一种利用MSH4基因中SV313分子标记区分大白猪和江口萝卜猪的检测技术

摘要

本发明公开了一种利用MSH4基因中SV313分子标记区分大白猪和江口萝卜猪的检测技术，其特征在于：SV313位于猪参考基因组Sscrofa 11.1chr6:137499097‑137499409，共313bp，存在MSH4基因第6内含子中，SV313缺失基因定为D，正常不缺失的基因定为I。应用本发明所述的检测技术，得出大白猪的D等位基因频率极显著低于江口萝卜猪(P<0.01)；应用分子标记SV313可以区分大白猪和江口萝卜猪。

说明书

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分大白猪和江口萝卜猪的分子标记及其应用技术。

背景技术

家猪是由野猪经长期驯化而形成，在进化和选择过程中，遗传信息也发生了很大的改变，彼此之间逐渐在头型体型、肉质、生长速度和繁殖能力等方面形成差异。虽然我国是世界上养猪数量最大，品种类型最多的国家，但全球分布前列的猪品种是大白猪、杜洛克、长白猪、皮特兰和汉普夏等，它们主要来至欧洲或者美国。由于我国地方猪品种的选育和改良相关工作起步较晚，加之我国长期以追求产量增长为目标以提高经济效率，使得我国猪养产业重引进、轻培育，造成大量地方猪品种与引进猪种混杂，遗传资源流失。

江口萝卜猪是贵州省地方猪品种之一，主要分布在江口、松桃等地，因体躯丰圆外形像萝卜，肉质肥而不腻如食萝卜，故称之“萝卜猪”，当地也俗称“钻子头”，具有适应性强、耐粗料、骨细肉嫩、易育肥等优点。2003年被列入《中国家畜禽地方品种资源图谱》，2011年被收录于《中国畜禽遗传资源志·猪志》，2014年获批实施地理标志产品保护，2017年也被《贵州地方畜禽遗传资源志》记载。

从单一对DNA、RNA和蛋白质序列的分析到功能基因组学研究，使很多与疾病和性状等有关的遗传变异变得越来越清晰。结构变异(structural variation，SV)是指基因组上大片段DNA序列发生缺失(Deletion)、插入(Insertion)、易位(Translocation)、倒置(Inversion)、重复(Duplications)和一些复杂的变异情况。在基因组中，虽然结构变异的数量远远小于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的数量，但它所占基因总长度和对基因的转录、翻译等影响远大于SNP，这与SV上所含的遗传信息密切相关。例如，公猪TEX14基因的第27外显子中插入51bp序列，导致外显子的差异剪接，提前产生翻译的终止密码子，造成生精阻滞，而这51bp序列在其它所有试验动物的第27内含子中也能检测到，这可能是重复事件的结构变异(Sironen et al.,2011)。αs1-酪蛋白(caseinalpha s1，CSN1S1)基因中11bp的多态性与山羊产仔数、产奶性能和生长性状密切相关(Zhang et al.,2019)。

本发明所述的结构变异主要指基因MSH4的第6内含子中的313bp序列发生缺失或缺失的变异类型。MSH4(mutS homolog 4)是Mut S同源蛋白DNA错配修复蛋白家族中的成员，在睾丸和卵巢组织中特异性表达，但卵巢中表达水平较低(骆骅等，2013)；它参与减数分裂时期的同源染色体联会，MSH4基因失活会引起精母细胞发育停滞，从而导致雄性不育，并且有研究显示睾丸组织中MSH4基因的低水平表达与犏牛雄性不育相关(曾琴等，2013)。生物信息学分析，MSH4基因中的SV313缺失区间位于猪健康、肉质、生长和繁殖的QTL区；预测含1个ESE和ISE元件；含1个短散在序列元件序列和(T)n的简单重复序列。前期实验中我们发现，在香猪ID型睾丸组织的mRNA中只检测到缺失型转录本，说明在杂合型个体中优先选择缺失型，表明缺失有利于MSH4基因mRNA的转录。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种利用MSH4基因中SV313分子标记区分大白猪和江口萝卜猪的检测技术。

本发明的技术方案是：一种区分大白猪和江口萝卜猪的结构变异SV313，位于猪参考基因组Sscrofa 11.1的chr6:137499097-137499409(MSH4基因第6内含子中)，该结构变异有三种基因型，分别命名为II、ID和DD型，其中II为正常基因型、DD为纯合的缺失型、ID为杂合缺失型。

本发明提供了用于检测猪品种SV313基因型的一对引物，所述的引物分别为：上游引物MSH4-F1：5’-AAAGTAGTACCAGCAGAACCTAGATAGAT-3’，下游引物MSH4-R1：5’-GAGGTAGAAAAGGTGACGAGACAG-3’，能特异性扩增出两种大小不同条带，分别为1183bp和870bp，对应序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为两者的差异序列。

本发明还提供了猪群体中检测所述结构变异SV313基因型的方法。

所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取大白猪和江口萝卜猪的基因组DNA；

(2)以上述2个猪品种的基因组DNA为模板，分别利用特异性引物MSH4-F1和MSH4-R1，进行PCR扩增；

(3)根据1.0％含核酸染料的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断SV313的基因型。

步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，即：

进行PCR采用的反应条件：

本发明进一步提供所述结构变异在区分江口萝卜猪和大白猪中的应用技术，包括以下步骤：

(1)采用PCR技术检测结构变异SV313的基因型分布；

(2)应用SPSS v26.0进行卡方检验，分析大白猪和江口萝卜猪在SV313等位基因分布频率是否有明显差异。

(3)根据结构变异SV313的基因型和等位基因频率的不同区分江口萝卜猪和大白猪。

本发明所述结构变异SV313可作为区分大白猪和江口萝卜猪的分子标记。

本发明的有益效果：(1)本发明提供的分子标记可不受猪的年龄、性别和饲养等因素的限制，可用于江口萝卜猪和大白猪的个体选择。

(2)本发明所建立的区分大白猪与江口萝卜猪的分子标记SV313方法准确可靠，操作简便，普通实验就能完成检测工作。

(3)结构变异SV313分子标记可辅助江口萝卜猪的选育。

附图说明

图1为本发明实施例1中SV313基因型分型结果，M泳道为D2000；1、2泳道为ID型；3、4泳道为DD型；5、6泳道为II型；

图2为本发明实施例2中SV313在大白猪和江口萝卜猪的基因型和等位基因频率分布。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1区分猪品种的分子标记SV313的检测技术，步骤如下：

1、基因组DNA的提取

本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

1)处理材料

提取材料为血液时，可直接使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液GA补足。

提取材料为动物组织时(脾组织用量应少于10mg)打碎处理为细胞悬浮液，然后10000rpm(11200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

注意：去除RNA，可加入4μL RNaseA溶液，振荡15sec，室温放置5min。

2)提取血液基因组时，加入20μL蛋白酶K，混匀，即可继续进行下一步；提取组织基因组时，加入蛋白酶K并混匀后，于56.0℃水浴2-4h(每小时混匀样品2～3次)直至组织块完全溶解；

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70.0℃水浴10min，可见溶液变清亮；

4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀；

5)将步骤4)所得的溶液和沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

8)重复操作步骤7)一次；

9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附柱中部悬空滴加50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再重复加入吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm离心2min；

12)基因组DNA放于4.0℃备用或-20.0℃保存。

2、目标序列的扩增

本发明DGKK基因中SV313区间位于猪参考基因组Sscrofa 11.1的chr6:137499097-137499409，使用Premier 5.0软件设计两条特异性引物，上游引物MSH4-F1：5’-AAAGTAGTACCAGCAGAACCTAGATAGAT-3’，下游引物MSH4-R1：5’-GAGGTAGAAAAGGTGACGAGACAG-3’组合进行PCR检测，目的片段长度为1183bp或870bp，测序后得出目标序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。

PCR所使用的扩增体系为20μL，具体如下：

进行PCR采用的反应条件：

3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断

PCR结束后，取4μL PCR产物经1.0％含有核酸染料Gelview的琼脂糖电泳检测，凝胶成像系统记录条带。每个待测样品基因组，以引物MSH4-F1、MSH4-R1组合进行PCR检测。若扩增出单条带且大小为1183bp，将基因型定义为II型；若扩增两条带，一条带大小为1183bp而另一条带为870bp，则基因型定义为ID型；若扩增出单条带而且大小为870bp，将基因型定义为DD型，(如图1所示)。

实施例2 SV313基因型与猪种类型的相关性与检测应用

按照实施例1所述的方法，以采自贵州省铜仁市江口县的萝卜猪42头和毕节市大白猪71头为实验材料，以chr6:137499097-137499409为候选SV313缺失区间，利用PCR技术检测该SV313基因型在2个群体中的分布情况，应用SPSS v26.0软件中的卡方检验分析SV313等位基因分布频率的差异。结果显示，(表1，图2)大白猪和江口萝卜猪中都检测到三种基因型，它们都以DD基因型为主，但大白猪的DD型仅占50.7％，而江口萝卜的DD型高达95.2％，差异较明显；大白猪的D等位基因频率极显著低于江口萝卜猪(P<0.01)。

表1 SV313在大白猪和江口萝卜猪中基因型和等位基因频率

备注：P<0.01表示差异极显著。

序列表

<110>贵州大学

<120>一种利用MSH4基因中SV313分子标记区分大白猪和江口萝卜猪的检测技术

<160>5

<210>1

<211>1183

<212>DNA

<213>SV313正常基因型（不缺失）碱基序列

<400>1

AAAGTAGTACCAGCAGAACCTAGATAGATCTAAACTGTTCTTGAAGATTAAAATAAATAA60

CAAGCAGGAGTTCCTGTCGTGGCTCAGTGGTTAACGAATCCGACTAGGAACCATGAGGTT120

GCGGGTTCGATCCCTGGCCTTGCTCAGTGGGTTAACAATCCGACGTTGCCATGAGCTGTG180

GTATAGGTCACAGACGCAGCTCGGATCCCATGTTGCTGTGGCATAGGCCAGCGGCTACAG240

CTCTAATTCGACCCCTAGCCTGGGAATCTCCATGTCCTGCGGGAGCGGCCCAAGAAATGG300

CAAAAAGACAAAATAAATAAATAAATAAAATAATAAGCAAAATTAAGTTTGTAACAGTAA360

ATAATGTCTGGGAATTTCACATAATGGAAAGATAAGAATGCACAAAGTGACAGATATTTA420

AACGCTATGGCTCTAAAATTGGAACTAAACACTGAGTTTAAAATTGTCTAAAGTAGTCTT480

TATTCTAGTCAATACTCTTAATACTAAAATTTATAATCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG540

TCTTTTTTTGTCTTTCTGCTGTTGTTGTTGTTGTTGCTATTTCTTGGGCCGCTCCCACGG600

CATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTTGAATCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGA660

GCCACAGCAACGTGGGATCCGAGCCGCGTCTGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGC720

CGGATCGTTAACCCGCTGAGCAAGGGCAGGGACCGAACCTGCAACCTCATGGTTCCTAGT780

CGGATTCGTTAACCACTGCGCCACGACGGGAACTCCCTAAAATTTATAATCATTTTAAGT840

TCATCCTTTTCACTAATTTCTGAAGTTATATGTAATTACTGAGAAGTTGAGATTTTACTC900

TAAGCTTATTTACTCCCACCTTGCACTTCACCAAACTAAATAGCTTATAGTTTCCTTGCT960

TATACCATATTGCTATATTGAAAATCATGCCAAGAGTTCTCTTGTGGTGCAGTGGGATAA1020

GAATCCAGTGTTGTCACTGCAGTGGCCTGGGTTGCTGCTGTGGCACAGGTTCAACCCCTG1080

GCCCAGGAACACCCACATGCCACAGGCGTGGCCAAAAAAAAAAAAAAGGAAAATCATGCT1140

TTCAAGACTTTGTTATTCACTGTCTCGTCACCTTTTCTACCTC1183

<210>2

<211>870

<212>DNA

<213>SV313缺失基因型碱基序列

<400>2

AAAGTAGTACCAGCAGAACCTAGATAGATCTAAACTGTTCTTGAAGATTAAAATAAATAA60

CAAGCAGGAGTTCCTGTCGTGGCTCAGTGGTTAACGAATCCGACTAGGAACCATGAGGTT120

GCGGGTTCGATCCCTGGCCTTGCTCAGTGGGTTAACAATCCGACGTTGCCATGAGCTGTG180

GTATAGGTCACAGACGCAGCTCGGATCCCATGTTGCTGTGGCATAGGCCAGCGGCTACAG240

CTCTAATTCGACCCCTAGCCTGGGAATCTCCATGTCCTGCGGGAGCGGCCCAAGAAATGG300

CAAAAAGACAAAATAAATAAATAAATAAAATAATAAGCAAAATTAAGTTTGTAACAGTAA360

ATAATGTCTGGGAATTTCACATAATGGAAAGATAAGAATGCACAAAGTGACAGATATTTA420

AACGCTATGGCTCTAAAATTGGAACTAAACACTGAGTTTAAAATTGTCTAAAGTAGTCTT480

TATTCTAGTCAATACTCTTAATACTAAAATTTATAATCATTTTAAGTTCATCCTTTTCAC540

TAATTTCTGAAGTTATATGTAATTACTGAGAAGTTGAGATTTTACTCTAAGCTTATTTAC600

TCCCACCTTGCACTTCACCAAACTAAATAGCTTATAGTTTCCTTGCTTATACCATATTGC660

TATATTGAAAATCATGCCAAGAGTTCTCTTGTGGTGCAGTGGGATAAGAATCCAGTGTTG720

TCACTGCAGTGGCCTGGGTTGCTGCTGTGGCACAGGTTCAACCCCTGGCCCAGGAACACC780

CACATGCCACAGGCGTGGCCAAAAAAAAAAAAAAGGAAAATCATGCTTTCAAGACTTTGT840

TATTCACTGTCTCGTCACCTTTTCTACCTC870

<210>3

<211>313

<212>DNA

<213>SV313缺失序列

<400>3

TTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTTTTTTGTCTTTCTGCTGTTGTTGTTGTTGTTGCTATTTC60

TTGGGCCGCTCCCACGGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTTGAATCGGAGCTGTAGC120

CACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGTGGGATCCGAGCCGCGTCTGCAACCTACACC180

ACAGCTCACGGCAACGCCGGATCGTTAACCCGCTGAGCAAGGGCAGGGACCGAACCTGCA240

ACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTCGTTAACCACTGCGCCACGACGGGAACTCCCTAAAAT300

TTATAATCATTTT313

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

AAAGTAGTACCAGCAGAACCTAGATAGAT

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

GAGGTAGAAAAGGTGACGAGACAG