一种如皋黄鸡的鉴定方法

摘要

本发明涉及一种家禽品种鉴定的方法，具体涉及一种如皋黄鸡的鉴定方法。本发明方法基于如皋黄鸡特异性INDEL位点以及特异性SNP位点进行鉴定，所述特异性位点均具有较高的如皋黄鸡鉴定率，基于其一种或几种特异性位点进行鉴定，准确率高，结果更为可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及一种家禽品种鉴定的方法，具体涉及一种如皋黄鸡的鉴定方法。

背景技术

如皋黄鸡，因产地而得名，中心产区为江苏省如皋市境内。该鸡是全国农产品地理标志产品，2009年列为国家级畜禽遗传资源。如皋黄鸡属于肉蛋兼用型地方鸡种，肉品和蛋品均上乘，主要用来生产草鸡蛋、优质鸡。自20世纪70年代以来，如皋黄鸡已先后被江苏、浙江、上海、安徽、福建、江西、湖南、湖北及港澳等全国20多个省、市的60多个地、县引进饲养，反应良好。在推广的过程中，时常出现以杂交或外貌近似品种冒充如皋黄鸡的现象。

然而，目前尚未有针对如皋黄鸡品种有效鉴定的方法。

发明内容

本发明主要目的是提供一种如皋黄鸡鉴定的方法，本发明方法基于如皋黄鸡特异性INDEL位点以及特异性SNP位点进行鉴定，所述特异性位点均具有较高的如皋黄鸡鉴定率，基于其一种或几种特异性位点进行鉴定，准确率高，结果更为可靠。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种如皋黄鸡鉴定的方法，包括鉴定以下特异性INDEL位点：

RG_tag2位于2号染色体122672840处，基因CA13与基因CA3A之间，如皋黄鸡基因型为插入一段序列：ATTT//ATTT。

进一步地，所述方法还包括鉴定以下任意一种或几种特异性SNP位点：

RG_tag1位于2号染色体60449199处，KIF13A基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag3位于3号染色体33169622处，基因CRIM1与基因SULT6B1之间，如皋黄鸡基因型为AA；

RG_tag4位于3号染色体38660504处，SLC35F3基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag5位于4号染色体4196467处，基因FHL1的5‘UTR区以及基因SLC9A6的3’UTR区，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag6位于5号染色体38292725处，PROX2的基因UTR3区，如皋黄鸡基因型为TT；

RG_tag7位于5号染色体49784217处，CINP基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag8位于8号染色体29949231处，TNNI3K基因第3内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag9位于10号染色体3397646处，基因LINGO1与基因HMG20A之间，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag10位于24号染色体4938416处，基因CADM1与基因LOC770165之间，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag11位于28号染色体3340013处，THOP1基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag12位于Z号染色体9794706处，基因ZFR2与基因SUB1之间，如皋黄鸡基因型为TT；

RG_tag13位于Z号染色体19199901处，ZSWIM6基因第12内含子，如皋黄鸡基因型为AA；

RG_tag14位于Z号染色体56669873处，PRRC1基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为TT。

进一步地，检测所述RG_tag2位点所用引物RG_P2f和RG_P2r：

RG_P2f：GAACTCCTCCATCCTCCT；

RG_P2r：AGCAGAATCCAGCACATC。

进一步地，鉴定以下特异性SNP位点：RG_tag1，RG_tag3，RG_tag4，RG_tag5，RG_tag6，RG_tag7，RG_tag8，RG_tag14。

进一步地，检测以下特异性SNP位点的引物为：

用于检测所述标记RG_tag1的引物为RG_P1f和RG_P1r所示两条单链DNA：

RG_P1f：CTGCTATATTCCTTGCTTGTG；

RG_P1r：ATGGTCTTACTGTACTTCTGAG；

用于检测所述标记RG_tag3的引物为RG_P3f和RG_P3r所示两条单链DNA：

RG_P3f：CAGAGCCTACAGAGTTAGAG；

RG_P3r：CAAGGTGGAGGATGACATT；

用于检测所述标记RG_tag4的引物为RG_P4f和RG_P4r所示两条单链DNA：

RG_P4f：TGGTGTCACTTGGTTAGC；

RG_P4r：GGTCGCATTATACTTCCTATG；

用于检测所述标记RG_tag5的引物为RG_P5f和RG_P5r所示两条单链DNA：

RG_P5f：CAGTCACGGCTCAATTAGTA；

RG_P5r：ACGACAACTCAATTCACAGA；

用于检测所述标记RG_tag6的引物为RG_P6f和RG_P6r所示两条单链DNA：

RG_P6f：GACGCAATGGAGACAGAG；

RG_P6r：TATAGACAGACCGCAGAGA；

用于检测所述标记RG_tag7的引物为RG_P7f和RG_P7r所示两条单链DNA：

RG_P7f：TGGCACAACTTGATGATGA；

RG_P7r：CACTGTTATACCTTCTTCTGTC；

用于检测所述标记RG_tag8的引物为RG_P8f和RG_P8r所示两条单链DNA：

RG_P8f：GATCAGTTGGCTGTTCAC；

RG_P8r：CATTACCGTGCTTGACTTAT；

用于检测所述标记RG_tag9的引物为RG_P9f和RG_P9r所示两条单链DNA：

RG_P9f：AGTCTGCTGAGTGCTGTA；

RG_P9r：AGGAATGCTGTCATCTGAAT；

用于检测所述标记RG_tag10的引物为RG_P10f和RG_P10r所示两条单链DNA：

RG_P10f：ATGGATGGCGAAGAGGTA；

RG_P10r：GGTATGAGGCTGTAATGGTA；

用于检测所述标记RG_tag11的引物为RG_P11f和RG_P11r所示两条单链DNA：

RG_P11f：CAGTGGTAGCAAGGAATGT；

RG_P11r：AGCAGGTCTGTGTTAAGTG；

用于检测所述标记RG_tag12的引物为RG_P12f和RG_P12r所示两条单链DNA：

RG_P12f：CACCACCACAACTACACA；

RG_P12r：TAACTGCCTGAGAAGACTG；

用于检测所述标记RG_tag13的引物为RG_P13f和RG_P13r所示两条单链DNA：

RG_P13f：CCTTGTTGTTGTTGTTGTTG；

RG_P13r：TGCTTGAAGTATGTCTGGAA；

用于检测所述标记RG_tag14的引物为RG_P14f和RG_P14r所示两条单链DNA：

RG_P14f：TAGAATTGCTCAGGTTGGAA；

RG_P14r：GTGCTTACTAATCAGGATACTC。

本发明还提供一种引物组合，其包括引物RG_P2f和RG_P2r。

进一步地，所述引物组合还包括RG_P1f和RG_P1r，RG_P3f和RG_P3r，RG_P4f和RG_P4r，RG_P5f和RG_P5r，RG_P6f和RG_P6r，RG_P7f和RG_P7r，RG_P8f和RG_P8r，RG_P9f和RG_P9r，RG_P10f和RG_P10r，RG_P11f和RG_P11r，RG_P12f和RG_P12r，RG_P13f和RG_P13r，RG_P14f和RG_P14r引物对中的一种或几种。

本发明还提供以上所述引物组合在检测鸡的特异性遗传位点及鉴定如皋黄鸡品种中的应用。

本发明还提供包括以上所述引物组合的试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了可有效用于如皋黄鸡品种鉴定的特异性INDEL位点，通过检测，该位点对如皋黄鸡的鉴定率高达100％。

为了进一步提高如皋黄鸡品种鉴定的准确率，本发明还提供了多个特异性SNP位点，所述SNP位点同样对如皋黄鸡具有较高的鉴定率，因此本发明以所述特异性INDEL位点并辅助多个SNP位点对如皋黄鸡进行鉴定，准确率将会更高，鉴定结果更为可靠。本发明为如皋黄鸡的鉴定提供了一种准确可靠的方法，适于推广应用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1一种如皋黄鸡的鉴定方法

所述方法为：包括鉴定以下特异性INDEL位点：

RG_tag2位于2号染色体122672840处，基因CA13与基因CA3A之间，如皋黄鸡基因型为插入一段序列：ATTT//ATTT。

检测所述RG_tag2位点所用引物RG_P2f和RG_P2r，碱基序列如下表1所示。

实施例2一种如皋黄鸡的鉴定方法

所述方法为：包括鉴定以下特异性INDEL位点及SNP位点：

RG_tag2位于2号染色体122672840处，基因CA13与基因CA3A之间，如皋黄鸡基因型为插入一段序列：ATTT//ATTT；

RG_tag1位于2号染色体60449199处，KIF13A基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag3位于3号染色体33169622处，基因CRIM1与基因SULT6B1之间，如皋黄鸡基因型为AA；

RG_tag4位于3号染色体38660504处，SLC35F3基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag5位于4号染色体4196467处，基因FHL1的5‘UTR区以及基因SLC9A6的3’UTR区，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag6位于5号染色体38292725处，PROX2的基因UTR3区，如皋黄鸡基因型为TT；

RG_tag7位于5号染色体49784217处，CINP基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag8位于8号染色体29949231处，TNNI3K基因第3内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag9位于10号染色体3397646处，基因LINGO1与基因HMG20A之间，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag10位于24号染色体4938416处，基因CADM1与基因LOC770165之间，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag11位于28号染色体3340013处，THOP1基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag12位于Z号染色体9794706处，基因ZFR2与基因SUB1之间，如皋黄鸡基因型为TT；

RG_tag13位于Z号染色体19199901处，ZSWIM6基因第12内含子，如皋黄鸡基因型为AA；

RG_tag14位于Z号染色体56669873处，PRRC1基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为TT。

检测以上所述特异性SNP位点的引物为：

用于检测所述标记RG_tag1的引物为RG_P1f和RG_P1r所示两条单链DNA；

用于检测所述RG_tag2位点所用引物RG_P2f和RG_P2r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag3的引物为RG_P3f和RG_P3r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag4的引物为RG_P4f和RG_P4r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag5的引物为RG_P5f和RG_P5r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag6的引物为RG_P6f和RG_P6r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag7的引物为RG_P7f和RG_P7r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag8的引物为RG_P8f和RG_P8r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag9的引物为RG_P9f和RG_P9r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag10的引物为RG_P10f和RG_P10r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag11的引物为RG_P11f和RG_P11r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag12的引物为RG_P12f和RG_P12r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag13的引物为RG_P13f和RG_P13r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记RG_tag14的引物为RG_P14f和RG_P14r所示两条单链DNA

以上所述引物序列、扩增片段长度以及退火温度，具体如下表1所示。

表1.检测如皋黄鸡品种特异性标记所用扩增引物

实施例3一种如皋黄鸡的鉴定方法

所述方法为：包括鉴定以下特异性INDEL位点及SNP位点：

RG_tag2位于2号染色体122672840处，基因CA13与基因CA3A之间，如皋黄鸡基因型为插入一段序列：ATTT//ATTT；

RG_tag1位于2号染色体60449199处，KIF13A基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag3位于3号染色体33169622处，基因CRIM1与基因SULT6B1之间，如皋黄鸡基因型为AA；

RG_tag4位于3号染色体38660504处，SLC35F3基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag5位于4号染色体4196467处，基因FHL1的5‘UTR区以及基因SLC9A6的3’UTR区，如皋黄鸡基因型为GG；

RG_tag6位于5号染色体38292725处，PROX2的基因UTR3区，如皋黄鸡基因型为TT；

RG_tag7位于5号染色体49784217处，CINP基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag8位于8号染色体29949231处，TNNI3K基因第3内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

RG_tag14位于Z号染色体56669873处，PRRC1基因第2内含子，如皋黄鸡基因型为TT。

实施例4一种引物组合

所述引物组合包括：RG_P1f和RG_P1r，RG_P2f和RG_P2r，RG_P3f和RG_P3r，RG_P4f和RG_P4r，RG_P5f和RG_P5r，RG_P6f和RG_P6r，RG_P7f和RG_P7r，RG_P8f和RG_P8r，RG_P9f和RG_P9r，RG_P10f和RG_P10r，RG_P11f和RG_P11r，RG_P12f和RG_P12r，RG_P13f和RG_P13r，RG_P14f和RG_P14r所示引物对。

所述引物组合用于如皋黄鸡特异性遗传位点的检测及如皋黄鸡品种的鉴定，或者用于制备鉴定如皋黄鸡的试剂盒。

实施例5一种引物组合

所述引物组合包括：RG_P1f和RG_P1r，RG_P2f和RG_P2r，RG_P3f和RG_P3r，RG_P4f和RG_P4r，RG_P5f和RG_P5r，RG_P6f和RG_P6r，RG_P7f和RG_P7r，RG_P8f和RG_P8r，RG_P14f和RG_P14r所示引物对。

所述引物组合用于如皋黄鸡特异性遗传位点的检测及如皋黄鸡品种的鉴定，或者用于制备鉴定如皋黄鸡的试剂盒。

实验例

应用上述14个标记对20份如皋黄鸡血样和360份非如皋黄鸡血样进行鉴定。具体操作步骤如下：

以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。

PCR扩增过程：

1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各lOng,5μL 2×

power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足；

2)反应程序:首先94℃变性30s,51.0-56.1℃退火30s,72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s,51.0-56.1℃退火30s,72摄氏度延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。

扩增产物送至测序公司进行DNA序列多态性检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型依据。各特异性位点的鉴定率如下表2所示。

表2.如皋黄鸡品种特异性标记鉴定率

由表2可知，本发明所述特异性标记位点对如皋黄鸡的鉴定率均在85％及以上，可有效用于如皋黄鸡的鉴定。而筛选得到的其它特异性位点如Tag3_3、Tag5_2、Tag7_1、Tag9_2、Tag15_1由于对如皋黄鸡的实际鉴定率较低而淘汰。

Tag3_3、Tag5_2、Tag7_1、Tag9_2、Tag15_1具体位置信息为：

Tag3_3位于鸡3号染色体，物理位置38286930处，基因RBM34第10内含子，如皋黄鸡基因型为AA；

Tag5_2位于鸡5号染色体12426305处，基因KCNC1第1内含子，如皋黄鸡基因型为TT；

Tag7_1位于鸡7号染色体，物理位置29865600处，基因NCKAP5第2内含子，如皋黄鸡基因型为TT；

Tag9_2位于鸡9号染色体19078417处，基因NLGN1第5内含子，如皋黄鸡基因型为CC；

Tag15_1位于鸡15号染色体6864614处，基因CORO1C第8内含子，如皋黄鸡基因型为AA。

用于检测Tag3_3、Tag5_2、Tag7_1、Tag9_2、Tag15_1的引物如下表3所示。

表3

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。