用于治疗和预防非酒精性脂肪肝疾病和痛风的RBP4拮抗剂

摘要

本发明提供了一种方法用于在患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量对治疗所述受试者有效的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，所述化合物是非类视黄醇的视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂。本发明提供了一种用于在患有痛风的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量对治疗所述受试者有效的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，所述化合物是视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂。

说明书

技术领域

在整个本申请中，某些出版物在括号中引用。这些出版物的完整提及可以在说明书最后找到。这些出版物的公开内容通过引用的方式整体结合到本申请中，以便更全面地描述本发明所涉及的现有技术。

本发明是在美国国立卫生研究院授予的编号为NS074476和EY027027的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。

背景技术

非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)涵盖了一系列与肝脏肝细胞中的脂质沉积有关的病况。肝脂肪变性是指脂质在肝脏中的积累。NAFLD的特征在于除过量饮酒外的其他原因引起的肝脂肪变性。临床上，肝脂肪变性被定义为肝甘油三酸酯含量超过肝脏总重的5％。虽然单纯性肝脂肪变性在NAFLD范围中是最不极端的，但它可以发展到NAFLD范围的更严重的病况，例如轻度肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH是NAFLD的一种极端形式，其特征是脂质在肝脏中蓄积，并伴有炎症和肝细胞损伤或纤维化。NASH经常导致严重的肝脏并发症，例如肝硬化和肝细胞癌。

NAFLD是美国最常见的慢性肝病形式，估计影响7千5百万至1亿人。目前尚无批准的对任何形式的NAFLD的药物疗法。开发用于NAFLD的药物疗法极为重要。

痛风性关节炎(痛风)是炎性关节炎的最常见形式，在美国影响超过800万人(Lawrence,R.C.等人2008)。尿酸是存在于许多食物和人体组织中的嘌呤代谢产生的代谢产物(Terkeltaub,R.A.2001；Burns,C.等人2013)。痛风是由血液中尿酸水平过高引起的，尿酸水平过高导致单钠尿酸盐晶体在组织中沉积。当组织中和循环中的尿酸浓度超过溶解度极限时，会形成这些晶体，从而导致痛风发作。痛风的危险因素包括超重或肥胖、患有高血压、饮酒、使用利尿剂、饮食中富含肉类和海鲜、果糖摄入过多以及肾功能不良(Choi,H.K.等人2004a；Choi,H.K.2004b；Krishnan,E.2012)。

当关节中的尿酸盐晶体引起急性炎症时，就会发生急性发作。发作的特征是持续数天到数周的疼痛、发红、肿胀和发热。疼痛可能是轻微的或剧烈的。大多数最初的发作发生在下肢。足母趾的跖趾关节的典型表现(足痛风)是50％痛风患者的表现关节。慢性痛风的特征是慢性关节炎，伴有关节酸痛和疼痛。患有痛风的人也可能会在软组织中沉积尿酸盐晶体的痛风石或结块。痛风发作之间的临床非活动(临界)节段发生在急性发作消退后。患有痛风的人继续患有高尿酸血症，这导致尿酸盐晶体在组织中持续沉积并造成损伤。随着疾病的进展，临界节段变得更短。

尿酸是由其前体黄嘌呤通过称为黄嘌呤氧化酶(XO)的酶合成的。因此，XO抑制剂(例如别嘌呤醇和非布索坦)在市场上占主导地位(Stamp,L.K.等人2015；Love,B.L.等人2010)。但是，循环尿酸水平升高最常见的原因是肾脏中尿酸分泌不足。略微有效的丙磺舒和最近批准的雷西纳得(lesinurad)是增加肾分泌尿酸的治疗方法。

痛风的发病率和患病率正在上升。这是由于诸如老龄人口增加的因素和生活方式的因素引起的，许多老龄人服用会促进高尿酸血症的噻嗪类利尿剂和预防性阿司匹林，而生活方式因素的特征是促进高尿酸血症的饮食中的果糖和酒精摄入过多、身体缺乏运动和腹部脂肪积聚(Burns,C.等人2013；Choi,H.K.等人2004a)。

在痛风的治疗中，仍有大量未满足的临床需求。在800万痛风患者中，超过300万正在接受降低尿酸盐的疗法(主要是XO抑制剂)。尽管如此，每年仍有100万患者继续经历3次或更多次的发作，这表明需要更好的降低尿酸盐的疗法。

发明内容

本发明提供了一种用于在患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量可有效治疗所述受试者的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，所述化合物是非类视黄醇的视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂。

本发明提供了一种用于在患有痛风的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量可有效治疗所述受试者的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，所述化合物是视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂。

本发明提供了一种用于在患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或痛风的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量可有效治疗所述受试者的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，其中所述化合物具有以下结构

其中L是具有以下结构的连接基团：

并且Z是具有以下结构的基团：

其中：

R

R

ψ不存在或存在，并且当存在时是键；

B是取代或未取代的杂双环、哒嗪、吡唑、吡嗪、噻二唑或三唑，

其中所述杂双环不是氯取代的吲哚；并且

所述吡唑在被取代时不被三氟甲基取代；

B’是取代或未取代的苯基、吡啶、嘧啶、苄基、吡咯烷、环丁砜、氧杂环丁烷、CO

其中所述取代的苯基不被三氟甲基或3-(羧酸甲酯)取代、所述取代的吡啶不被三氟甲基的取代，以及所述取代的吡咯烷不被异羟肟酸取代，并且

所述取代或未取代的吡咯烷通过碳-碳键与羰基结合；

A是不存在或存在的，并且当存在时为

B

其中当B

R

X为N或CR

B

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X

X

或B

其中：

R

或其药学上可接受的盐。

附图说明

图1：一剂化合物1的单次口服施用(PO)或静脉内施用(IV)诱导野生型小鼠血清RBP4循环水平的强烈降低。上图显示了静脉内施用2mg化合物1/公斤小鼠体重的数据。下图显示了口服施用5mg化合物1/公斤小鼠体重的数据。

在化合物1施用后的基线和10个时间点收集的血浆样品中进行RBP4水平的测定。将三组小鼠用于口服和静脉内给药实验(小鼠组1、小鼠组2和小鼠组3)。每个小鼠组由5只动物组成。按照制造商的说明，使用RBP4(小鼠/大鼠)双重ELISA试剂盒(AdipoGen，瑞士)确定血浆RBP4水平。

图2：如Lee 2016所述，生成adi-hRBP4转基因小鼠模型。将人hRBP4转基因引入ROSA26基因座。所述人转基因包含阻止表达的loxP-侧接终止盒。将这些小鼠与表达脂联素-Cre的小鼠交配繁殖，因此仅在脂肪细胞中去除了终止盒。因此，在该模型中，人RBP4在脂肪组织中特异性表达。

图3：用于在肝脂肪变性的adi-hRBP4遗传模型中评估化合物1功效的实验设计。

图4：在转基因小鼠品系中，化合物1诱导人和小鼠RBP4的血清水平降低。每对条中的左条为浅灰色阴影并代表基线数据。每对条中的右条为深灰色阴影，并代表研究结束时人和小鼠RBP4的血清水平。

图5：三组转基因动物的体重变化动态：两组高脂饮食(HFD)的均比对照组累积了更多的重量。与标准饮食组相比，HFD组的体重显著增加(*P<0.05；**P<0.01；双因素RM方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)

图6：HFD和HFD+化合物之间的显著性。化合物1的治疗在几个时间点显著降低了HFD引起的体重增加。仅有HFD的组和治疗组(HFD+化合物1)之间检测到显著的体重差异(*P<0.05；**P<0.01；双因素RM方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。

图7：如在治疗组(HFD+化合物1)和仅有HFD的组之间的比较所示，以化合物1进行的治疗在29天治疗期结束时显著降低了体重。观察到HFD组与治疗组(HFD+化合物1)之间存在显著差异(P＝0.0153；单因素RM方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。

图8：在治疗(HFD+化合物1)组和仅HFD组之间，食物摄入没有差异(双因素RM方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。

图9：化合物1显著降低肝游离脂肪酸浓度。在29天研究结束时，仅HFD组与治疗组(HFD+化合物1)之间存在显著差异(P＝0.011；单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。显示的数据在29天研究结束时确定。

图10：化合物1显著降低了肝甘油三酸酯。仅HFD组与治疗组(HFD+化合物1)之间存在显著差异(P＝0.01；单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。显示的数据在29天研究结束时确定。

图11：化合物1显著减少了治疗动物肝脏中的脂质沉积。A.肝脏组织学评分。

图11B：化合物1显著减少了治疗动物肝脏中的脂质沉积。B.正常食物组的平均得分为0。

图11C：化合物1显著减少了治疗动物肝脏中的脂质沉积。C.仅HFD组的平均得分为2.9。

图11D：化合物1显著减少了治疗动物肝脏中的脂质沉积。D.治疗组(HFD+化合物1)的平均得分为1.6。观察到仅HFD组与治疗组(HFD+化合物1)之间存在显著差异(P<0.001；单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。显示的数据在29天研究结束时确定。

图12：化合物1显著降低血清尿酸。仅HFD组与治疗组(HFD+化合物1)之间存在显著差异(P＝0.03；单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。但是，常规食物组和仅HFD组之间在统计学上没有显著差异。显示的数据在29天研究结束时确定。

图13：在HFD下未在动物的肾脏中观察到脂肪变性。该图是仅HFD组的代表性图像。在三个实验组的任何一个中，在肾小管中均未观察到脂肪滴。显示的数据在29天研究结束时确定。

图14：与人RBP4结合的A1120(阳性对照)和脂肪酸的代表性等温线。10nM的

图15：在啮齿动物中进行IV和PO施用后，类似物化合物1和2的体内PK数据

图16A化合物1在小鼠中的PK/PD特性。单次口服施用5mg/kg化合物1后，CD-1小鼠的血浆RBP4水平。

图16B：化合物1在小鼠中的PK/PD特性。单次2mg/kg静脉内施用化合物1后，CD-1小鼠的血浆RBP4水平。

化合物1的2mg/kg的静脉内剂量(D)。数据以平均值±SD展示。对于血液采集的每个时间点，在研究中使用了三只小鼠。

图16C：化合物1在小鼠中的PK/PD特性。单次口服施用5mg/kg剂量的化合物1后的血浆化合物水平。数据以平均值±SD展示。对于血液采集的每个时间点，在研究中使用了三只小鼠。

图16D：化合物1在小鼠中的PK/PD特性。单次口服施用2mg/kg剂量的化合物1后的血浆化合物水平。数据以平均值±SD展示。对于血液采集的每个时间点，在研究中使用了三只小鼠。

图17A口服施用化合物1对adi-hRBP4小鼠血清RBP4循环水平的影响。使用物种特异性的啮齿动物或人类酶联免疫吸附试验，在基线(黑圈)和29天化合物治疗结束时(红色方块)测量了小鼠RBP4的血清水平。与基线相比，在研究结束时，在化合物1治疗的小鼠中，人和小鼠的RBP4均可见到统计上显著的90％的降低(双因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验，****P<0.0001)。与媒介物治疗的基因敲除对照相比，在化合物1治疗的adi-hRBP4小鼠中检测到人和小鼠RBP4浓度显著降低(双因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验，P<0.0001)。误差条显示SD；图形条显示平均值。图上的每个数据点代表来自单个动物的血清RBP4浓度。每个治疗组的雄性adi-hRBP4小鼠的数量分别为：正常食物8只、HFD 7只和带有化合物1的HFD 8只。

图17B：口服施用化合物1对adi-hRBP4小鼠血清RBP4循环水平的影响。使用物种特异性啮齿动物或人类酶联免疫吸附试验，在基线(黑圈)和29天化合物治疗结束时(红色方块)测量了人类RBP4的血清水平。与基线相比，在研究结束时，在化合物1治疗的小鼠中，人和小鼠的RBP4均可见到统计上显著的90％的降低(双因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验，****P<0.0001)。与媒介物治疗的基因敲除对照相比，在化合物1治疗的adi-hRBP4小鼠中检测到人和小鼠RBP4浓度显著降低(双因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验，P<0.0001)。误差条显示SD；图形条显示平均值。图上的每个数据点代表来自单个动物的血清RBP4浓度。每个治疗组的雄性adi-hRBP4小鼠的数量分别为：正常食物8只、HFD 7只和带有化合物1的HFD 8只。

图18A化合物1部分预防adi-hRBP4小鼠的高脂饮食诱导的肥胖。饲喂正常食物(n＝8)、HFD(n＝7)和带有58的HFD(n＝8)的雄性adi-hRBP4小鼠的体重增加。与未治疗的HFD组相比，化合物治疗的HFD小鼠从第19天开始的四个时间点体重增加明显减少(双因素重复测量(RM)方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验，*P<0.05；**P<0.01)。在所有研究的时间点上，食物饲喂的小鼠的体重增加均低于HFD组的体重增加(双因素RM方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验，***P<0.001；****P<0.0001)。值代表相对于基线的体重变化的平均百分比。误差条显示SD。

图18B：化合物1部分预防adi-hRBP4小鼠的高脂饮食诱导的肥胖。在喂食正常食物、HFD和带有化合物1的HFD的雄性adi-hRBP4小鼠中，将每日食物消耗标准化为体重。未治疗的HFD组和化合物治疗的HFD小鼠之间的食物消耗没有差异(双因素RM方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)。值表示平均标准化的每日食物消耗。误差条显示SD。

图19A以20mg/kg的剂量口服施用化合物1对肥胖adihRBP4小鼠中的肝游离脂肪酸和甘油三酸酯水平的影响。饲喂正常食物(n＝8)、HFD(n＝7)和带有化合物58的HFD(n＝8)的雄性adi-hRBP4小鼠的肝脏FFA(A)水平。与未经治疗的HFD组相比，化合物1治疗的HFD小鼠的肝脏FFA(P＝0.0107，单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)和甘油三酸酯(P＝0.0104，单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)水平显著降低。图形条显示平均值；误差条显示SD；*P<0.05；****P<0.0001。图上的每个数据点代表来自单个动物的FFA或TG浓度。

图19B：以20mg/kg的剂量口服施用化合物1对肥胖adihRBP4小鼠中的肝游离脂肪酸和甘油三酸酯水平的影响。饲喂正常食物(n＝8)、HFD(n＝7)和带有化合物58的HFD(n＝8)的雄性adi-hRBP4小鼠的肝脏TG(B)水平。与未经治疗的HFD组相比，化合物1治疗的HFD小鼠的肝脏FFA(P＝0.0107，单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)和甘油三酸酯(P＝0.0104，单因素方差分析，结合Holm-Sidak事后比较检验)水平显著降低。图形条显示平均值；误差条显示SD；*P<0.05；****P<0.0001。图上的每个数据点代表来自单个动物的FFA或TG浓度。

图20A化合物1对adi-hRBP4小鼠肝脂质沉积的影响。用油红O染色的代表性肝脏冰冻切片显示了在食物饲喂、HFD和化合物1处理的HFD adi-hRBP4小鼠中的脂肪肝状态。所述化合物以20mg/kg的剂量口服施用。

图20B：化合物1对adi-hRBP4小鼠肝脂质沉积的影响。食物饲喂、HFD和化合物1处理的HFD adi-hRBP4小鼠的油红O染色肝冷冻切片的组织学评分。肝脂肪变性分为0级(0％的肝细胞有大泡性脂肪变性)、1级(<33％的肝细胞具有大泡性脂肪变性)、2级(33-66％肝细胞具有大泡性脂肪变性)和3级(>66％的肝细胞具有大泡性脂肪变性)。使用单因素方差分析(结合Holm-Sidak事后检验)对数据进行分析。图形条显示平均值；误差条显示SD；***P<0.001。图上的每个数据点代表来自单个动物的脂肪变性组织学评分。每个治疗组的雄性adi-hRBP4小鼠的数量分别为：正常食物8只、HFD 7只和带有化合物1的HFD 8只。

图21：脂肪酸与RBP4的结合。(A)与人RBP4结合的棕榈酸、油酸、亚油酸和二十二碳六烯酸的等温线。10nM的3H-视黄醇被用作放射性配体。(B)视黄醇(黑色，5NU7)、拮抗剂化合物3(紫色，3FMZ)和棕榈酸、油酸、亚油酸以及二十二碳六烯酸(橙色)的最小结合构象的叠加。Phe36在3FMZ中为深绿色(紧邻脂肪酸羧酸基团)，在5NU7模型中为浅绿色(紧邻1的醇基团)。接触残留物以棒状格式标记和图示(MOE，Chemical Computing Group，Inc.，Montreal，加拿大)。

具体实施方式

本发明提供了一种用于在患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量可有效治疗所述受试者的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，所述化合物是非类视黄醇的视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂。

本发明提供了一种用于在患有痛风的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量可有效治疗所述受试者的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，所述化合物是视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂。

本发明提供了一种用于在患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或痛风的受试者中治疗该病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一定量的可有效治疗所述受试者的化合物的药物组合物，从而治疗受试者，其中所述化合物具有以下结构

其中L是具有以下结构的连接基团：

并且Z是具有以下结构的基团：

其中：

R

R

ψ不存在或存在，并且当存在时是键；

B是取代或未取代的杂双环、哒嗪、吡唑、吡嗪、噻二唑或三唑，

其中所述杂双环不是氯取代的吲哚；并且

所述吡唑在被取代时不被三氟甲基取代；

B’是取代或未取代的苯基、吡啶、嘧啶、苄基、吡咯烷、环丁砜、氧杂环丁烷、CO

其中所述取代的苯基不被三氟甲基或3-(羧酸甲酯)取代、所述取代的吡啶不被三氟甲基取代，以及所述取代的吡咯烷不被异羟肟酸取代，并且

所述取代或未取代的吡咯烷通过碳-碳键与羰基结合；

A是不存在或存在的，并且当存在时为

B

其中当B

R

X为N或CR

B

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或B

其中：

R

或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，所述受试者患有选自由以下组成的组的NAFLD疾病：肝脂肪变性(脂肪肝)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定或已经确定受试者脂肪组织中RBP4水平，并且如果脂肪组织中RBP4水平升高则施用所述药物组合物的步骤。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定或已经确定受试者血清中RBP4水平，并且如果血清中RBP4水平升高则施用所述药物组合物的步骤。

在一个实施方案中，所述化合物的量可有效降低受试者的脂肪组织中的RBP4水平。在另一个实施方案中，所述化合物的量可有效降低受试者的血清中的RBP4水平。在另一个实施方案中，所述化合物的量可有效降低受试者血清中的尿酸水平。在另一个实施方案中，所述化合物的量可有效地使受试者肝脏中甘油三酸酯的浓度正常化。

在一个实施方案中，所述化合物的量可有效地使受试者血清中游离脂肪酸的浓度正常化。在另一个实施方案中，所述化合物的量可有效地使受试者肝脏中的游离脂肪酸浓度正常化。在一些实施方案中，所述化合物的量可有效防止脂肪酸通过RBP4运输。在另外的实施方案中，所述化合物的量可有效防止脂肪酸通过RBP4运输至肝脏。在一个实施方案中，所述化合物的量可有效抑制RBP4与脂肪酸之间的结合。

在一个实施方案中，所述脂肪酸来自脂肪组织。

在一个实施方案中，所述受试者不具有升高的血清RBP4水平。在另一个实施方案中，所述受试者的血清RBP4水平升高。在一些实施方案中，所述血清RBP4水平升高超过3微克/ml。

在一些实施方案中，NAFLD是选自简单肝脂肪变性和轻度肝脂肪变性的肝脂肪变性。

在一个实施方案中，所述化合物不是核受体RAR的配体。在另一个实施方案中，所述RBP4拮抗剂是非类视黄醇拮抗剂。在另一个实施方案中，所述RBP4拮抗剂不是fenritinide。

在一些实施方案中，L是

在另外的实施方案中，L是

在另外的实施方案中，L是

Z是

R

并且

当R

在一些实施方案中，L是

是

Z是

R

卤素

并且当ψ存在时，那么R

在一些实施方案中，L是

Z是

在一些实施方案中，L是

Z是

在一些实施方案中，L是

Z是

R6是H，并且A是

在一些实施方案中，L是

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

本发明的方法包括药物组合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中：

R

X为N或CR

其中R

A是不存在或存在的，并且当存在时为

B具有以下的结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或者，B具有以下的结构：

其中：

R

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

其中：

R

B具有以下的结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或者，B具有以下的结构：

其中：

R

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

其中：

R

Y是烷基；

A是不存在或存在的，并且当存在时为

B具有以下的结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或者，B具有以下的结构：

其中：

R

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

在一些实施方案中，B或B

其中：

R

在一些实施方案中，B或B

R

在一些实施方案中，B或B

R

在一些实施方案中，B或B

R

在一些实施方案中，B或B

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，所述化合物中的B具有以下结构：

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，所述化合物中的R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，B或B

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，X为N。在一些实施方案中，所述化合物的X为CH。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

R

在一些实施方案中，

R

R

R

在一些实施方案中，

R

R

在一些实施方案中，

R

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，所述方法的化合物具有以下结构：

其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，B或B

本发明提供具有以下结构的化合物：

其中：

R

X为N或CR

其中R

A是不存在或存在的，并且当存在时为

B具有以下的结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或者，B具有以下的结构：

其中

X

R

或其药学上可接受的盐。

54.具有以下结构的化合物：

其中：

R

B具有以下的结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或者，B具有以下的结构：

其中：

R

或其药学上可接受的盐。

具有以下结构的化合物：

其中：

R

Y是烷基；

A是不存在或存在的，并且当存在时为

B具有以下的结构：

其中：

α和β各自是存在或不存在的键；

X

其中R

X

X

R

其中：

X

X

X1是N、X2是N、X3是CH，α是存在的而β是不存在的；或

X

或者，B具有以下的结构：

其中

R

或其药学上可接受的盐。

在上述化合物的一些实施方案中，其中R

在上述化合物的一些实施方案中，其中R

在上述化合物的一些实施方案中，其中R

在上述化合物的一些实施方案中，其中R

在一些实施方案中，所述化合物具有以下结构：

其药学上可接受的盐。

在PCT国际公开号WO 2014/152013、WO 2015/168286、WO 2014/151959、WO 2014/152018和WO 2014/151936中公开的化合物和化合物的种类可以用于本发明的方法，因此，在PCT国际公开号WO 2014/152013、WO 2015/168286、WO 2014/151959、WO 2014/152018和WO 2014/151936中的每一个中公开的化合物和化合物的种类在此通过引用的方式并入本发明的方法。

在实施方案中，所述化合物是RBP4拮抗剂。

在一个实施方案中，化合物的量为每天5-1000mg、5-800mg、5-200mg、45-200mg、45-1000mg、45-800mg、10-50mg、96mg、24mg或10mg。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一定量的第二药剂，所述第二药剂为(R)-(+)-(5,6-二氯2,3,9,9a-四氢3-氧代-9a-丙基-1H-芴-7-基)氧基]乙酸(DPOFA)、非甾体类抗炎药(NSAID)(如吲哚美辛、秋水仙碱、雷西纳得)、皮质类固醇(例如倍他米松、强的松、地塞米松、可的松、可的松、氢化可的松、甲泼尼松、泼尼松龙)、生物抗IL-1alpha/beta药物(例如康纳单抗、利纳西普、阿那白滞素)、别嘌呤醇、苯溴马隆、培戈洛酶(pegloticase)和其他形式的尿酸酶、托匹司他(topiroxostat)(FYX-051)、ulodesine(BCX4208)、KUX-1151、RLBN1001、RDEA3170、阿洛芬酯(MBX-102)、左旋托非索泮(levotofisopam)、UR-1102、PF-06743649、BCX4208、SHR4640、芦米考昔(Lumiracoxib)、曲尼司特(Tranilast)、托匹司他、LC350189、布西拉明(Bucillamine)、AC-201、Huzhen胶囊(包括虎杖(Polygonum cuspidatum)和女贞(Ligustrum lucidum))、MPC-004、FYU-981、碳酸氢钠、SEL-212、SEL-037、阿普司特(Apremilast)、TMX-67、SSS11、D-0120、非布索坦或丙磺舒、或有效治疗受试者的酯或盐，从而治疗受试者。

在一个实施方案中，所述第二药剂是DPOFA。

在一些实施方案中，所述受试者患有痛风。

在一个实施方案中，所述第二药剂的量或所述化合物的量可有效降低受试者血液中的尿酸水平。在另一个实施方案中，所述第二药剂的量或所述化合物的量可有效减少受试者肾脏中的尿酸再吸收。

在一个实施方案中，所述第二药剂的量可有效增加受试者的尿酸清除率。

在一些实施方案中，所述第二药剂的量可有效增加受试者尿液中的尿酸水平。

在一个实施方案中，所述第二药剂的量可有效增加受试者中尿酸的肾脏清除率。在另外的实施方案中，所述第二药剂的量或所述化合物的量可有效减轻受试者中与痛风有关的一种或多种症状。

在一些实施方案中，所述与痛风有关的一种或多种症状是关节痛、关节炎，关节红肿、关节活动范围减少。在另外的实施方案中，所述第二药剂的量或所述化合物的量可有效预防受试者的痛风。

在一个实施方案中，所述预防包括增加受试者尿液中的尿酸水平。在另一个实施方案中，所述预防包括降低受试者血液中的尿酸水平。在另一个实施方案中，所述预防包括增加受试者的尿酸清除率。在另一个实施方案中，所述预防包括减少受试者的肾脏中的尿酸再吸收。

在一个实施方案中，所述预防包括增加受试者中尿酸的肾脏清除率。在另一个实施方案中，所述预防包括减轻受试者中与痛风有关的一种或多种症状。

在一些实施方案中，所述与痛风有关的一种或多种症状是关节痛、关节炎，关节红肿、关节活动范围减少。

在一个实施方案中，所述痛风是慢性痛风。在不同的实施方案中，所述痛风是急性痛风。

在一些实施方案中，所述第二药剂的量或所述化合物的量预防慢性痛风的复发。

在本发明的一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。

在一些实施方案中，所述受试者是女性，并且施用所述化合物降低了尿酸水平2.4-6.0mg/dL。在另一个实施方案中，所述受试者是男性，并且施用所述化合物降低了尿酸水平3.4-7.0mg/dL。

在另一个实施方案中，施用所述化合物将受试者中的尿酸水平降低至小于7mg/dL。

本发明还提供了用于治疗患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)疾病或痛风的受试者的药物组合物，所述药物组合物包含一定量的视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂或上文限定的化合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含一定量的第二药剂，用于治疗患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)疾病或痛风的受试者。

在一些实施方案中，制备所述RBP4拮抗剂或化合物和第二药剂以同时、同期或联合施用。

本发明进一步提供了包含视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂或上文限定的化合物的药物组合物，所述药物组合物与包含第二种药物的药物组合物一起用于联合疗法，用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)疾病或痛风。

本发明另外提供了包含一定量的视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂或上文限定的化合物的药物组合物，作为对第二药剂附加疗法或与第二种药物组合，用于治疗患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)疾病或痛风的受试者。

本发明还提供了视黄醇结合蛋白4(RBP4)拮抗剂或上文限定的化合物在制备用于治疗患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)疾病或痛风的受试者的药物中的用途。

如本文所用，“组合”是指通过同时或同期施用而用于疗法的药剂的组合。同时施用是指第一化合物和第二化合物的混合物(无论是真实混合物、悬浮液、乳液还是其他物理组合)的施用。在这种情况下，所述组合可以是在施用前才组合的第一化合物和第二化合物的混合物或单独的容器。同期施用是指同时或在足够接近的时间分别施用第一化合物和第二化合物，从而观察到相对于单独的第一化合物或第二化合物的活性的添加的和或优选的协同活性。

如本文所用，“伴随施用”或“伴随地”施用是指在足够近的时间间隔内给予的两种药剂的施用，以允许每种药剂的单独治疗作用重叠。

如本文所用，“附加”或“附加疗法”是指用于疗法的试剂的组合，其中接受所述疗法的受试者开始一种或多种试剂的第一治疗方案，在开始除所述第一治疗方案之外的一种或多种不同试剂的第二治疗方案之前，由此，并非所有在所述疗法中使用的试剂都同时启用。例如，将化合物1疗法添加至已经接受DPOFA疗法的受试者。

如本文所用，“非类视黄醇RBP4拮抗剂”是不是类视黄醇的RBP4拮抗剂。类视黄醇是视黄醇的天然或合成类似物，其由四个以头尾方式相连的类异戊二烯单元组成。类视黄醇描述于IUPAC-IUB生化命名联合委员会(1982)。

除非另有说明，当本发明化合物的结构包括不对称碳原子时，应理解所述化合物作为外消旋体、外消旋混合物以及分离的单一对映体存在。这些化合物的所有这些异构形式均明确地包括在本发明中。除非另有说明，否则每个立体异构的碳可以是R或S构型。因此应理解，除非另有说明，否则由这种不对称性引起的异构体(例如，所有对映异构体和非对映异构体)均包括在本发明的范围内。此类异构体可以通过经典的分离技术和通过立体化学控制的合成(如J.Jacques,A.Collet和S.Wilen的"Enantiomers,Racemates andResolutions”中所描述的，John Wiley&Sons,NY,1981出版)以基本上纯的形式获得。例如，可以在手性柱上的通过制备色谱法进行分离。

本发明还意图包括在本文公开的化合物上出现的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。作为一般示例而非限制，氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括C-13和C-14。

应当注意的是，在本申请全文中的结构中的碳的任何符号，当没有另外的符号使用时，旨在表示碳的所有同位素，例如

应当注意的是，在本申请全文中的结构中的氢的任何符号，当没有另外的符号使用时，旨在表示氢的所有同位素，例如

同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术，使用适当的同位素标记的试剂代替所用的非标记试剂来制备。

术语“取代”、“取代的”和“取代基”是指如上所述的官能团，其中与其中所含氢原子的一个或多个键被与非氢或非碳原子的键取代，前提是维持正常的化合价，并且取代产生稳定的化合物。取代的基团还包括这样的基团，其中与一个或多个碳或一个或多个氢原子的一个或多个键被与杂原子相连的一个或多个键(包括双键或三键)取代。取代基的实例包括上述官能团和卤素(即，F、Cl、Br和I)；烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和三氟甲基；羟基；烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基；芳氧基，例如苯氧基；芳基烷氧基，例如苄氧基(苯基甲氧基)和对三氟甲基苄氧基(4-三氟甲基苯基甲氧基)；杂芳氧基；磺酰基，例如三氟甲磺酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基；硝基，亚硝酰基；巯基；硫烷基，例如甲基硫烷基、乙基硫烷基和丙基硫烷基；氰基；氨基，例如氨基、甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基和二乙基氨基；以及羧基。当公开或要求保护多个取代基部分时，所述取代的化合物可以被一个或多个所公开或要求保护的取代基部分单个或多个地独立取代。独立取代是指(两个或更多个)取代基可以相同或不同。

在本发明的方法中使用的化合物中，除非另外特别定义，否则所述取代基可以是取代的或未取代的。

在本发明的方法中使用的化合物中，烷基、杂烷基、单环、双环、芳基、杂芳基和杂环基团可以通过用替代的非氢基团取代一个或多个氢原子来进一步取代。这些包括但不限于卤素、羟基、巯基、氨基、羧基、氰基和氨基甲酰基。

可以理解，本发明方法中使用的化合物上的取代基和取代方式可以由本领域普通技术人员选择，以提供化学上稳定并且可以通过本领域已知的技术容易地从容易获得的起始原料合成的化合物。如果取代基本身被一个以上的基团取代，则应当理解，这些多个基团可以在相同的碳上或在不同的碳上，只要得到稳定的结构即可。

在选择用于本发明方法中的化合物时，本领域普通技术人员将认识到，将遵照化学结构连接性的众所周知的原理来选择各种取代基，即R

如本文所用，“烷基”旨在包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基。因此，如“C

术语“烯基”是指直链或支链的非芳族烃基，其含有至少1个碳-碳双键，以及至多可以存在的最大数量的非芳族碳-碳双键。因此，C

术语“炔基”是指直链或支链的非芳族烃基，其含有至少1个碳-碳三键，以及至多可以存在的最大数量的非芳族碳-碳三键。因此，C

烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基包括但不限于卤素、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、二氟甲基、甲氧基和羟基。

如本文所用，“C

如本文所用，“杂烷基”包括在链或支链内具有至少1个杂原子的支链和直链饱和脂族烃基。

如本文所用，“环烷基”包括总碳原子数为三至八个或在该范围内的任何数目的烷烃的环(即，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基)。

如本文所用，“杂环烷基”旨在表示含有1至4个选自O、N和S的杂原子的5至10元非芳族环，并且包括双环基团。因此，“杂环基”包括但不限于以下：咪唑基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢吡喃基、二氢哌啶基、四氢噻吩基等。如果所述杂环含有氮，则应理解其相应的N-氧化物也被该定义所涵盖。

如本文所用，“芳基”旨在表示在每个环中至多10个原子的任何稳定的单环，双环或多环碳环，其中至少一个环是芳族的，并且可以是未取代的或取代的。此类芳基元素的实例包括但不限于：苯基、对甲苯基(4-甲基苯基)、萘基、四氢萘基、茚满基、菲基、蒽基或苊基。在芳基取代基为双环且一个环为非芳族的情况下，应理解连接是通过芳族环实现的。

术语“烷基芳基”是指如上所述的烷基，其中与其中包含的氢的一个或多个键被如上所述的与芳基的键取代。应当理解，“烷基芳基”基团通过来自烷基的键连接至核心分子，并且芳基基团充当烷基上的取代基。芳基烷基部分的实例包括但不限于苄基(苯基甲基)、对三氟甲基苄基(4-三氟甲基苯基甲基)、1-苯基乙基、2-苯基乙基、3-苯基丙基、2-苯基丙基等。

本文所用的术语“杂芳基”表示每个环中最多有10个原子的稳定的单环，双环或多环，其中至少一个环是芳族的并且含有1-4个选自O，N的杂原子和S。双环芳族杂芳基包括但不限于苯基、吡啶、嘧啶或哒嗪环，其(a)与具有一个氮原子的6元芳族(不饱和)杂环稠合；(b)与具有两个氮原子的5或6元芳族(不饱和)杂环稠合；(c)与具有一个氮原子和一个氧或一个硫原子的5元芳族(不饱和)杂环稠合；或(d)与具有一个选自O，N或S的杂原子的5元芳族(不饱和)杂环稠合。该限定范围内的杂芳基包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋吖基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、二氢吲哚基、吲哚基、吲哚嗪基、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、吖丙啶基、1,4-二噁烷基、六氢氮杂基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苄基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、苯并三唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉基。在杂芳基取代基为双环且一个环为非芳族或不包含杂原子的情况下，应理解连接分别通过芳族环或通过含杂原子的环进行。如果所述杂芳基含有氮原子，则应理解其相应的N-氧化物也被该定义所涵盖。

如本文所用，“单环”包括至多10个原子的任何稳定的多环碳环，并且可以是未取代的或取代的。这种非芳族单环元素的实例包括但不限于：环丁基、环戊基、环己基和环庚基。这种芳族单环元素的实例包括但不限于：苯基。如本文所用，“杂单环”包括含有至少一个杂原子的任何单环。

如本文所用，“双环”包括至多10个原子的任何稳定的多环碳环，其与至多10个原子的多环碳环稠合，其中每个环独立地是未取代的或取代的。这种非芳族双环元素的实例包括但不限于：十氢萘。这种芳族双环元素的实例包括但不限于：萘。如本文所用，“杂双环”包括含有至少一个杂原子的任何双环。

术语“苯基”旨在表示含有六个碳的芳族六元环及其任何取代的衍生物。

术语“苄基”旨在表示直接连接于苯环的亚甲基。苄基是其中氢被苯基取代的甲基及其任何取代的衍生物。

术语“吡啶”旨在表示具有包含5个碳原子和1个氮原子的六元环的杂芳基及其任何取代的衍生物。

术语“吡唑”旨在表示具有包含三个碳原子和两个氮原子的五元环的杂芳基，及其任何取代的衍生物，其中所述氮原子彼此相邻。

术语“吲哚”旨在表示具有与苯环稠合的五元环的杂芳基，其中所述五元环含有直接连接于苯环的1个氮原子。

术语“氧杂环丁烷”旨在表示包含三个碳原子和一个氧原子的非芳族四元环及其任何取代的衍生物。

用于本发明方法的化合物可以通过有机合成中熟知的技术和本领域普通技术人员熟悉的技术来制备。但是，这些可能不是合成或获得所需化合物的唯一手段。

本发明的化合物可以通过下列文献中描述的技术制备：Vogel’s Textbook ofPractical Organic Chemistry,A.I.Vogel,A.R.Tatchell,B.S.Furnis,A.J.Hannaford,P.W.G.Smith,(Prentice Hall)第五版(1996)、March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,Michael B.Smith,Jerry March,(Wiley-Interscience)第五版(2007)，以及其中的参考文献，所述文献通过引用的方式并入本文。但是，这些可能不是合成或获得所需化合物的唯一手段。

本发明的化合物可以通过本文所述的技术或PCT国际公开号WO/2014/152013、WO/2015/168286、WO/2014/151959、WO/2014/152018以及WO/2014/151936中所述的技术来制备，其各自的内容通过引用的方式并入本文。

与本文公开的化合物的芳环连接的各种R基团可以通过标准程序添加至所述环上，所述标准程序例如以下文献中所示的那些：Advanced Organic Chemistry:Part B:Reaction and Synthesis,Francis Carey and Richard Sundberg,(Springer)第五版(2007)，其内容通过引用的方式并入本文。

本发明的另一方面包括本发明的化合物作为药物组合物。

如本文所用，术语“药物活性剂”是指适合于施用于受试者的任何物质或化合物，并在疾病的治疗、治愈、缓解、诊断或预防中提供生物学活性或其他直接作用，或影响所述受试者的结构或任何功能。药物活性剂包括但不限于下列文献中所述的物质和化合物：Physicians’Desk Reference(PDR Network，LLC；第64版；2009年11月15日)和“ApprovedDrug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations”(U.S.Department OfHealth And Human Services，第30版，2010年)，所述文献通过引用的方式并入本文。具有挂接羧酸基团的药物活性剂可以根据本发明使用标准酯化反应和化学合成领域普通技术人员容易获得和已知的方法进行修饰。在药物活性剂不具有羧酸基团的情况下，普通技术人员将能够设计并将羧酸基团结合到药物活性剂中，其中随后可以进行酯化，只要所述修饰不干扰药物活性剂的生物活性或效果。

本发明的化合物可以是盐的形式。如本文所用，“盐”是本发明化合物的盐，其通过制备所述化合物的酸式或碱式盐而被修饰。在用于治疗疾病的化合物的情况下，所述盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残渣(如胺类)的矿物酸或有机酸盐；酸性残渣(如酚类)的碱金属盐或有机盐。所述盐可以用有机酸或无机酸制成。这种酸式盐是氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等。酚盐是碱土金属盐、钠盐、钾盐或锂盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐。这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过将纯化的本发明化合物以其游离碱或游离酸的形式分别与合适的有机或无机酸或碱反应，并分离如此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳生物酸盐和月桂基磺酸盐等(参见，例如，Berge等人(1977)"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.66:1-19)。

对于本文公开的所有化合物都考虑了盐或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的任何上述化合物的药学上可接受的盐或盐。

如本文所用，“治疗”是指预防、减缓、停止或逆转疾病或感染的进展。治疗也可能意味着改善一种或多种疾病或感染的症状。“治疗痛风”的一个实施方案是延迟或预防痛风的发作、进展或减轻其严重性。

如本文所用，“正常化”，就使患病受试者的浓度正常化而言，是指增加或降低所述浓度，使得所述浓度更接近于没有疾病的受试者中的浓度。

如本文所用，“升高”，如在患病受试者中RBP4的浓度升高，是指与没有疾病的受试者的浓度相比，RBP4浓度升高。

本发明的化合物可以以各种形式施用，包括本文详述的那些形式。用所述化合物进行的治疗可以是联合治疗或辅助治疗的组成部分，即结合一种或多种本发明化合物治疗需要所述药物的受试者，或给予其另外的用于所述疾病的的药物。所述组合疗法可以是顺序疗法，其中先用一种药物然后用另一种药物治疗患者，或同时给予所述的两种药物。根据所采用的剂型，它们可以通过相同的或两种或更多种不同的施用途径独立地施用。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或媒介物，用于将本发明的化合物递送至动物或人。所述媒介物可以是液体或固体，并且根据考虑的计划的施用方式来选择。脂质体也是药学上可接受的载体。

在治疗中所施用的化合物的剂量将根据多种因素而变化，例如特定化学治疗剂的药效学特性及其施用方式和途径；受者的年龄、性别、代谢速率、吸收效率、健康状况和体重；症状的性质和程度；所施用的同期治疗的种类；治疗的频率；以及所需的治疗效果。

用于本发明方法的化合物的剂量单位可包含单一化合物或其与其他药剂的混合物。所述化合物可以以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、混悬剂、糖浆和乳剂的口服剂型施用。化合物还可以静脉内(推注或输注)、腹膜内、皮下或肌肉内形式施用，或直接地引入到感染部位中或感染部位上，例如通过注射、局部应用或其他方法，全部使用药学领域普通技术人员熟知的剂型。

本发明方法中使用的化合物可以与合适的药物稀释剂、扩展剂、赋形剂或载体(本文统称为药学上可接受的载体)混合施用，所述药物稀释剂、补充剂、赋形剂或载体根据预期的施用形式并与常规药物实践相一致地进行适当选择。所述单位将为适于口服、直肠、局部、静脉内或直接注射或肠胃外施用的形式。所述化合物可以单独施用或与药学上可接受的载体混合施用。该载体可以是固体或液体，并且载体的类型通常基于所使用的施用类型来选择。活性剂可以以片剂或胶囊、脂质体的形式，以附聚的粉末或液体形式共同施用。合适的固体载体的实例包括乳糖、蔗糖、明胶和琼脂。胶囊或片剂易于配制并制成易于吞咽或咀嚼；其他固体形式包括颗粒和散装粉末。片剂可包含合适的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂、流动诱导剂和熔融剂。合适的液体剂型的例子包括在水中的溶液或悬浮液、药学上可接受的脂肪和油、醇或其它有机溶剂(包括酯)、乳液、糖浆或酏剂、悬浮液、由非泡腾颗粒重构的溶液和/或悬浮液以及由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。这样的液体剂型可以包含例如合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和熔融剂。口服剂型任选地包含调味剂和着色剂。肠胃外和静脉内形式还可包括矿物质和其他材料，以使其与所选的注射或递送系统类型兼容。

在以下参考文献中描述了用于制备可用于本发明的剂型的技术和组合物：7Modern Pharmaceutics，第9章和第10章(Banker&Rhodes,Editors,1979)；Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets(Lieberman等人,1981)；Ansel,Introduction toPharmaceutical Dosage Forms第二版(1976)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985)；Advances in PharmaceuticalSciences(David Ganderton,Trevor Jones,Eds.,1992)；Advances in PharmaceuticalSciences Vol.7.(David Ganderton,Trevor Jones,James McGinity,Eds.,1995)；Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms(Drugs and thePharmaceutical Sciences,Series 36(James McGinity,Ed.,1989)；PharmaceuticalParticulate Carriers:Therapeutic Applications:Drugs and the PharmaceuticalSciences,Vol 61(Alain Rolland,Ed.,1993)；Drug Delivery to the GastrointestinalTract(Ellis Horwood Books in the Biological Sciences.Series in PharmaceuticalTechnology；J.G.Hardy,S.S.Davis,Clive G.Wilson,Eds.)；Modem Pharmaceutics Drugsand the Pharmaceutical Sciences,Vol 40(Gilbert S.Banker,Christopher T.Rhodes,Eds.)。所有上述出版物均通过引用的方式并入本文。

片剂可包含合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、流动诱导剂和熔融剂。例如，对于片剂或胶囊剂量单位形式的口服施用，活性药物组分可以与口服、无毒、药学上可接受的惰性载体结合，例如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

本发明方法中使用的化合物也可以以脂质体递送系统的形式施用，所述脂质体递送系统例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂形成，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。所述化合物可以作为组织靶向乳剂的组分施用。

本发明方法中使用的化合物也可以偶联到可溶性聚合物上作为可靶向药物载体或作为前药。这种聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基阿斯巴甜-间苯二酚或用棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，所述化合物可以偶联至一类可用于实现药物受控释放的生物可降解聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。

明胶胶囊可以包含活性成分化合物和粉末状载体，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的稀释剂可以用来制作压缩片。片剂和胶囊都可以制成速释产品或缓释产品，以便在数小时内连续释放药物。压缩片可以包覆糖衣或薄膜衣，以掩盖任何令人不快的味道，并保护片剂免受大气影响，或者包覆肠溶衣，以在胃肠道中选择性崩解。

对于液体剂型的口服施用，口服药物组分与任何口服、无毒、药学上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等结合。合适的液体剂型的例子包括在水中的溶液或悬浮液、药学上可接受的脂肪和油、醇或其它有机溶剂(包括酯)、乳液、糖浆或酏剂、悬浮液、由非泡腾颗粒重构的溶液和/或悬浮液以及由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。这样的液体剂型可以包含例如合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和熔融剂。

口服用液体剂型可以含有色素和调味剂，以增加患者的接受度。通常，水、合适的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液和相关的糖溶液和二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外施用的溶液优选地含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂，以及如果需要的话，缓冲物质。抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，单独或组合，是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠。此外，肠胃外溶液可能含有防腐剂，如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。合适的药物载体描述于该领域的标准参考书：Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany。

本发明方法中使用的化合物也可以通过使用合适的鼻内媒介物以鼻内形式施用，或者通过透皮途径，使用本领域普通技术人员熟知的那些形式的透皮皮肤贴片。为了以透皮递送系统的形式施用，给药施用在整个给药方案中通常是连续的，而不是间歇的。

肠胃外和静脉内形式还可包括矿物质和其他材料，以使其与所选的注射或递送系统类型兼容。

本文公开的每个实施方案被认为适用于每个其他公开的实施方案。因此，本文描述的各种元件的所有组合都在本发明的范围内。

通过参考随后的实验细节，将更好地理解本发明，但是本领域技术人员将容易理解，详细描述的具体实验仅是对如在随后的权利要求中更全面描述的本发明的例释。

实验细节

实施例1：

如图1所示，化合物1的单次口服和静脉内给药可诱导野生型小鼠血清RBP4循环水平的显著降低。

本研究的主要目的是确定化合物1在小鼠体内的靶向性，并确定化合物1在小鼠体内是否具有活性。为了进行这种测定，研究了雄性CD-1小鼠口服和静脉内施用化合物1对血浆RBP4水平动态的影响。将收集的血浆样本的等分试样用于分析血浆RBP4浓度，如ELISA试剂盒制造商所述使用标准ELISA方案(Adipogen RBP4(小鼠/大鼠)双ELISA试剂盒)。在IV或PO化合物施用后的10个时间点测定血浆RBP4浓度。由于小鼠的血液量少，因此最多可以从单个动物中采集血样3次。来自不同动物的样本被用于分析不同时间点的RBP4浓度。从参加研究的所有动物中采集给药前的血浆样本，并将平均给药前RBP4浓度用作基线。本研究的实验设计如表1所示。

表1：实验设计和小鼠分组

对于IV施用，将化合物制备为在3％DMA/45％PEG300/12％乙醇/40％无菌水中的溶液。对于PO施用，将化合物制备为在0.9％盐水中的2％

实施例2：

新兴证据表明，除了其视黄醇运输功能外，RBP4还可以在几种常见疾病中发挥病原作用，所述常见疾病例如胰岛素抵抗、2型糖尿病(T2D)、代谢综合征和低度血管炎症。有大量证据支持RBP4循环水平升高与NAFLD发展的关联。

Lee 2016最近报道了一种转基因小鼠模型(“adi-hRBP4小鼠”)，其中人RBP4可以在脂肪细胞中特异性表达。由于人RBP4产量在小鼠脂肪组织中增加，所述转基因小鼠的RBP4循环水平轻度升高。所述转基因小鼠体重增加并发展为肝脂肪变性。实际上，当喂食常规食物时，这些小鼠会在3-4月龄时发展为NAFLD；而当喂食高脂饮食(HFD)时，其代谢表型的恶化速度要比同窝对照更快。因此，adi-hRBP4小鼠是肝脂肪变性的转基因模型。

在adi-hRBP4小鼠中进行了化合物1(一种先进的RBP4拮抗剂)的评估。在该实验中，将雄性adi-hRBP4小鼠分成三个年龄匹配的治疗组。给第一组喂食普通食物(以下简称“普通食物组”)、给第二组喂食高脂饮食(HFD)(以下简称“仅HFD组”)、以及给第三组喂食HFD和化合物1(以下称为“治疗组”)。将化合物1配制成食物，以向治疗组提供每日口服剂量，20mg化合物1/kg小鼠体重。治疗时间为四(4)周。测量了以下变量：体重、食物消耗、肝脂质、血液化学、尿液分析、肝脏组织学、肾脏组织学、视网膜-组织学和ERG。

实验设计在图2中概述，并且该实验的实验数据显示在图3-14中。

人和小鼠RBP4都存在于小鼠循环系统(血清)中，如图4所示。人RBP4在脂肪组织中表达和分泌，而小鼠RBP4主要在肝脏中产生。但是，在未经治疗的动物中的脂肪组织中产生的人RBP4的循环浓度约为主要在肝脏中产生的小鼠RBP4的5％。如图4所示，在HFD喂养的adi-hRBP4小鼠中，化合物1的施用显著降低了人和小鼠血清RBP4水平的循环水平。

如图6和图7所示，还发现化合物1显著降低了HFD引起的体重增加，尽管仅HFD组和治疗组之间的食物摄入没有差异(图8)。与仅HFD组相比，还发现化合物1显著降低了肝脏甘油三酸酯和肝游离脂肪酸的浓度(图9和10)。

图14显示了脂肪酸可以用作RBP4的配体，这表明RBP4可能参与脂肪酸从脂肪组织向肝脏的运输。化合物1以及其他RBP4拮抗剂可以抑制这种运输，因为它们竞争结合至RBP4中相同的配体结合口袋。

因此，降低人和小鼠RBP4的水平与化合物1在降低体重增加和使肝脏中甘油三酸酯和游离脂肪酸的浓度正常化方面的显著功效有关。

该数据表明化合物1和类似的化合物可以用于治疗人类NAFLD范围的疾病。化合物1和类似化合物特别适用于治疗血清RBP4水平升高的患者的NAFLD范围的疾病。

实施例3：痛风的治疗

NAFLD中的肝脂肪变性会诱导肝脏中的黄嘌呤氧化酶上调，从而导致尿酸产生增加。在患有NAFLD的人中，循环中尿酸浓度升高会导致痛风症状。NAFLD与高尿酸血症的发展密切相关。

向实施例2中描述的转基因小鼠施用化合物1显著降低了尿酸的循环水平。因此，化合物1和类似化合物可用于治疗NAFLD患者的痛风和痛风性关节炎。化合物1和类似化合物也可用于治疗无NAFLD患者的痛风和痛风性关节炎。

实施例4：痛风的组合治疗

由于化合物1抑制肝脏中尿酸的产生，因此可以将化合物1和类似化合物与诱导肾脏中尿酸排泄的药物组合使用。这种药物的一个例子是DPOFA，其被例示于PCT国际公开号WO/2017/083652中，其通过引用的方式并入本文。鉴于本文的公开内容，这两种化合物具有互补的作用机理。具体地，DPOFA会增加尿酸通过尿的排泄，而化合物1会在肝脏中抑制NAFLD诱导的黄嘌呤氧化酶(XO)的上调。XO是在肝脏(这是尿酸产生的主要部位)中负责尿酸合成的酶。因此，在组合中，化合物1减少了尿酸的产生，而DPOFA增加了从身体排泄的尿酸，从而治疗了受试者。

实施例5：在哺乳动物模型中的功效

在adi-hRBP4小鼠中测试了本文所列出的化合物的有效性。adi-hRBP4小鼠模型在小鼠脂肪组织中表现出人RBP4表达的适度增加，并被认为是肝脂肪变性的模型。化合物以20mg/kg口服给药4周。在治疗动物中人和小鼠RBP4的血清水平降低。在治疗小鼠中，肝脏中的RBP4和游离脂肪酸(FFA)水平降低。(1)血清中的游离脂肪酸、(2)肝脏中的甘油三酸酯、(3)血清尿酸的水平也降低了。

实施例6：向受试者施用

向患有NAFLD的受试者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有NAFLD的和血清RBP4的循环水平升高的患者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗受试者。

向患有肝脂肪变性的受试者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗受试者。

患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝硬化的受试者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝细胞癌的受试者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有痛风的受试者施用一定量的化合物1。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

化合物2-4的结构如下所示。

向患有NAFLD的受试者施用一定量的化合物2。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝脂肪变性的受试者施用一定量的化合物2。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者施用一定量的化合物2。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝硬化的受试者施用一定量的化合物2。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝细胞癌的受试者施用一定量的化合物2。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有通风的受试者施用一定量的化合物2。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有NAFLD的受试者施用一定量的化合物3。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝脂肪变性的受试者施用一定量的化合物3。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者施用一定量的化合物3。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝硬化的受试者施用一定量的化合物3。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝细胞癌的受试者施用一定量的化合物3。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有通风的受试者施用一定量的化合物3。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有NAFLD的受试者施用一定量的化合物4。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝脂肪变性的受试者施用一定量的化合物4。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者施用一定量的化合物4。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝硬化的受试者施用一定量的化合物4。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有肝细胞癌的受试者施用一定量的化合物4。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

向患有痛风的受试者施用一定量的化合物4。所述化合物的量可有效治疗所述受试者。

实施例7：DPOFA与化合物1组合

向患有痛风的受试者施用一定量的与化合物1组合的化合物DPOFA。所述DPOFA和化合物1的量可有效治疗所述患有痛风的受试者。所述组合比单独施用的每种化合物在治疗痛风方面更有效。

实施例8：DPOFA与化合物1组合

向患有痛风和NAFLD的受试者施用一定量的与化合物1组合的化合物DPOFA。所述DPOFA和化合物1的量可有效治疗所述患有痛风和NAFLD的受试者。所述组合比单独施用的每种化合物在治疗痛风和NAFLD方面更有效。

实施例9：DPOFA与化合物1组合预防受试者的痛风

向具有痛风发作史或有痛风发作风险的受试者施用一定量的与化合物1组合的化合物DPOFA。所述DPOFA和化合物1的量可在所述受试者中有效预防痛风发作。所述组合比单独施用的每种化合物在预防痛风方面更有效。

实施例10：体内活性：啮齿动物中化合物1和化合物3的PK特性。

在幼稚的雄性CD-1小鼠和成年的Sprague-Dawley雄性大鼠中，化合物1和化合物3均具有良好的PK分布(图15)。所述化合物在两个物种中均显示出中等至低的清除率以及良好的半衰期(t

实施例11：体内活性：小鼠中化合物1的PK/PD相关性。

在小鼠肝脂肪变性的转基因模型中测试化合物1之前，在小鼠中用化合物1进行急性给药研究，以测量化合物对循环血浆RBP4水平的影响，并建立PK/PD相关性(图16)。在化合物1的单次口服给药(5mg/kg)后，观察到血浆RBP4最大减少85％(图16A)，而在2mg/kg静脉内给药后，血浆RBP4减少81％(图16B)。化合物1的口服和静脉内给药后体内血清RBP4降低(图16A、B)显示出与血浆中化合物浓度的良好相关性(图16C、D)。单次口服给药后获得的化合物1的长期暴露和中度至低度的清除与RBP4降低的程度(在12小时时间点降低85％)和RBP4降低效果的持续时间(在24小时时间点降低71％)密切相关。

此外，RBP4降低的幅度与化合物1在血浆中的预计游离药物浓度密切相关，所述浓度超过了在体外HTRF试验中测量的破坏RBP 4-TTR相互作用所需的浓度。这些数据证实了化合物1的体内靶向性，并揭示了化合物暴露与小鼠生物应答之间的良好的PK/PD关系，此外还证实了化合物1在小鼠肝脂肪变性的转基因模型中的特性。

实施例12：在小鼠肝脂肪变性的转基因模型中，化合物1降低了脂肪衍生的RBP4的循环水平。

正如Blaner及其同事先前报道的那样(Lee,S.-A.等人2016)，通过将具有loxP-neor-stop盒的人RBP4(hRBP)cDNA构建体靶向小鼠Rosa26基因座，可以生成小鼠肝脂肪变性的基因模型。为了在小鼠脂肪细胞中特异性表达hRBP4，用脂联素-Cre小鼠培育了敲入小鼠。人RBP4在小鼠脂肪细胞中的22特异性表达不会导致RBP4的循环水平显著升高，并且血浆、肝脏和脂肪组织中的类视黄醇水平也没有变化，同时导致肥胖、葡萄糖耐量受损和肝甘油三酸酯(TG)水平明显增加(Lee,S.-A.等人2016)。

为了检查化合物1对雄性adi-hRBP4小鼠的代谢参数的影响，将所述化合物作为制剂以每天20mg/kg的剂量施用到HFD食物中，持续29天。当动物从标准食物改为高脂饮食(60％的卡路里来自脂肪)时，化合物的施用从20周龄开始。化合物1的长期口服施用引起小鼠和人(脂肪组织分泌的)血清RBP4的循环水平降低90％(图17)。在未经治疗的adi-hRBP4小鼠中，脂肪来源的人RBP4的循环水平(2-3μg/mL)占主要在肝脏中产生的小鼠特异性血清RBP4的3-5％的小部分(图17)。值得注意的是，脂肪细胞分泌所赋予的RBP4循环水平的这种适度增加足以触发强代谢表型的诱导。

实施例13：化合物1降低肥胖adi-hRBP4小鼠的体重增加。

在29天的研究期内，高脂饮食下的adihRBP4小鼠的体重增加明显高于保持标准食物的转基因动物的体重(图18A)。在开始高脂肪喂养5天后，喂食食物的小鼠和HFD adi-hRBP小鼠之间的体重增加百分比有显著的统计学差异(图18A)。通过施用化合物1，HFD动物的体重增加显著降低。在高脂饮食喂养19天后，化合物1治疗的和未治疗的HFD小鼠之间的体重增加有显著的统计学差异(图18A)。在第29天的治疗结束时(2.2±1.7g)，比未经治疗的HFD动物(4.7±1.6g)少53％。化合物1治疗的adi-RBP4小鼠体重增加的减少与食物摄入减少无关，因为化合物1不会改变HFD食物的消耗(图10B)。

实施例14：化合物1在肥胖的adi-hRBP4小鼠中降低肝脏脂质水平。

根据先前的报告(Lee,S.-A.等人2016)，维持高脂饮食的adi-hRBP4小鼠的肝游离脂肪酸(FFA)和甘油三酸酯(TG)水平显著高于保持标准食物的转基因动物(图19；对于FFA和TG，P<0.0001)。化合物1的施用使FFA水平降低了30％(图11A；P＝0.0107)，TG水平降低了29％(图11B；P＝0.0104)。

与肝TG累积的动态一致，油红O染色的冷冻肝脏切片的组织学检查(图20A)和肝脂肪变性分级(图20A)证实，与没有显示出肝脂肪变性的证据的食物喂养的转基因小鼠相比，维持HFD的adi-hRBP4小鼠脂肪变性明显更多。

在用化合物1治疗的adi-hRBP4肥胖小鼠中观察到肝脂肪变性的显著改善，其与保持在HFD上的未治疗的adihRBP4小鼠相比，脂质滴显示出越来越少(图18B)。肝脂肪变性分级(图12B)显示，经化合物1治疗的HFD喂养的adihRBP4小鼠中脂肪变性程度显著降低了43％(P<0.001)，这进一步证实了化合物1缓解adi-hRBP4小鼠肝脂肪变性的能力。

实施例15：脂肪酸配体与RBP4的结合。

尚不清楚脂肪组织中RBP4表达的适度增加如何促进肝脂肪变性的发展。可以推测，RBP4的这种能力可能与内源性非类视黄醇配体的结合和运输有关，在这一点上其性质和数量尚不清楚。与RBP4与非类视黄醇配体相互作用的能力一致，以前的异源表达的RBP4的晶体学研究表明，来自表达宿主的偶然发现的脂肪酸配体(油酸和亚油酸)在RBP4的配体结合口袋中结合(Huang,H.-J.等人2009；Nanao,M.S.等人2009)。

Monaco及其同事报道的最新X射线晶体学和质谱发现证实RBP4能够结合脂肪酸(Perduca,M.等人2018)。视黄醇结合蛋白结合疏水性非类视黄醇配体的能力可能很一般，如最近描述的细胞视黄醇结合蛋白1与某些大麻素的相互作用所说明的那样(Silvaroli,J.A.等人2019)。

使用SPA试验测试棕榈酸、油酸、亚油酸和二十二碳六烯酸对RBP4的亲和力，所述SPA试验可测量纯化的人RBP4中放射性视黄醇的取代(图21A)。这些竞争结合实验证实了所测试的脂肪酸具有作为弱RBP4配体的功能。我们的对接模型也与RBP4结合脂肪酸配体的能力相一致。图13B显示了化合物3和对接在我们的3FMZ模型中的脂肪酸棕榈酸，油酸，亚油酸和二十二碳六烯酸以及对接在我们的5NU7(holo-RBP4)模型内的全反式视黄醇的重叠。该图显示了全反式视黄醇和化合物3之间的良好重叠，因为两者都呈现相似的几何构成并将其极性片段投射到结合腔的开口处，在那里它们分别与Gln98和Arg121进行H键相互作用。与全反式视黄醇和化合物3相似，脂肪酸还延伸其疏水性尾穿过窄的β-桶，并进入β-紫罗酮口袋，并且其极性羧酸结合至更靠近结合腔开口的残基，即Leu36和Phe36。

讨论

一方面，本发明涉及用于治疗NAFLD疾病的小分子。本文公开了小分子作为非类视黄醇RBP4拮抗剂治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)疾病的具体用途。本文所列出的化合物已经显示在生物学上显著的浓度下在体外结合RBP4和/或在体外拮抗RBP4-TTR相互作用。本文所述的另外的化合物是本文所列化合物的类似物，其在生物学上显著的浓度下在体外类似地结合RBP4，并在体外拮抗RBP4-TTR相互作用。

fenritinide[N-(4-羟基-苯基)视黄酰胺,4HRP]是先前开发的用于治疗癌症的类视黄醇药物。与其他类视黄醇药物相似，fenritinide是非特异性的，因此能够与多个药物靶标结合。它的抗癌活性归因于在噁性肿瘤细胞中产生活性氧和诱导细胞凋亡的能力。通过该化合物作为核受体RAR的配体的作用，介导了该化合物的一些其他活性。在fenritinide的不同活性范围内，其充当RBP4配体的能力得到了很好的表征。例如，发现fenritinide与RBP4结合，取代RBP4的全反式视黄醇(Berni 1992)，破坏RBP4-TTR相互作用(Berni 1992，Schaffer 1993)，降低血清RBP4和视黄醇(Adams 1995)，并抑制眼内全反式视黄醇摄取并减慢视觉周期(Radu 2005)。然而，从文献中知道，fenritinide在糖尿病和肥胖症模型中的有益作用并不由其作为RBP4拮抗剂的活性来介导。Koh 2012报道，fenritinide能够改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性并降低肝脂质水平。该观察结果与较早的报告一致，所述报告表明长期施用fenritinide可预防高脂饮食引起的肥胖、胰岛素抵抗和肝脂肪变性(Preitner 2009)。但是，在Preitner中有说服力地表明，鉴于fenritinide在降低RBP4基因敲除动物中的脂肪减少方面同样有效，因此其作为RBP4拮抗剂的活性并未介导fenritinide对减少HFD诱导的肥胖的有益作用。Motani 2009还证明了fenritinide在HFD喂养小鼠中提高胰岛素敏感性的能力与其作为RBP4拮抗剂的活性无关。总体而言，尽管Koh(以及Preitner和Motani的早期工作)示出了fenritinide在相关的HFD诱导的肥胖模型中的有益作用，Preitner和Motani的早期工作令人信服地将这些有益作用归因于fenritinide的与RBP4的参与无关的活性。由于这些原因，鉴于Koh 2012和Preitner 2009，本领域普通技术人员不会合理预期施用RBP4拮抗剂来治疗NAFLD疾病。

fenritinide也具有毒性和致畸性。因此，fenritinide的安全性特性可能与患有不危及生命病况的个体的长期给药不相容。

如以上简要讨论的那样，Koh 2012公开了fenritinide(“FEN”)在遗传性肥胖(ob/ob)小鼠中的用途。在Koh中，ob/ob小鼠被分为两组，并且两组均喂食高脂饮食(HFD)，但仅将FEN施用于一个组。Koh 2012报道FEN会降低高脂饮食喂养的的ob/ob小鼠的体重增加、胰岛素抵抗和脂肪肝。Koh还报告说FEN降低了循环中的RBP4和TTR水平(第371页)。此外，Koh报道了在FEN治疗的肥胖小鼠脂肪组织中RBP4水平降低(第374页右栏)。Koh指出，“在fenritinide治疗后，可能会将较低水平的循环脂质转运至包括肝脏在内的组织”(第374页右栏)。与Koh 2012相反，Lee 2016示出，在未施用高脂饮食的小鼠中，游离脂肪酸从脂肪组织重新分布到肝脏，而不是到Koh暗示的所有组织。

Koh 2012进一步表明，血浆脂联素水平在用媒介物治疗和FEN治疗的小鼠之间不同，这可能与FEN处理的小鼠中甘油三酸酯(TG)合成减少和游离脂肪酸(FFA)氧化增加有关。然而，由于脂联素刺激的转录因子PPARα水平的增加，Koh后来指出，他们的研究结果表明FEN可能普遍影响肥胖小鼠的脂肪酸氧化酶(第374至375页)。Koh进一步得出结论，较低的肝脏脂肪累积来自脂肪酸氧化增加，而不是脂肪形成减少(第375页)。相反，Lee 2016发现，TNF和瘦素表达增加会导致RBP4诱导脂肪组织中的炎症，从而导致脂解作用增加。Lee2016进一步指出，脂解作用所产生的游离脂肪酸被肝脏吸收，这会导致TG水平升高和肝脂肪变性。

因此，不仅示出了fenritinide在HFD诱导的肥胖模型中的积极属性与其作为RBP4拮抗剂的活性无关，而且示出了Koh 2012提出了其提议的用fenritinide治疗的错误机制。

此外，Koh 2012没有公开使用任何RBP4拮抗剂来治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，而且Koh的研究中使用的小鼠不是NAFLD的特定模型。相比之下，本申请中的数据来自肝脂肪变性(一种NAFLD疾病)的转基因模型。

因此，Koh 2012并未对RBP4拮抗剂能够成功治疗NAFLD提供任何合理的启示。

尽管Lee 2016公开了有充分的证据将RBP4的循环水平升高与NAFLD发生相关联(第1534页)，Lee 2016还指出了一些研究报告了证据表明RBP4和NAFLD之间缺乏关联(第1543页)。因此，尚不清楚RBP4循环水平升高在NAFLD发生中的完全作用。

Lee 2016进一步指出，肥胖的发展导致脂肪细胞表达的RBP4增加(第1534页)。然而，Lee明确指出：“RBP4是否能以肝脏自主方式真正刺激肝脂肪变性尚待确定”。与Koh2012相似，Lee 2016发现adi-hRBP4小鼠肝脏中的新生脂肪形成速率没有增加(第1540页)。但是，与Koh不同，Lee在游离脂肪酸(FFA)氧化中未发现任何统计学上显著的基因型依赖性差异。相反，Lee指出，其数据支持这样的结论，即肝脏对循环脂肪酸(FFA)摄取的增加“基本上”导致了在adi-hRBP4小鼠中观察到的脂肪肝表型。

然而，Lee 2016没有示出RBP4拮抗剂对adi-hRBP4小鼠有什么影响或RBP4拮抗剂对任何受试者有什么影响。例如，Lee 2016中公开的实验均未对受试者施用任何RBP4拮抗剂。事实上，Lee 2016并未建议可将RBP4拮抗剂用于治疗NAFLD。

在本文中，申请人尤其是已经示出，RBP4拮抗剂可以使肝脏中甘油三酸酯和游离脂肪酸的浓度正常化，从而治疗NAFLD疾病。

目前，没有FDA批准的对于任何形式的NAFLD的药物疗法。本发明鉴定了非类视黄醇RBP4拮抗剂，其可用于治疗NAFLD和其他以RBP4在脂肪细胞中过度积累为特征的病况。不希望被任何科学理论所束缚，因为RBP4在脂肪细胞中的积累似乎是NAFLD中脂肪肝的直接原因，本文所述的化合物是疾病调节剂，因为它们直接解决了NAFLD的原因。本发明提供了新颖的治疗方法，所述方法将治疗NAFLD患者以及患有以脂肪细胞中过量的RBP4为特征的病况的患者。

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