缅甸孔雀鳖线粒体全序列及基于线粒体基因组的鳖类动物祖居地重建

摘要

缅甸孔雀鳖（Nilssonia formosa）是尼氏鳖属的物种，被IUCN红皮书收录，并且被Turtle Conservation Fund列为48个最濒危龟鳖物种之一，本研究首次对其进行测序。另外，鳖超科有2个科共14个属，化石记录最早出现在白垩纪早期的亚洲，而目前鳖类动物化石在所有的大陆上（除南极洲）被发现，为了研究鳖类动物是怎样从亚洲扩散到别的大陆，本文首次基于鳖类动物的线粒体基因组以探索鳖超科的起源和扩散路线。
　　本研究设计了16对引物，采用PCR、LA-PCR和测序技术，对缅甸孔雀鳖的线粒体基因组进行了测序分析。结果显示，其线粒体基因组长度为17150bp，由13个典型的蛋白质编码基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因和一个非编码的控制区（control region, CR）组成。nd3基因中有一个额外碱基“A”的插入。控制区，包含了三个区域：终止相关序列区（TAS）、中央保守区（CD）和保守序列区（CSB）；控制区的5’端，有一段300bp的VNTRs1，基序为CTTTTTTTTTCTCTCCCGCGCCCAAGAGAC ATCAACCCCTCTAATAATTA，重复6次；控制区的3’端，存在一段270bp的VNTRs3，基序为TTATA，重复54次；尚没有发现曾经在中华鳖控制区中报道过的VNTRs2。基于已经测序获得的10种鳖类动物以及从 GenBank下载的马来鳖（Dogania subplana）、印度缘板鳖（Lissemys punctata）和非洲三爪鳖（Trionyx triunguis）共13个鳖类物种的线粒体基因组，本文分析比较了它们控制区的VNTRs和保守序列的特点。结果显示，两爪鳖科的VNTRs和保守序列与其它的鳖科物种相比有很大的不同；在盘鳖亚科中，印度缘板鳖和缅甸缘板鳖（Lissemys scutata）的控制区缺失VNTRs1；在鳖亚科中，斑鳖（Rafetus swinhoei）、山瑞鳖（Palea steindachneri）、中华鳖（Pelodiscus sinensis）、小头鳖（Chitra indica）、马来鳖和缅甸孔雀鳖具有相同的CSB-F和CSB-2保守序列。另外，佛罗里达鳖（Apalone ferox）和鼋（Pelochelys cantorii）有相同的CSB-F和CSB-2保守序列，并且具有相同的VNTRs1和相似的VNTRs3。本研究选取鳖超科的14个物种，能够覆盖除了圆鳖属和盘鳖属以外几乎全部的鳖超科，以完成鳖类动物的分歧时间和祖居地构建。分歧时间和祖居地构建分别通过 Beast和 RASP软件计算。分歧时间和祖居地构建结果推测鳖超科起源于约128MA的亚洲，且鳖类物种的演化事件主要集中发生于两个阶段：白垩纪晚期-古近纪和中新世。滑鳖属与斑鳖属+华鳖属+山瑞鳖属+纹鳖属+亚洲鳖属+尼氏鳖属之间的分歧（65MA），三爪鳖属与小头鳖属+鼋属之间的分歧（55MA），山瑞鳖属与亚洲鳖属+尼氏鳖属+纹鳖属之间的分歧（46MA），小头鳖属和鼋属之间的分歧（40MA）以及印度缘板鳖和缅甸缘板鳖之间的分歧（37MA）发生在白垩纪晚期-古近纪；尼氏鳖属和亚洲鳖属之间的分歧（24MA），佛罗里达鳖和刺鳖之间的分歧（22MA）发生在中新世。结合鳖类动物的分歧时间和祖居地构建的分析结果，推测鳖超科可能通过四条路线从亚洲扩散出去。此外，在晚期中生代或早期新生代期间（65MA），北美洲与欧亚大陆之间东西部的压缩使地壳距离缩短形成微陆地，这与滑鳖属的祖先入侵到北美洲的时间约65MA是相符合的；印度向北运动可能与亚洲接触两次，第一次发生在约55MA，为小头鳖到达印度板块提供条件（55MA）；然后印度次大陆一直沿着东南亚向北漂流直到最后与亚洲强烈撞击，引起小头鳖和鼋之间的分歧（40MA）以及印度缘板鳖和缅甸缘板鳖之间的分歧（37MA）。扩散事件的时间与地理事件的时间是一致的，这为分歧时间的准确性提供证据。

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第一章 鳖类动物系统发生的研究综述

1 现存鳖类动物的分类和分布

2 现存鳖类动物的系统发生学研究

2.1 基于形态学的系统发生学研究

2.2 基于分子学的系统发生研究

2.3 两爪鳖科和鳖科之间的系统发生关系

2.4 缅甸孔雀鳖的系统发生研究

3 鳖类动物的起源研究

4 本研究的意义和目的

参考文献：

第二章 缅甸孔雀鳖线粒体全基因组的测定及分析

1 材料与方法

1.1实验材料和总基因组的提取

1.2 引物设计

1.3 PCR扩增

1.4 DNA序列数据处理及分析

1.5 鳖类动物控制区序列的比较分析

2 结果

2.1 缅甸孔雀鳖线粒体基因组的排布和结构

2.2 缅甸孔雀鳖蛋白质编码基因

2.3 缅甸孔雀鳖线粒体基因组的rRNA和tRNA基因

2.4 缅甸孔雀鳖线粒体基因组的非编码序列

2.5 鳖类代表物种控制区的组成与结构的比较

2.6 控制区VNTRs的特征

3.讨论

3.1缅甸孔雀鳖线粒体基因组特点分析

3.2 13种鳖类动物控制区特点分析

第三章 基于线粒体基因组探讨鳖类动物祖居地重建

1 方法

1.1 用于聚类分析的物种选择

1.2 基于线粒体基因组的系统发生分析方法和数据分区

1.3基于线粒体基因组的鳖类动物属间物种的分歧时间估算

1.4 基于线粒体基因组的鳖类动物祖居地构建

2 结果

2.1 鳖类物种的系统发生关系

2.2分歧时间的估算

2.3祖居地重建

3讨论

3.1分歧时间和鳖类动物的迁徙

3.2 与地理学事件相关的迁徙事件分歧时间

参考文献：

致谢