一组鳖科动物线粒体全基因组扩增通用引物

摘要

本发明公开了一组鳖科动物线粒体全基因组扩增通用引物，属于分子生物技术领域；具体步骤包括：鳖科动物基因组总DNA的提取，线粒体基因组全序列通用扩增引物的设计，以及线粒体基因组DNA的PCR扩增和测序。鳖科动物的线粒体全基因组序列扩增引物由11对单链寡聚核苷酸组成。采用本发明的通用扩增引物可以快速高效地扩增多种鳖科动物的线粒体基因全序列，为未知鳖科动物的种质鉴定，物种资源保护，以及系统进化研究提供了有利的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一组鳖科动物线粒体全基因组扩增通用引物。

背景技术

线粒体基因组作为细胞核外的一种遗传系统，具有完整性、多态性、自主性和小型性等独特的优点。随着分子生物学的快速发展，线粒体基因组成为研究进化及物种起源的理想工具。利用细胞器基因组来进行系统进化研究有着几个优势：(1)细胞器DNA在总DNA中的拷贝数较多，便于通过测序获得；(2)细胞器DNA多为母系遗传，很少或不存在同源重组，基因结构及基因含量较为保守；(3)细胞器基因组的序列较长，能够提供大量的分类信息，解决近缘物种分类与鉴定的困难。

线粒体基因组的序列获取通常使用Sanger法测序技术。测序策略通常为以下三种：(1)分离质体和线粒体DNA(通常利用氯化铯密度梯度离心)，然后构建质粒文库，采用WGS鸟枪法进行测序(Reith et al.,1995)；(2)构建物种的BAC或Fosmid文库，利用细胞器DNA片段作为探针在文库中挑取含目的克隆片段。这一类大片段文库构建成本较高，耗时较长，而且准确性也受质疑(Cattolico et al.,2008)；(3)利用近缘物种已有的质体和线粒体序列的保守序列来设计引物，采用长片段PCR(Long PCR)或PCR的方法进行扩增与测序(Heinze,2007)，这是目前运用比较多的方法，但仍然存在工作量大，耗时长等问题。

鳖科动物是一类次水生性爬行动物，身体形态和进化地位均较为特化，是进化和发育研究的极好素材。另一方面，该科动物的许多种类都是国家一级和二级保护动物，但该科的物种形态类似，很多分类依据为体表的结节和斑纹，以及骨板的特征，物种鉴定较为困难。因此，在实际应用中，快速获取该科动物的线粒体基因组序列，对于未知样本种质鉴定，物种资源保护，以及系统进化研究具有积极的意义。

发明内容

本发明目的是提供一组鳖科动物线粒体全基因组扩增通用引物，即利用鳖科动物线粒体基因序列保守区设计通用引物，实现鳖科动物各个物种线粒体基因组的快速扩增。同时，本发明对鳖科动物线粒体基因组的不同基因区域进行了划分，实际应用中可根据具体需要扩增相应区域的序列片段。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一组鳖科动物线粒体全基因组扩增通用引物，所述全基因组扩增通用引物组包含11对扩增引物，其序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22所示。

本发明还提供一种扩增鳖科动物线粒体全基因组扩增通用引物的方法，采用上述扩增通用引物，用20μl PCR体系在PCR扩增条件下进行目标片段扩增。

优选的，所述20.5μl PCR体系具体包括：5μl 10×Buffer，8μl dNTP Mix，1μl上游引物，1μl下游引物，0.5μl Taq酶，0.5μl DNA模板，4μl Mg

优选的，所述的PCR扩增条件具体包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，52～66℃退火2min 30s，72℃延伸5min，扩增35～40个循环；最后72℃延伸10min。

本发明公开了以下技术效果：

使用本发明所设计的引物序列，对中华鳖(Pelodiscus sinensis)、鼋(Pelochelys cantorii)、山瑞(Paleasteindachneri)、砂鳖(Pelodiscus axenaria)4个物种进行了线粒体基因组扩增，均得到了完整的线粒体基因组序列。

采用本发明的通用扩增引物可以快速高效地扩增多种鳖科动物的线粒体基因全序列，为未知鳖科动物的种质鉴定，物种资源保护，以及系统进化研究提供了有利的技术手段。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

1、鳖科动物线粒体基因的提取

利用常规方法提取鳖科动物组织样本的总基因组DNA，并将提取的总基因组DNA保存于-20℃条件下备用。组织可为血液，裙边，肌肉或者内脏等。组织建议为新鲜组织，但轻微降解对本发明的应用效果影响不大。

2、鳖科动物线粒体基因组通用引物的设计和合成

(1)从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳖科动物线粒体基因组全序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域，并按照表1合成鳖科动物线粒体通用引物序列；

表1鳖科动物线粒体基因组通用引物序列

(2)利用上述的11对引物，以抽提好的鳖科动物基因组为模板，进行PCR扩增，其中PCR的反应体系按照表2给出的反应体系配制试剂，并根据表3给出的反应程序进行PCR扩增。

表2鳖科动物线粒体通用引物反应体系

§：扩增效果不理想，引物体积可加倍。

表3鳖科动物线粒体通用引物反应程序

注：Ta：表1中各对扩增引物对应的退火温度。

3、PCR扩增产物序列测定和拼接

对于扩增产物进行Sanger测序，得到样本相应基因片段序列，获取全部基因片段序列后，使用DNAstar等序列拼接软件进行序列拼接，即可得到测试样本完整的线粒体基因组。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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