂包括IGF2基因扩增引物和甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针，IGF2基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.7所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.8所示序列；NEUROG1基因甲基化检测试剂包括NEUROG1基因扩增引物和甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针，NEUROG1基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ IDNO.11所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.12所示序列；RUNX3 基因甲基化检测试剂包括RUNX3基因扩增引物和甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针，RUNX3基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.13 和SEQ ID NO.14所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.15所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.16所示序列；SOCS1基因甲基化检测试剂包括SOCS1基因扩增引物和甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针， SOCS1基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.19所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.20所示序列；内参β-Actin基因检测试剂包括β-Actin基因扩增引物和检测探针，β-Actin基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.21和 SEQ ID NO.22所示序列，其检测探针为SEQID NO.23所示序列。

需要说明的是，本申请的试剂盒针对CpG岛的甲基化检测设计了五个靶标基因和一个内参基因的多重检测引物和探针，并且，分别针对五个靶标基因设计了甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针，能够检测五个靶标基因的甲基化情况，从而高灵敏度、高准确性的实现了CpG岛甲基化表型的检测。本申请的一种实现方式中，结合微滴数字PCR(缩写ddPCR)检测技术，可以定量分析低至1/10,000(0.01％)的突变频率。

可以理解，第一，本申请的甲基化状态检测探针和非甲基化状态检测探针是在一个反应中使用，因此，两种探针标记的荧光基团是不同的，例如本申请的一种实现方式中甲基化状态检测探针采用FAM荧光基团标记，非甲基化状态检测探针采用HEX荧光基团标记，只要两种探针的荧光基团标记能够被区分检测即可。第二，本申请的试剂盒中包含了检测五个靶标基因和一个内参基因的试剂，可以根据需求只采用其中部分试剂对部分靶标基因进行检测，在此不作具体限定。第三，本申请试剂盒中限定的引物和探针序列，都是本申请的一种实现方式中具体采用的引物和探针，在此基础上，本领域技术人员可以根据引物和探针设计原则，在本申请的引物或探针序列的5’端或3’端进行若干碱基的增加或删除，只要不影响检测的特异性或者扩增效率在检测可接受范围即可。

优选的，本申请的试剂盒还包括cfDNA提取试剂、DNA亚硫酸氢盐处理试剂和微滴数字PCR检测试剂中的至少一种。

需要说明的是，在本申请的一种使用方式中，本申请的试剂盒是针对cfDNA 检测而研发的，采用本申请的试剂盒可以通过患者外周血中的cfDNA即可进行 CpG岛甲基化表型检测，解决了肿瘤组织获取困难的问题；cfDNA提取试剂可以参考现有的外周血cfDNA提取试剂，本申请只是为了使用方便将其选择性的增加到本申请的试剂盒中。可以理解，本申请的试剂盒不仅可以用于cfDNA检测，同样也可以用于常规的肿瘤组织DNA检测；在这种情况下，本申请的试剂盒中也可以选择性的增加肿瘤组织DNA试剂。同样的，DNA亚硫酸氢盐处理试剂也可以参考现有技术。本申请的一种实现方式中，具体采用的微滴数字PCR 进行的扩增检测和分析，因此，本申请的试剂盒中可以选择性的包括微滴数字 PCR检测试剂。当然，如果采用其它扩增技术，也可以在本申请的试剂盒中增加相应的检测试剂，在此不作具体限定。

本申请的第二方面公开了本申请的试剂盒在制备肿瘤检测或癌症基因检测的试剂中的应用，其中，癌症基因为CACNA1G基因、IGF2基因、NEUROG1 基因、RUNX3基因和SOCS1基因中的至少一种。

需要说明的是，本申请的试剂盒能够用于CpG岛甲基化表型检测，根据CpG 岛甲基化表型可以为肿瘤检测提供中间参考依据，例如，CIMP型结直肠癌，因此，本申请的试剂盒可以作为肿瘤检测试剂使用。另外，本申请的试剂盒中包含CACNA1G基因、IGF2基因、NEUROG1基因、RUNX3基因和SOCS1基因，五个靶标基因的检测试剂；因此，本申请的试剂盒也可以用于CACNA1G基因、 IGF2基因、NEUROG1基因、RUNX3基因或SOCS1基因五个基因甲基化的单独检测，或者对其中部分靶标基因进行检测。

本申请的第三方面公开了本申请的试剂盒在癌症治疗药物筛选中的应用。

需要说明的是，本申请的试剂盒通过对CpG岛甲基化表型检测，可以判断用药前后的CpG岛甲基化变化情况，从而评估用药效果。因此，本申请的试剂盒可以用于癌症治疗药物筛选；可以实现患者个体化精准用药指导、药效评估以及靶向治疗动态监测。

本申请的第四方面公开了一种非诊断治疗目的的CpG岛甲基化表型检测方法，包括采用本申请的试剂盒对待测核酸样品进行CpG岛甲基化表型检测。

需要说明的是，本申请的检测方法仅用于分析和判断靶标基因的甲基化信息，为患者治疗和用药指导提供可靠的分析依据。

优选的，本申请的检测方法还包括设置空白对照或阴性对照等量替换待测核酸样品，进行对照试验；根据待测核酸样品和对照试验的检测信号进行数据分析，通过甲基化指数判定待测核酸样品的甲基化情况；甲基化指数＝(待测核酸样品中的待测基因的检测信号:待测核酸样品中的β-Actin基因的检测信号)÷ (对照试验中的待测基因的检测信号:对照试验中的β-Actin基因的检测信号)；如果甲基化指数大于或等于0.5％，则认为待测核酸样品是甲基化；其中，待测基因为CACNA1G基因、IGF2基因、NEUROG1基因、RUNX3基因和SOCS1 基因中的至少一种。

需要说明的是，本申请的检测方法，其关键在于采用本申请试剂盒特殊设计的五个靶标基因和一个内参基因的甲基化检测引物和探针；通过甲基化指数 (MI)进行甲基化的判断只是本申请的一种实现方式中具体采用的甲基化判断方法，不排除还可以采用其它判断方式。

优选的，本申请的检测方法中，对待测核酸样品进行CpG岛甲基化表型检测和对照试验，都采用微滴数字PCR进行；并采用微滴分析仪分析和计算甲基化指数。

优选的，本申请的检测方法中，待测核酸样品为cfDNA。

优选的，本申请的一种实现方式中，本申请的检测方法具体包括以下步骤，

对外周血样本进行血细胞和血浆分离；

对分离获得的血浆样本采用两步纯化法进行cfDNA的提取；

对提取的cfDNA进行亚硫酸氢盐处理；

对亚硫酸氢盐处理的cfDNA，使用微滴数字PCR进行扩增、检测和分析，计算甲基化指数。

本申请的第四方面公开了本申请的检测方法在癌症基因检测或癌症治疗药物筛选中的应用，其中，癌症基因为CACNA1G基因、IGF2基因、NEUROG1 基因、RUNX3基因和SOCS1基因中的至少一种。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的试剂盒，能够检测五个靶标基因的甲基化情况，能够高灵敏度、高准确性的实现CpG岛甲基化表型检测；为患者个体化精准用药指导、药效评估以及靶向治疗动态监测提供了重要的参考依据。

具体实施方式

由于肿瘤组织获取困难，本申请提出利用cfDNA进行CpG岛甲基化表型检测；但是，cfDNA本身在血液中的含量较低，而肿瘤循环DNA(缩写ctDNA) 又只占cfDNA的一小部分，因此如何高灵敏度、高准确性的检测cfDNA中的 CpG岛甲基化表型是本申请的研究重点和难点。

微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术作为第三代PCR技术，是在传统PCR方法基础上采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与实时荧光定量PCR相比，ddPCR无需构建标准曲线，不受扩增效率的影响，其结果具有更高的精确度、准确性和灵敏度。微滴数字PCR的核心是能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，其中每个微滴中含有一个至数个待检核酸靶分子，或不含核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度和拷贝数，以绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数。

因此，循环DNA检测现已成为焦点，ddPCR技术可以实现低投入、高灵敏度、高准确性的突变DNA检测，可以用于CpG岛甲基化表型检测，从而能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险。

基于以上研究和认识，本申请通过对大量方法和试剂的筛选，将微滴数字 PCR与高特异性的引物序列和探针序列相结合，创造性的提出了一种实时、无创、精准、快速的CpG岛甲基化表型检测方案，从而提出了一种新的用于CpG 岛甲基化表型检测的试剂盒。

本申请的试剂盒及基于本申请试剂盒的检测方法，以外周血中极其微量的 ctDNA为检测对象，进行亚硫酸氢盐处理后，通过微滴乳化技术，降低抑制剂的影响，从而降低背景噪声，使得检测灵敏度和准确性大幅度提升。

本申请的试剂盒及检测方法，可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间。本申请中，“血液”和“外周血”为相同概念。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例的检测方法主要包括，从血液中提取游离循环DNA，以cfDNA为模板，进行亚硫酸氢盐处理，然后利用设计的CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3 和SOCS1五个基因和内参基因β-Actin的特异性检测引物和探针对cfDNA进行 ddPCR扩增，并对扩增产物进行检测，最后对荧光信号数据进行分析，获得 CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1五个基因和内参基因β-Actin 荧光信息。从而分析MI值。本例采用了五个样本进行试验，五个样本都是选用深圳海普洛斯医学检验实验室结直肠癌项目临床上CIMP分型的样本，样本编号为20190812011-b、20190813011-a、20190822011-b、20190824011-c， 20190811011-b用于检测。具体试验如下：

一、CIMP分型结直肠癌患者外周血提取cfDNA

1.血液样本处理

获得血液后，在4h内处理做以下处理：取外周血10mL，1600g，4℃离心 10min，分离为血浆和血细胞，血细胞于-80℃保存；将上清液，即血浆，进行第二次离心，16000g，4℃离心10min，移取上清液转并移至保存管中，置于-80℃保存备用，即血浆样本。

2.cfDNA提取

本例具体采用核酸提取纯化试剂盒(重鼎，ZD-YL-Midi-40)进行cfDNA 提取，优化提取步骤如下：

(1)取10mL离心管，加入20μL Proteinase K，再加入2mL“1.血液样本处理”收集的血浆样本，加入2mL溶液GH，漩涡混合15s；然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min。

(2)上述混合液中加入2mL异丙醇，充分漩涡混合；然后，置于4℃冰箱中孵育10min；将混合液移入套有收集管的中量离心柱，10000rpm离心1min，弃去收集管中废液。

(3)向步骤(2)的离心柱中加入2.5mL溶液W1A，10000rpm离心3min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回；其中，溶液W1A按照说明书要求加入无水乙醇。

(4)向步骤(3)的离心柱中加入4mL溶液W2，10000rpm离心3min，去除废液；其中，溶液W2按照说明书要求加入无水乙醇。

(5)向步骤(4)的离心柱中加入2mL无水乙醇，10000rpm离心3min，将离心柱小心取出，转移至新的15mL离心管中，开盖室温放置10min，使残余乙醇挥发。

(6)向离心柱中加入提前预热的TE溶液450μL，室温静置5min后， 10000rpm离心3min。

(7)弃去15mL离心管内的中量离心柱，向管内洗脱液中加入450μL溶液 BK与450μL无水乙醇，涡旋混匀，混匀后室温静置5-10min。

(8)取含有收集管微量离心柱，将700μL步骤(7)的混匀液移入微量离心柱中，封盖13000rpm离心30s，弃废液；重复操作，直至混匀液全部过柱。

(9)13000rpm，空转2min，然后室温静置5min，挥发残留乙醇。

(10)将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中，然后向柱中加入43μL 溶液NFwater，室温静置5min后13000rpm离心2min；其中，溶液NF water 可50～60℃预热，提高洗脱效率。

(11)将离心下来的溶液重新移入离心柱内，将离心柱放在离心管中，开盖室温静置2min，13000rpm离心3min，滤液即提取的cfDNA。

采用Life Qubit 2.0测定提取的cfDNA的浓度，Agilent 4200 TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小。结果如表1所示。

表1 cfDNA浓度及片段大小

二、亚硫酸氢盐转化处理

(1)试剂准备：

准备TET2Buffer：加100μL的TET2 ReactionBuffer到TET2 ReactionBufferSupplement管子中并混匀，制备好的buffer在-20℃保存，4个月内使用。

将浓度为500mM的Fe(II)Solution 1μL加入1249μL的水中进行稀释，即用即配，剩余丢弃。

(2)氧化

在冰上配制以下体系并加入29μL的DNA样品中：10μL的TET2 Reaction Buffer(reconstituted)、1μL的Oxidation Supplement、1μL的Oxidation Enhancer 以及4μL的TET2。

彻底混匀后加入5μL稀释好的Fe(II)Solution。彻底混匀，稍微离心后放入 PCR仪反应，37℃，1小时。

反应结束后，取出样品置于冰盒上，加入1μL的StopReagent，混匀后放PCR 仪反应，反应程序：37℃，30分钟；4℃，∞。

(3)纯化

加入90μL的AMPure XP beads进行纯化，用17μL Nucleasewater进行洗脱，移取16μL纯化后的样品到新的PCR管中。

(4)变性

把PCR仪预热至85℃；在16μL样品中加入4μL甲酰胺，混匀，稍微离心；将样品放入PCR仪中反应85℃，10分钟；然后马上放于冰上。

(5)脱氨基

在冰上配制以下体系，并加入上述20μL样品中：Nuclease-free water 68μL、APOBEC Reaction Buffer 10μL、BSA 1μL、APOBEC 1μL，总体积100μL。

彻底混匀后离心，置于PCR仪中反应，反应程序：37℃，3h；4℃，∞

(6)纯化

反应结束后，加入100μL的AMPureXPbeads进行纯化，用21μL的 Nucleasewater进行洗脱，移取20μL纯化后的样品到新的PCR管中。

三、靶标基因和内参β-Actin基因扩增检测

本例的检测采用针对CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1五个基因和内参基因β-Actin设计的引物和探针。具体的，CACNA1G基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.3所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.4所示序列；IGF2基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6 所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.7所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.8所示序列；NEUROG1基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.11所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.12所示序列；RUNX3 基因扩增引物的上下游引物分别为SEQID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.15所示序列，非甲基化状态检测探针为 SEQ ID NO.16所示序列；SOCS1基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示序列，其甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.19所示序列，非甲基化状态检测探针为SEQ ID NO.20所示序列；β-Actin基因扩增引物的上下游引物分别为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示序列，其检测探针为SEQ ID NO.23所示序列。本例所用的引物以及检测探针均由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成，引物和探针序列如表2所示。

表2靶标基因和内参基因扩增引物和探针

PCR反应体系配制：2×ddPCR supermix for probes(no dUTP)10μL、1μL的Primer-F1(终浓度为10μM)、1μL的Primer-R1(终浓度为10μM)、0.5μL的 Methlated-probe1(终浓度为10μM)、0.5μL的Unmethlated-probe2(终浓度为 10μM)、1μL的β-Actin-F1(终浓度为10μM)、1μL的β-Actin-R1(终浓度为10μM)、 0.5μL的β-Actin-probe(终浓度为10μM)，以及4.5μL的亚硫酸氢盐转化处理的 DNA模板。

其中，Primer-F1和Primer-R1为CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、 SOCS1五个基因中的一个基因的上下游引物，Methlated-probe1代表与Primer-F1 和Primer-R1对应的基因的甲基化探针，Unmethlated-probe2代表与Primer-F1 和Primer-R1对应的基因的非甲基化探针，β-Actin-F1和β-Actin-R1为内参β-Actin 基因的上下游引物，β-Actin-probe为内参β-Actin基因的检测探针。

PCR反应体系涡旋仪混合，于掌式离心机离上离心，去除气泡，然后将反应体系转移至ddPCR检测区。

ddPCR检测阶段，该阶段在ddPCR检测区完成，具体如下：

(1)制备微滴

A.取出微滴生成卡，按操作要求组装，在Oil加样孔中加入油，70μL/孔；

B.在Sample加样孔中加入20μL上述配制的反应体系，盖上封条，于微滴生成器中反应。由于微滴生成时，Oil孔与sample孔不能为空，故空白的Oil孔加入70μL油，Sample孔用25μL水代替。

(2)PCR扩增

A.用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内，吸取和转移微滴时需缓慢操作，防止产生气泡，单次操作用时约5s。

B.用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s。

C.完成封膜后，将96孔板置于梯度扩增仪(T100 Thermal Cycler)进行PCR 反应，PCR条件如下：

95℃变性10min；然后进入35个循环：94℃变性30sec、60℃退火1min；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

(3)微滴检测

将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪，设置反应参数，编辑样品信息，对所有样本进行荧光检测；微滴读取结束后，保存数据，进行下一步分析。

四、基因扩增检测荧光信号的读取和数值分析

1.荧光信号的读取

(1)打开QuantaSoft软件，导入样本检测数据，选择Analyze模块开始对数据进行分析。

(2)首先需要确认所有样本类型的微滴生成数要在10000以上，只有在这个范围内检出的数据的CV值能控制在1.6％以内。然后选择1DAmplitude，确定荧光阈值，以空白对照组划定探针的阈值。

(3)QuantaSoft软件计算突变。

2.数值结果分析

本例的五个结直肠癌样本的检测结果如表3和表4所示。

表3结直肠癌样本的分型判定结果

表4结直肠癌样本五个基因的详细检测结果

本例对结直肠癌患者样本的ctDNA进行检测，模板cfDNA投入量均为 10ng；五个靶标基因中，只要其中一个靶标基因的MI值大于或等于0.5就可以认定为CIMP分型。检测结果显示，5个样本MI值都大于0.5，均为CIMP分型，与预期一致。

本例的CIMP分型检测方法，以ctDNA为检测对象，具有灵敏度高的优势，可以从微量的cfDNA中检测出ctDNA甲基化状态。采用本例的检测方法，抽取 15mL外周血液，通过对ctDNA的检测分析，动态评估癌症发展变化，制定精准医疗方案，整个检测过程无创伤，对病患没有任何负面影响；并且，本例的检测方法，可以准确的检测出CIMP分型，这为个体化精准用药指导提供了重要的参考依据。

本例的检测方法，结合国际领先的基因捕获技术，检测血液ctDNA的甲基化变异情况，具有10,000×以上的测序深度，测序的灵敏度能达到0.01％，能给出最精准的用药指导信息。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。