肠上皮细胞的制造方法及肠上皮细胞

摘要

本发明的课题在于，提供一种抑制从多能干细胞向肝细胞的分化的同时，维持屏障功能的肠上皮细胞的制造方法、以及抑制向肝细胞分化的同时，维持屏障功能的肠上皮细胞。根据本发明，提供一种肠上皮细胞的制造方法，其包括：工序1，使多能干细胞分化为肠道干细胞；及工序2，在选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1种以上和EGF的存在下，使在工序1中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞，上述方法中，在工序2中途，在本说明书中所定义的规定的时点重新接种1次以上分化中的细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及一种由多能干细胞制造肠上皮细胞的方法、以及由多能干细胞所制造的肠上皮细胞。

背景技术

小肠中存在许多药物代谢酶或药物转运体，因此与肝同样地，作为与药物的首过效应有关的器官非常重要。因此，关于评价小肠中的代谢及膜渗透性，在医药品、食品领域的研究中是很重要的。目前，作为小肠的模型系统，常用源自人结肠癌的Caco-2细胞。但是，Caco-2细胞中的药物转运体的表达模式与人的小肠不同。并且，Caco-2细胞几乎观察不到药物代谢酶的表达及酶诱导，因此难以准确地评价在小肠中的药代动力。因此，为了综合评价小肠中的药物代谢及膜渗透性，期望利用原代小肠上皮细胞，但很难从动物、尤其人的小肠获得肠上皮细胞。

在2007年由山中等人建立了人类人造多能干(induced pluripotent stem(诱导性多能干)：iPS)细胞。该人iPS细胞为与1998年由Thomson等人建立的人胚胎干(embryonicstem：ES)细胞相同的、具有多分化能力和几乎无限的增殖能力的细胞。与人ES细胞相比，人iPS细胞的伦理问题少，期待作为用于开发医药品的稳定的细胞供给源。因此，正在致力于从多能干细胞分化诱导肠上皮细胞。

专利文献1中记载有通过如下工序向肠上皮细胞分化诱导人工多能干细胞，该工序包括：使人工多能干细胞分化为内胚层细胞的工序；使在上述工序中所获得的内胚层细胞分化为肠道干细胞的工序；及使在上述工序中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞的工序，即包括选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1个以上的化合物和EGF的存在下进行的培养的工序。

专利文献2中记载有通过如下工序向肠上皮细胞分化诱导人工多能干细胞工序：(1)使人工多能干细胞分化为内胚层细胞的工序；(2)使在工序(1)中所获得的内胚层细胞分化为肠道干细胞的工序；及(3)使在工序(2)中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞的工序，即包括在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下，且在向细胞供给cAMP的条件下进行的培養的工序。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2014-132933号小册子

专利文献2：国际公开第2017/154795号小册子

发明内容

发明要解决的技术课题

为了从多能干细胞向肠上皮细胞分化诱导，一般需要连续进行几天～几十天培养基更换及试剂的添加。从操作的效率的方面考虑，分化诱导操作期望使用大型培养容器或培养皿来进行。另一方面，使用肠上皮细胞实施渗透性试验时，需要在安装于称作细胞培养插件的比较小型的培养用容器上的多孔膜上形成肠上皮细胞层。

在大型培养容器或培养皿中，将多能干细胞分化诱导至肠上皮细胞后，在细胞培养插件上的多孔膜重新接种细胞时，有可能不会充分形成肠上皮细胞层，从而失去渗透性试验所需的屏障功能。若从最初开始就在细胞培养插件上的多孔膜上进行从多能干细胞向肠上皮细胞的分化诱导，则虽形成肠上皮细胞层，但培养操作的效率差。

因此，需要能够在维持肠上皮细胞的屏障功能的同时进行重新接种的培养方法。

并且，已知肠上皮细胞的条件与分化诱导为肝细胞的条件类似，所以有可能在从多能干细胞向肠上皮细胞诱导的过程中，一部分细胞分化为肝细胞。若肝细胞污染到肠上皮细胞，则有可能影响试验结果，因此要求减少所污染的肝细胞的方法。

本发明所要解决的课题在于，提供一种抑制从多能干细胞向肝细胞的分化的同时，维持屏障功能的肠上皮细胞的制造方法。本发明所要解决的课题在于，还提供一种抑制向肝细胞的分化的同时，维持屏障功能的肠上皮细胞。

用于解决技术课题的手段

本发明人等为了解决上述课题进行深入研究的结果，发现能够通过如下解决上述课题，即通过使多能干细胞分化为肠道干细胞的工序、及在选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1个以上和EGF的存在下，使上述肠道干细胞分化为肠上皮细胞的工序来制造肠上皮细胞时，在分化为肠上皮细胞的工序途中，在以下规定的时点重新接种1次以上分化中的细胞。本发明是根据这些见解而完成的。

即，根据本发明提供以下发明。

＜1＞一种肠上皮细胞的制造方法，其包括：工序1，使多能干细胞分化为肠道干细胞；及工序2，在选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1种以上和EGF的存在下，使在工序1中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞，上述方法中，在工序2中途，在以下任一时点重新接种1次以上分化中的细胞。

(a)多能干细胞开始分化后的15天～25天的时点；

(b)开始工序2后的第4天以后，且距离结束工序2的5天以上之前的时点；

(c)将整个工序2的期间长度设为1时，开始工序2后，经过0.2～0.7长度期间的时点；

(d)开始工序2后，将成人肠道中的肠特异性同源盒的表达量设为100时，肠特异性同源盒的相对表达量为300以下的时点；

(e)开始工序2后，将成人肠道中的CDX2的表达量设为100时，CDX2的相对表达量为150以下的时点；或

(f)开始工序2后，将成人肠道中的绒毛蛋白的表达量设为100时，绒毛蛋白的相对表达量为100以下的时点。

＜2＞根据＜1＞所述的方法，其中，在工序2中途，在以下任一时点重新接种1次以上分化中的细胞。

(a)多能干细胞开始分化后的21天～25天的时点；

(b)开始工序2后的第10天以后，且距离结束工序2的5天以上之前的时点；

(c)将整个工序2的期间长度设为1时，开始工序2后，经过0.5～0.7长度期间的时点；

(d)开始工序2后，将成人肠道中的肠特异性同源盒的表达量设为100时，肠特异性同源盒的相对表达量为300以下的时点；

(e)开始工序2后，将成人肠道中的CDX2的表达量设为100时，CDX2的相对表达量为150以下的时点；或

(f)开始工序2后，将成人肠道中的绒毛蛋白的表达量设为100时，绒毛蛋白的相对表达量为100以下的时点。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，在工序2中途，重新接种1次以上分化中的细胞时的重新接种的培养基为包含ROCK抑制剂的培养基。

＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的方法，其中，工序2包括在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下，使在工序1中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞的工序。

＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的方法，其中，在工序2中，在多孔膜上进行细胞的重新接种。

＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的方法，其中，在表面积为30cm

＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的方法，其中，在1孔的表面积为3cm

＜8＞一种肠上皮细胞，其由＜1＞至＜7＞中任一项所述的方法获得。

＜9＞根据＜8＞所述的肠上皮细胞，其中，作为肝标志物的白蛋白的表达量为Caco-2细胞中的白蛋白的表达量的同等水平以下。

发明效果

根据本发明，能够制造抑制从多能干细胞向肝细胞的分化的同时，维持屏障功能的肠上皮细胞。本发明的肠上皮细胞维持屏障功能，且抑制肝细胞的污染。

附图说明

图1表示比较例1～3及实施例1～4的分化培养方法的概要。

图2表示经时测定小肠标志物的表达量的结果。纵轴表示将Adult Intestine(成人肠道)中的表达量设为100时的小肠标志物的相对表达量，横轴表示多能干细胞开始分化后的天数。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

[术语说明]

MEK1：Mitogen-activated protein kinase kinase 1(丝裂原激活蛋白激酶)

TGFβ受体：转化生长因子β受体

EGF：上皮细胞生长因子

LIF：白血病抑制因子

bFGF：碱性成纤维细胞生长因子

SCF：干细胞因子

FGF2：成纤维细胞生长因子2

GSK-3β：糖原合成酶激酶3β

cAMP：环状腺苷一磷酸

ROCK：Rho-associatedcoiled-coilformingkinase(Rho相关的卷曲螺旋形成蛋白激酶)/Rho结合激酶

BMP4：骨形成蛋白质4

VEGF：血管内皮细胞生长因子

FBS：胎牛血清

[肠上皮细胞的制造方法]

基于本发明的肠上皮细胞的制造方法包括将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞谱系。根据本发明，可获得显示出与构成活体的肠道组织的肠上皮细胞类似的特性的细胞即肠上皮细胞。

基于本发明的肠上皮细胞的制造方法为包括如下工序的方法：工序1，使多能干细胞分化为肠道干细胞；及工序2，在选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1种以上和EGF的存在下，使在工序1中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞。在基于本发明的肠上皮细胞的制造方法中，在工序2中途，在以下任一时点重新接种1次以上分化中的细胞。

(a)多能干细胞开始分化后的15天～25天的时点；

(b)开始工序2后的第4天以后，且距离结束工序2的5天以上之前的时点；

(c)将整个工序2的期间长度设为1时，开始工序2后，经过0.2～0.7长度期间的时点；

(d)开始工序2后，将成人肠道中的肠特异性同源盒的表达量设为100时，肠特异性同源盒的相对表达量为300以下的时点；

(e)开始工序2后，将成人肠道中的CDX2的表达量设为100时，CDX2的相对表达量为150以下的时点；或

(f)开始工序2后，将成人肠道中的绒毛蛋白的表达量设为100时，绒毛蛋白的相对表达量为100以下的时点。

通过在上述(a)～(f)中的任一时点重新接种1次以上，能够维持屏障功能的同时，重新接种细胞。由此，能够在大型培养容器或培养皿中有效培养至中途后，细分到细胞培养插件上的多孔膜中重新接种，从而提高培养操作的效率。

另外，通过在上述(a)～(f)中的任一时点重新接种1次以上，能够大幅减少所污染的肝细胞。

“多能干细胞”是指兼备能够分化为构成活体的所有细胞的能力(分化多能性)和经过细胞分裂产生具有与自身相同的分化能力的子细胞的能力(自我复制能力)的细胞。分化多能性能够通过将评价对象的细胞移植到裸鼠中并试验有无形成包含三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的各自的细胞的畸胎瘤来评价。

作为多能干细胞，能够举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞；embryonic germ cell)、人工多能干细胞(iPS细胞)等，只要是兼备分化多能性及自我复制能力的细胞，则并不限定于此。优选使用ES细胞或iPS细胞。更优选使用iPS细胞。多能干细胞优选为哺乳动物(例如，人或黑猩猩等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类)的细胞，尤其优选为人的细胞。因此，在本发明的最优选的方式中，使用人iPS细胞作为多能干细胞。

ES细胞例如能够通过培养植入前的早期胚胎、构成早期胚胎的内部细胞团、单个卵裂球等来建立(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Thomson,J.A.et al.,Science,282,1145-1147(1998))。作为早期胚胎，可以使用通过核移植体细胞核而制作出的早期胚胎(Wilmut et al.(Nature,385,810(1997))、Cibelli et al.(Science,280,1256(1998))、入谷明等人(蛋白质核酸酶，44,892(1999))、Baguisi et al.(NatureBiotechnology,17,456(1999))、Wakayama et al.(Nature,394,369(1998)；NatureGenetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))、Rideout III etal.(Nature Genetics,24,109(2000)、Tachibana et al.(Human Embryonic Stem CellsDerived by Somatic Cell Nuclear Transfer,Cell(2013)inpress)。作为早期胚胎，可以使用孤雌发育胚(Kim et al.(Science,315,482-486(2007))、Nakajima et al.(StemCells,25,983-985(2007))、Kim et al.(Cell Stem Cell,1,346-352(2007))、Revazovaet al.(Cloning Stem Cells,9,432-449(2007))、Revazova et al.(Cloning StemCells,10,11-24(2008))。除了上述的论文以外，关于ES细胞的制作，可参考StrelchenkoN.,et al.Reprod Biomed Online.9：623-629,2004；KlimanskayaI.,et al.Nature 444：481-485,2006；Chung Y.,et al.Cell Stem Cell 2：113-117,2008；Zhang X.,et al StemCells 24：2669-2676,2006；Wassarman,P.M.et al.Methods in Enzymology,Vol.365,2003等。另外，通过ES细胞与体细胞的细胞融合而获得的融合ES细胞也包含于本发明的方法中所使用的胚胎干细胞中。

ES细胞中也有能够从保存机构获得的细胞或市售的细胞。例如，人ES细胞能够由京都大学再生医科学研究所(例如KhES-1、KhES-2及KhES-3)、WiCell ResearchInstitute、ESIBIO等获得。

EG细胞能够通过在LIF、bFGF、SCF的存在下培养原始生殖细胞等来建立(Matsuiet al.,Cell,70,841-847(1992)、Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(23),13726-13731(1998)、Turnpenny et al.,Stem Cells,21(5),598-609,(2003))。

“人工多能干细胞(iPS细胞)”是指通过初始化因子的导入等重编程体细胞来制作的具有多能(多分化能力)和增殖能力的细胞。人工多能干细胞显示出与ES细胞接近的性质。iPS细胞的制作中所使用的体细胞并不受特别限定，可以为分化的体细胞，也可以为未分化的干细胞。并且，其来源也不受特别限定，但优选使用哺乳动物(例如，人或黑猩猩等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类)的体细胞，尤其优选使用人的体细胞。iPS细胞能够通过至今为止报道的各种方法来制作。并且，当然也可设想适用今后开发的iPS细胞制作法。

iPS细胞制作法的最基本的方法为利用病毒将作为转录因子的Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc这4种因子导入细胞的方法(Takahashi K,Yamanaka S：Cell 126(4),663-676,2006；Takahashi,K,et al：Cell 131(5),861-72,2007)。关于人iPS细胞，有通过导入Oct4、Sox2、Lin28及Nanog这4种因子来建立的报道(Yu J,et al：Science 318(5858),1917-1920,2007)。还报道有通过导入除c-Myc以外的3种因子(Nakagawa M,et al：Nat.Biotechnol.26(1),101-106,2008)、导入Oct3/4及Klf4这2种因子(Kim J B,et al：Nature 454(7204),646-650,2008)或仅导入Oct3/4(Kim J B,et al：Cell 136(3),411-419,2009)来建立iPS细胞。并且，还报道有将作为基因的表达产物的蛋白质导入细胞的方法(Zhou H,Wu S,Joo JY,et al：Cell Stem Cell 4,381-384,2009；Kim D,Kim CH,MoonJI,et al：Cell Stem Cell 4,472-476,2009)。另一方面，还报道有通过使用对组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294或组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等来提高制作效率或减少所导入的因子等(Huangfu D,et al：Nat.Biotechnol.26(7),795-797,2008；Huangfu D,et al：Nat.Biotechnol.26(11),1269-1275,2008；Silva J,et al：PLoS.Biol.6(10),e 253,2008)。关于基因导入法也进行了研究，除了将逆转录病毒利用于基因导入的技术以外，还开发出将慢病毒(Yu J,et al：Science 318(5858),1917-1920,2007)、腺病毒(Stadtfeld M,et al：Science 322(5903),945-949,2008)、质粒(Okita K,et al：Science 322(5903),949-953,2008)、转座子载体(Woltjen K,Michael IP,MohseniP,et al：Nature 458,766-770,2009；Kaji K,Norrby K,Paca A,et al：Nature 458,771-775,2009；Yusa K,Rad R,Takeda J,et al：Nat Methods 6,363-369,2009)或附加体型载体(Yu J,Hu K,Smuga-Otto K,Tian S,et al：Science 324,797-801,2009)利用于基因导入的技术。

能够以Fbxo15、Nanog、Oct4、Fgf-4、Esg-1及Cript等多能干细胞标志物(未分化标志物)的表达等为指标而选择发生了向iPS细胞的转化即初始化(重编程)的细胞。将所选择的细胞作为iPS细胞而回收。

例如，也能够从国立大学法人京都大学或独立行政法人理化学研究所生物资源中心提供iPS细胞。

在本说明书中，“分化诱导”是指促使按照特定的细胞谱系分化。在本发明中，将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞。基于本发明的肠上皮细胞的制造方法大体包括2个阶段的诱导工序，即，使多能干细胞分化为肠道干细胞的工序(工序1)和使所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞的工序(工序2)。以下，对各工序的详细内容进行说明。

＜工序1：向肠道干细胞的分化＞

工序1中，培养多能干细胞，并将其分化为肠道干细胞。换言之，在诱导向肠道干细胞的分化的条件下培养多能干细胞。多能干细胞只要分化为肠道干细胞，则培养条件并不受特别限定。典型地，进行以下说明的2个阶段的分化诱导，即，多能干细胞向内胚层细胞的分化(工序1-1)和内胚层细胞向肠道干细胞的分化(工序1-2)，以使多能干细胞经由内胚层细胞分化为肠道干细胞。

工序1-1：向内胚层细胞的分化

在该工序中，培养多能干细胞，并将其分化为内胚层。换言之，在诱导向内胚层的分化的条件下培养多能干细胞。多能干细胞只要分化为内胚层细胞，则培养条件并不受特别限定。例如，按照常规方法在添加了重组人激活素A的培养基中培养。此时，将培养基中的重组人激活素A的浓度例如设为10ng/mL～200ng/mL，优选设为20ng/mL～150ng/mL。从细胞的增殖率或维持等观点考虑，优选在培养基中添加血清或血清替代物(KnockOut

也可以将Wnt/β-连环蛋白信号通路的抑制剂(例如，六氯酚、槲皮素、作为Wnt配体的Wnt3a)添加到培养基中来谋求促进向内胚层细胞的分化。

该工序也能够利用国际公开第2014/165663号小册子中所记载的方法或依照该方法的方法来进行。

工序1-1的期间(培养期间)例如为1天～10天，优选为2天～7天。

工序1-2：向肠道干细胞的分化

在该工序中，培养工序1-1中所获得的内胚层细胞，并将其分化为肠道干细胞。换言之，在诱导向肠道干细胞的分化的条件下培养内胚层。内胚层细胞只要分化为肠道干细胞，则培养条件并不受特别限定。优选为在FGF2的存在下或GSK-3β抑制剂的存在下进行培养。作为FGF2，优选使用人FGF2(例如人重组FGF2)。

典型地，将经过工序1-1而获得的细胞群或其一部分不进行挑选而供于工序1-2。另一方面，也可以从经过工序1-1而获得的细胞群中挑选内胚层细胞后实施工序1-2。内胚层细胞的挑选例如以细胞表面标志物为指标用流式细胞仪(细胞分选仪)进行即可。

“在FGF2的存在下”的含义与在培养基中添加有FGF2的条件相同。因此，为了进行在FGF2的存在下的培养，使用添加有FGF2的培养基即可。若示出FGF2的添加浓度的例子，则为100ng/mL～500ng/mL。

同样地，“在GSK-3β抑制剂的存在下”的含义与在培养基中添加有GSK-3β抑制剂的条件相同。因此，为了进行在GSK-3β抑制剂的存在下的培养，使用添加有FGF2的培养基即可。作为GSK-3β抑制剂，能够例示CHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、1-Azakenpaullone。若示出GSK-3β抑制剂的添加浓度的例子(CHIR99021的情况)，则为1μmol/L～100μmol/L，优选为3μmol/L～30μmol/L。

工序1-2的期间(培养期间)例如为2天～10天，优选为3天～7天。若培养期间过短，则无法充分获得所期待的效果(提高分化效率、促进获得作为肠道干细胞的功能)。另一方面，若培养期间过长，则引起分化效率的降低。

例如，能够以肠道干细胞标志物的表达为指标来判定或评价分化为肠道干细胞。若举出肠道干细胞标志物的例子，则为包含富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5(LGR5)、肝配蛋白B2受体(EphB2)。

＜工序2：向肠上皮细胞的分化＞

工序2中，并用选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1个以上和EGF，使在工序1中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞。作为“选自包含MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂的组中的1个以上”，可以为MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂中的1个(即，MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂或TGFβ受体抑制剂中的任一个)，可以为MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂中的2个(即，MEK1抑制剂与DNA甲基化抑制剂的组合、MEK1抑制剂与TGFβ受体抑制剂的组合、或者DNA甲基化抑制剂与TGFβ受体抑制剂的组合)，也可以为MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂及TGFβ受体抑制剂全部。

工序2尤其优选包括在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下，使在工序1中所获得的肠道干细胞分化为肠上皮细胞的工序。

典型地，将经过工序1而获得的细胞群或其一部分不进行挑选而供于工序2。另一方面，也可以从经过工序1而获得的细胞群中挑选肠道干细胞后实施工序2。肠道干细胞的挑选例如以细胞表面标志物为指标进行流式细胞仪(细胞分选仪)即可。

工序2由1或2个以上的培养构成(详细内容后述)。在构成工序2的各培养中，例如使用添加有EGF及cAMP激活物质作为必须成分的培养基、添加有EGF、cAMP激活物质、DNA甲基化抑制剂、MEK1抑制剂及TGFβ受体抑制剂作为必须成分的培养基、添加有EGF作为必须成分的培养基、添加有EGF及ROCK抑制剂作为必须成分的培养基等。

作为MEK1抑制剂，能够举出PD98059、PD184352、PD184161、PD0325901、U0126、MEKinhibitorI、MEKinhibitorII、MEK1/2inhibitorII、SL327。

作为DNA甲基化抑制剂，能够举出5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2’dc)、5-氮杂胞苷、RG108、泽布拉林(Zebularine)。

关于TGFβ受体抑制剂，若考虑后述的实施例中所使用的A8301对TGF-β受体ALK4、ALK5、ALK7显示出抑制活性，则优选使用对TGF-β受体ALK4、ALK5、ALK7中的一种以上显示出抑制活性的受体抑制剂。例如，A8301、SB431542、SB-505124、SB525334、D4476、ALK5inhibitor、LY2157299、LY364947、GW788388、RepSox满足上述条件。

作为cAMP激活物质，能够使用毛喉素(Forskolin)、吲哚美辛、NKH477(考福新达普酸盐)、源自细胞的毒素蛋白(百日咳毒素、霍乱毒素)、PACAP-27、PACAP-38、SKF83822等。毛喉素显示出腺苷酸环化酶激活作用，促进细胞内cAMP的合成。

若示出MEK1抑制剂的添加浓度的例子(PD98059的情况)，则为4μmol/L～100μmol/L，优选为10μmol/L～40μmol/L。同样地，若示出DNA甲基化抑制剂的添加浓度的例子(5-氮杂-2-脱氧胞苷的情况)，则为1μmol/L～25μmol/L，优选为2.5μmol/L～10μmol/L，若示出TGFβ受体抑制剂的添加浓度的例(A8301的情况)，则为0.1μmol/L～2.5μmol/L，优选为0.2μmol/L～1μmol/L。EGF的添加浓度的例子为5ng/mL～100ng/mL，优选为10ng/mL～50ng/mL。并且，若示出cAMP激活物质的添加浓度的例子(毛喉素的情况)，则为1μmol/L～200μmol/L，优选为5μmol/L～100μmol/L。另外，关于使用与所例示出的化合物即PD98059、5-氮杂-2-脱氧胞苷、A8301及毛喉素不同的化合物时的添加浓度，若考虑所使用的化合物的特性与所例示出的化合物(PD98059、5-氮杂-2-脱氧胞苷、A8301、毛喉素)的特性的差异(尤其是活性的差异)，只要是本领域技术人员，则能够依据上述浓度范围进行设定。并且，能够通过依据后述的实施例的预备实验来确认所设定的浓度范围是否适当。

工序2的期间(培养期间)例如为7天～40天，优选为10天～30天。若培养期间过短，则无法充分获得所期待的效果(提高分化效率、促进获得作为肠上皮细胞的功能)。另一方面，若培养期间过长，则引起分化效率的降低。

例如，能够以肠上皮细胞标志物的表达或肽的吸入或经由维生素D受体的药物代谢酶的表达诱导为指标而判定或评价分化为肠上皮细胞。若举例肠上皮细胞标志物，则为绒毛蛋白1(Villin 1)、CDX2、肠特异性同源盒(ISX)、ATP结合盒转运体B1/多重耐药蛋白1(ABCB1/MDR1)、ATP结合盒转运体G2/乳腺癌耐药蛋白(ABCG2/BCRP)、细胞色素P4503A4(CYP3A4)、脂肪酸结合蛋白2(FABP2)、孕烷X受体(PXR)、SLC(solute carrier：溶质运载)家族成员5A1/钠偶联型葡萄糖转运体1(SLC5A1/SGLT1)、SLC(solute carrier)家族成员15A1/肽转运体1(SLC15A1/PEPT1)、SLC(solute carrier)有机阴离子转运体2B1(SLCO2B1/OATP2B1)、蔗糖酶-异麦芽糖酶、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A4(UGT1A4)、羧酸酯酶2A1(CES2A1)。其中，绒毛蛋白1(Villin 1)、CDX2、肠特异性同源盒(ISX)为尤其有效的标志物。

若想要获得仅由目标细胞(肠上皮细胞)构成的细胞群或以高比率(高纯度)包含目标细胞的细胞群，则以目标细胞的特征性细胞表面标志物为指标而挑选并分取培养后的细胞群即可。

优选进行以下的A～D中的任一培养工序作为工序2。

＜培养工序A＞

培养工序A中，进行(a-1)在EGF及cAMP激活物质的存在下的培养和在其之后进行的(a-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养。若如此进行2个阶段的培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。(a-1)的培养期间例如为2天～10天，优选为4天～8天，(a-2)的培养期间例如为9天～29天，优选为7天～27天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。

＜培养工序B＞

培养工序B中，进行(b-1)在EGF的存在下的培养和在其之后进行的(b-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养。若如此进行2个阶段的培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。(b-1)的培养期间例如为2天～10天，优选为4天～8天，(b-2)的培养期间例如为9天～19天，优选为7天～17天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。

在(b-2)的培养后，可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((b-3)的培养)。该培养期间例如设为1天～10天。若进行该培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。

＜培养工序C＞

培养工序C中，进行(c-1)在EGF及cAMP激活物质的存在下的培养和在其之后进行的(c-2)在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养。若如此进行2个阶段的培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。(c-1)的培养期间例如为2天～10天，优选为4天～8天，(c-2)的培养期间例如为9天～19天，优选为7天～17天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。

在(c-2)的培养后，可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((c-3)的培养)。该培养期间例如设为1天～10天。若进行该培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。

＜培养工序D＞

在培养工序D中，进行在(d-1)MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质的存在下的培养。该培养工序在培养操作简便、对向肠上皮细胞的分化更有效、由于是化合物而能够期待稳定的效果等方面尤其有利。(d-1)的培养期间例如为15天～25天，优选为17天～23天。另外，关于没有特别说明的事项(各培养中能够使用的化合物、各化合物的添加浓度等)，援用上述对应的说明。

在(d-1)的培养后，可以进行在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂及EGF的存在下的培养((d-2)的培养)。该培养期间例如设为1天～10天。若进行该培养，则能够期待促进向肠上皮细胞的分化、成熟化、获得功能的效果。

在能够构成本发明的各工序(工序1、工序1-1、工序1-2、工序2、工序a-1、工序a-2、工序b-1、工序b-2、工序b-3、工序c-1、工序c-2、工序c-3、工序d-1、工序d-2)中，可以在中途进行传代培养(重新接种)。

例如，在成为汇合或亚汇合时，采集细胞的一部分，将其移到另一培养容器中，继续培养。为了促进分化，优选将细胞密度设定为较低。例如以1×10

进行伴随培养基更换或传代培养等的、细胞的回收时，为了抑制细胞死亡，利用Y-27632等ROCK抑制剂预先处理细胞即可。因此，优选为在工序2中途，重新接种1次以上分化中的细胞时的重新接种的培养基为包含ROCK抑制剂的培养基。

在本发明中，在工序2中途，在以下任一时点重新接种1次以上分化中的细胞。

(a)开始分化多能性干细胞后，15天～25天的时点(优选为16天～24天的时点，进一步优选为17天～23天的时点。并且，从另一观点考虑，优选为21天～25天的时点，更优选为22天～24天的时点，尤其优选为23天的时点)；

(b)开始工序2后的第4天以后，且距离结束工序2的5天以上之前的时点(优选为开始工序2后的第10天以后，且距离结束工序2的5天以上之前的时点、更优选为开始工序2后的第11天以后，且距离结束工序2的5天以上之前的时点)；

(c)将工序2的整个期间的长度设为1时，开始工序2后，经过0.2～0.7长度期间的时点(优选为经过0.5～0.7长度期间的时点，进一步优选为经过0.6长度期间的时点)；

(d)开始工序2后，将成人肠道中的肠特异性同源盒的表达量设为100时，肠特异性同源盒的相对表达量为300以下的时点(优选为250以下，进一步优选为200以下的时点)；

(e)开始工序2后，将成人肠道中的CDX2的表达量设为100时，CDX2的相对表达量为150以下的时点(优选为130以下，进一步优选为110以下的时点)；或

(f)开始工序2后，将成人肠道中的绒毛蛋白的表达量设为100时，绒毛蛋白的相对表达量为100以下的时点(优选为85以下，进一步优选为70以下的时点)；

优选在工序2中，在多孔膜上进行细胞的重新接种。通过在多孔膜上进行细胞的重新接种，能够使用所获得的肠上皮细胞，直接进行小肠中的药物代谢及膜渗透性的评价。多孔膜是指具有所贯穿的细孔的膜。作为多孔膜，例如能够使用具有多个孔径0.4～1.0μm左右的细孔的聚碳酸酯膜或聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜等。

在本发明中，优选为在表面积为30cm

构成本发明的各工序中的其他培养条件(培养温度等)设为在动物细胞的培养中一般采用的条件即可。即，例如在37℃、5％CO

[肠上皮细胞]

根据本发明，提供一种由基于上述本发明的肠上皮细胞的制造方法所获得的肠上皮细胞。本发明的肠上皮细胞优选为作为肝标志物的白蛋白的表达量为Caco-2细胞中的白蛋白的表达量的同等水平以下。

本发明还涉及由本发明的方法所获得的肠上皮细胞的用途。作为第1用途，提供各种测定。本发明的肠上皮细胞能够利用于肠道、尤其是小肠的模型系统，并且对肠道、尤其是小肠中的药代动力(吸收、代谢等)的评价或毒性的评价有用。换言之，本发明的肠上皮细胞能够利用于化合物的体内动态的评价或毒性的评价。

具体而言，能够使用本发明的肠上皮细胞对被检物质的吸收性或膜渗透性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导、毒性等进行试验。即，本发明提供评价被检物质的吸收性或膜渗透性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导、毒性等的方法(第1方式)作为肠上皮细胞的用途之一。在该方法中，进行如下工序：(i)准备由利用本发明的制造方法而获得的肠上皮细胞构成的细胞层的工序、(ii)使被检物质与上述细胞层接触的工序、(iii)将渗透了上述细胞层的被检物质进行定量，并评价被检物质的吸收性或膜渗透性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序。另外，关于被检物质的吸收性，也能够利用后述的方法(第2方式)进行评价。

在工序(i)中，典型地，在半渗透性膜(多孔性膜)上培养肠上皮细胞，使其形成细胞层。具体而言，例如使用具备细胞培养插件(culture insert)的培养容器(例如，CorningIncorporated Co.,Ltd.提供的Transwell(注册商标))，在培养插件内接种细胞进行培养，由此获得由肠上皮细胞构成的细胞层。

细胞培养插件是具备使用于细胞、器官或组织的培养中的渗透性膜片的培养容器，主要与孔板组合来使用。通过在细胞培养插件中培养细胞、器官或组织，培养基中包含的成分能够遍布到器官或组织的上表面及底面，且能够在接近活体内的条件下进行培养。

工序(ii)中的“接触”典型地通过在培养基中添加被检物质来进行。被检物质的添加定时并不受特别限定。因此，可以在不包含被检物质的培养基中开始培养后，在某一时间点添加被检物质，也可以在预先包含被检物质的培养基中开始培养。

被检物质中能够使用各种各样的分子大小的有机化合物或无机化合物。作为有机化合物的例子，能够例示出核酸、肽、蛋白质、脂质(简单脂质、复合脂质(磷酸甘油酯、鞘脂、甘油醇糖脂、脑苷脂等)、前列腺素、类异戊二烯、萜烯、类固醇、多酚、儿茶素、维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等)。医药品、营养食品、食品添加物、农药、美容品(化妆品)等已知成分或候选成分也是优选的被检物质之一。也可以将植物提取液、细胞提取液、培养上清液等用作被检物质。可以通过同时添加2种以上的被检物质来调查被检物质之间的相互作用、相乘作用等。被检物质可以源自天然物，或也可以通过合成进行制造。在后者的情况下，例如能够利用组合合成方法构建高效率的测定系统。

能够任意地设定接触被检物质的期间。接触期间例如为10分钟～3天，优选为1小时～1天。可以分多次进行接触。

在工序(iii)中，将渗透了细胞层的被检物质进行定量。例如，当使用如Transwell(注册商标)那样的具备细胞培养插件的培养容器时，根据被检物质，利用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法：fluoroimmunoassay)、酶免疫测定法(EIA法：enzyme immunoassay)等测定方法将渗透了细胞培养插件的被检物质即经由细胞层移动到上部或下部容器内的被检物质进行定量。根据定量结果(渗透了细胞层的被检物质的量)和被检物质的使用量(典型地，在培养基中的添加量)，判定并评价被检物质的吸收性或膜渗透性、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性。

本发明还提供一种评价被检物质的代谢或吸收的方法作为另一方式(第2方式)。在该方法中，进行(I)使被检物质与利用本发明的分化诱导方法而获得的肠上皮细胞接触的工序和(II)测定并评价被检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序。

工序(I)即肠上皮细胞与被检物质的接触能够与上述工序(ii)同样地实施。但是，不必预先形成细胞层。

在工序(I)后，测定并评价被检物质的代谢或吸收、药物相互作用、药物代谢酶的诱导、药物转运体的诱导或毒性的工序(工序(II))。在紧接工序(I)后即被检物质的接触后，可以不隔开实质性的时间间隔而测定并评价代谢等，或者，可以经过一定的时间(例如10分钟～5小时)后测定并评价代谢等。代谢的测定例如能够通过检查代谢产物来进行。在该情况下，通常将工序(I)后的培养液作为样品而定性或定量测定可预想的代谢产物。测定方法只要根据代谢产物选择适当的方法即可，例如能够采用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等。

典型地，在检测出被检物质的代谢产物时，判定或评价为“被检物质被代谢”。并且，能够根据代谢产物的量来评价被检物质的代谢量。也可以根据代谢产物的検出结果和被检物质的使用量(典型地，在培养基中的添加量)来计算出被检物质的代谢效率。

也能够以肠上皮细胞中的药物代谢酶(细胞色素P450(尤其是CYP3A4)、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶(尤其是UGT1A8、UGT1A10)、硫酸转移酶(尤其是SULT1A3等))的表达为指标而测定被检物质的代谢。药物代谢酶的表达能够以mRNA水平或蛋白质水平来评价。例如，当发现药物代谢酶的mRNA水平上升时，能够判定为“被检物质被代谢”。同样地，当发现药物代谢酶的活性上升时，能够判定为“被检物质被代谢”。与将代谢产物作为指标而进行判定的情况同样地，可以根据药物代谢酶的表达量进行定量判定和评价。

为了评价被检物质的吸收，例如测定培养液中的被检物质的残留量。通常，将工序(I)后的培养液作为样品而将被检物质进行定量。测定方法只要根据被检物质选择适当的方法即可。例如，能够采用质谱分析、液相色谱法、免疫学方法(例如荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法))等。典型地，当发现培养液中的被检物质的含量降低时，判定并评价为“被检物质被吸收”。并且，能够根据降低程度来判定并评价被检物质的吸收量或吸收效率。另外，也能够通过测定吸入细胞内的被检物质的量来评价吸收。

另外，也可以同时或并行进行代谢的测定和评价及吸收的测定和评价。

作为利用本发明的分化诱导方法而制备出的肠上皮细胞的第2用途，提供一种含有肠上皮细胞的细胞制剂。本发明的细胞制剂能够适用于各种肠道疾病的治疗。尤其，可设想作为受损伤的(包括机能障碍)肠上皮组织的再生/重建用材料的利用。即，能够期待对再生医疗的贡献。本发明的细胞制剂例如能够通过将利用本发明的方法而获得的肠上皮细胞悬浮于生理盐水或缓冲液(例如磷酸类缓冲液)等中或者使用肠上皮细胞制作三维组织体(有机体或球体)来制备。作为单剂量，例如含有1×10

本发明的细胞制剂中可以含有以细胞的保护为目的的二甲基亚砜(DMSO)或血清白蛋白等、以防止细菌的混入为目的的抗生物质等、以细胞的活化、增殖或分化诱导等为目的的各种成分(维生素类、细胞因子、成长因子、类固醇等)。另外，本发明的细胞制剂中可以含有制剂上可接受的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、镇痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。

通过以下实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不限定于实施例的范围。

实施例

＜人iPS细胞的培养＞

在涂布基质胶(注册商标)的培养皿上接种人iPS细胞(FF-1)，且在5％O

＜人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导＞

图1示出比较例1～3、实施例1～4的分化培养方法的概要。

在图1中，符号及缩写如下所示。

培养条件1：

包含Activin A的RPMI 1640培养基及包含BMP4、VEGF、FGF2、EGF的RPMI 1640培养基

培养条件2：

包含2％FBS、1％Glutamax、250ng/mL FGF2的DMEM/F12

培养条件3：

包含2％FBS、1％Glutamax、1％NEAA、2％B27 supplement、1％N2 supplement、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)的DMEM/F12

培养条件4：

包含20ng/mL EGF的Advanced DMEM/F12(Thermo fisher scientific)

Y：Y-27632

F：Forskolin

a：5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2’dc)

P：PD98059

A：A8301

比较例1中，在第11天进行了重新接种。

比较例2及比较例3中，在第11天及第29天进行了重新接种。

实施例1及实施例2中，在第11天及第17天进行了重新接种。

实施例3及实施例4中，在第11天及第23天进行了重新接种。

＜比较例1＞

在Activin A存在下的培养及BMP4，VEGF，FGF2，EGF存在下的培养将人iPS细胞(FF-1)总计培养7天(第0天～第7天)，进一步，利用包含2％FBS、1％Glutamax、250ng/mLFGF2的DMEM/F12进行4天(第7天～第11天)的培养，向肠道干细胞分化诱导。

之后，添加Y-27632(Rho结合激酶抑制剂)以成为10μmol/L，利用肌酸酶剥离在CO

之后，利用包含2％FBS、1％Glutamax、1％NEAA、2％B27 supplement、1％N2supplement、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)、10μmol/L Y-27632的DMEM/F12培养1天(第11天～第12天)，利用包含2％FBS、1％Glutamax、1％NEAA、2％B27 supplement、1％N2 supplement、100单位/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)、30μmol/L Forskolin的Advanced DMEM/F12培养6天(第12天～第18天)，进一步将5μmol/L 5-aza-2’dc、20μmol/L PD98059、0.5μmol/L A8301添加到上述培养基并培养12天(第18天～第30天)，而获得了肠上皮细胞。

＜比较例2＞

在与比较例1相同的条件下将人iPS细胞(FF-1)培养11天，而向肠道干细胞分化诱导。在与比较例1相同的条件下剥离细胞并进行了接种。

之后，在与比较例1相同的条件下培养1天(第11天～第12天)、6天(第12天～第18天)，进一步与比较例1相同地添加5-aza-2’dc、PD98059、A8301并培养11天(第18天～第29天)后，利用肌酸酶将细胞从培养容器剥离，并重新接种于细胞培养插件上的多孔膜(表面积为0.33cm

重新接种后，利用包含20ng/mL EGF的Advanced DMEM/F12培养1天(第29天～第30天)，利用包含20ng/mL EGF、30μmol/L Forskolin、5μmol/L 5-aza-2’dc、20μmol/LPD98059、0.5μmol/L A8301的Advanced DMEM/F12培养4天(第30天～第34天)，而获得了肠上皮细胞。

＜比较例3＞

在重新接种当天(第29天)添加Y-27632到10μmol/L，利用肌酸酶剥离在CO

＜实施例1＞

在与比较例1相同的条件下将人iPS细胞(FF-1)培养11天，而向肠道干细胞分化诱导。在与比较例1相同的条件下剥离细胞并进行了接种。

之后，在与比较例1相同的条件下培养1天(第11天～第12天)、5天(第12天～第17天)后，利用肌酸酶将细胞从培养容器剥离，并重新接种于细胞培养插件上的多孔膜(表面积为0.33cm

重新接种后，利用包含20ng/mL EGF的Advanced DMEM/F12培养1天(第17天～第18天)，利用包含20ng/mL EGF、30μmol/L Forskolin、5μmol/L 5-aza-2’dc、20μmol/LPD98059、0.5μmol/L A8301的Advanced DMEM/F12培养12天(第18天～第30天)，而获得了肠上皮细胞。

＜实施例2＞

在重新接种当天(第17天)添加Y-27632以成为10μmol/L，利用肌酸酶剥离在CO

＜实施例3＞

在与比较例1相同的条件下将人iPS细胞(FF-1)培养11天，而向肠道干细胞分化诱导。在与比较例1相同的条件下剥离细胞并进行了接种。

之后，在与比较例1相同的条件下培养1天(第11天～第12天)、6天(第12天～第18天)，进一步与比较例1相同地添加5-aza-2’dc、PD98059、A8301并培养5天(第18天～第23天)后，利用肌酸酶将细胞从培养容器剥离，并重新接种于细胞培养插件上的多孔膜(表面积为0.33cm

重新接种后，利用包含20ng/mL EGF的Advanced DMEM/F12培养1天(第23天～第24天)，利用包含20ng/mL EGF、30μmol/L Forskolin、5μmol/L 5-aza-2’dc、20μmol/LPD98059、0.5μmol/L A8301的Advanced DMEM/F12培养6天(第24天～第30天)，而获得了肠上皮细胞。

＜实施例4＞

在重新接种当天(第23天)添加Y-27632到10μmol/L，利用肌酸酶剥离在CO

＜试验例1＞

由咪达唑仑的代谢产物的量对在比较例1～3及实施例1～4中所获得的肠上皮细胞的CYP3A4活性进行了测定。结束分化诱导后，在包含5μmol/L咪达唑仑的培养基中在37℃下孵化，经过2小时后，对培养基进行了取样。根据使用液相色谱-质谱仪(LC-MS/MS)测定出的培养基中的1-氢氧化咪达唑仑的量计算出代谢活性。在代谢试验结束后进行蛋白质定量，并以蛋白质量校正了代谢活性。将结果示于表1。

相对于比较例1，实施例1、2、4示出了相同的CYP3A4活性。实施例3中，CYP3A4活性稍微降低，但为实用上没有问题的水平。

＜试验例2＞

对在各个试验组中的重新接种日，在Transwell接种细胞，并培养至试验结束日的细胞的屏障功能(transepithelial electrical resistance：TEER(跨膜电阻))进行了测定。使用EVOM

实施例1～4示出了与比较例1相同的充分的屏障功能(200Ω·cm

＜试验例3＞

在试验结束日，RNeasy(注册商标)迷你试剂盒(Qiagen)从在试验例2中保持屏障功能的比较例1、实施例1～4的肠上皮细胞提取了RNA。操作按照所附手册。作为逆转印反应，互补的DNA(cDNA)的合成使用了High capacity RNA-to-cDNA Kit(高容量RNA-to-cDNA试剂盒)(applied biosystems)。操作按照所附手册。

使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix(基因表达预混液)(applied biosystems)，以cDNA为模板进行实时逆转印聚合酶链反应(Real-Time RT-PCR)。操作按照手册。作为内源对照使用核糖体的18S校正了测定结果。使用各种基因的探针估计了mRNA的表达量。将结果示于表3。表3中的数值中，关于小肠标志物，表示将AdultIntestine中的表达量设为100时的相对表达量，关于肝标志物，表示将Caco-2中的表达量设为100时的相对表达量。

比较例1、实施例1～4中均确认到小肠标志物Villin1、CDX2、ISX的表达。另外，在实施例1～4中，作为肝标志物的ALB(albumin)、AFP(α-fetoprotein)的表达量低于比较例1。尤其，在实施例3及4中，ALB及AFP的表达量显著降低。

＜试验例4＞

在与比较例1相同的条件下，进行了人iPS细胞(FF-1)的培养及分化诱导。分为4组开始培养及分化诱导，在第11天，第20天，第25天，第30天的时点，1次进行1组与试验例3相同的试验，并检查了小肠标志物Villin1、CDX2、ISX的表达。将结果示于图2。图2中的数值表示将Adult Intestine中的表达量设为100时的相对表达量。

可知小肠标志物的表达量从第25天急剧增加(＝急剧进行向肠上皮细胞的分化)。结合试验例2的结果来考虑，为了不会对肠上皮细胞的屏障功能带来不良影响，当小肠标志物表达为第25前后的量时，期望进行重新接种操作。

[表1]

表1：CYP3A4活性(pmol/2小时/mg protein)

[表2]

表2：屏障功能(TEER：Ω*cm

[表3]

表3：mRNA表达量