使用营养缺陷型可调控细胞进行基因治疗的方法和组合物

摘要

本公开内容提供了用于产生和使用修饰的营养缺陷型宿主细胞以用于涉及施用营养缺陷型因子的改进的基因治疗的组合物和方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本国际申请要求2018年5月10日提交的美国临时申请U.S.62/669,848的优先权，将所述临时申请以其整体通过引用并入本文。

序列表

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公开内容的领域

本文的公开内容涉及具有改善的功效和安全性的基因治疗方法、组合物和试剂盒。

背景

已显示细胞疗法提供有前景的治疗。然而，将修饰的细胞再引入人类宿主具有风险，包括免疫反应、恶性转化、或过度产生或缺乏对转基因的控制。

基因工程的一些方法能够控制人类细胞的功能，如细胞信号传导、增殖或凋亡(参见，Bonifant等人,Mol.Ther.-Oncolytics 3,16011(2016)；Sockolosky等人,(2018).Science(80-.).359,1037–1042Tey,(2014)Clin.Transl.Immunol.3,e17；将其各自通过引用以其整体并入本文)，并且使控制细胞疗法的甚至严重的副作用成为可能(Bonifant等人,2016)。尽管取得了这些进步，但其它应用仍被阻碍，不能获得广泛的应用，例如将工程化的多能细胞用于再生医学(参见，Ben-David和Benvenisty,2011,Nat.Rev.Cancer 11,268–277.；Lee等人,2013,Nat.Med.19,998–1004；Porteus,M.(2011)Mol.Ther.19,439–441；将其各自通过引用以其整体并入本文)，这是由于依赖于将基因编码的控制机制引入细胞的控制系统具有多种限制的事实导致的(Tey,2014)。

可能出现的两个主要问题是“泄漏(leakiness)”，即在没有触发的情况下机制的低水平活动(参见，Ando等人,(2015)Stem Cell Reports 5,597–608，将其通过引用以其整体并入本文)，以及在机制活化时缺乏整个细胞群体的移除(参见,Garin等人,(2001)Blood97,122–129；Di Stasi等人,(2011)N Engl J Med 365,1673–1683；Wu等人(2014)N Engl JMed 365,1673–1683；Yagyu等人,(2015)Mol.Ther.23,1475–1485；将其各自通过引用以其整体并入本文)，这是由于外部控制有一些逃脱机制。例如，通过病毒转导引入的转基因可以通过细胞的表达而沉默(参见,

安全开关(switch)的现有模式也具有许多风险，如(1)将转基因插入肿瘤抑制子中导致细胞系的致癌转化，以及(2)将转基因插入表观遗传学上沉默的区域中导致缺乏表达并因此缺乏功效，或随后转基因在插入后的表观遗传学沉默。基因组不稳定性是细胞致癌转化中的常见表型。此外，可以迅速选择并扩增外源性自杀开关的点突变或基因缺失。基于靶向细胞的信号传导途径的安全开关取决于细胞的生理学。例如，处于“促存活”模式的细胞可以表达半胱天冬酶抑制剂，防止自杀开关诱导时的细胞死亡。

基因治疗的特别有吸引力的应用涉及治疗由基因产物的不足引起的病症或可通过基因产物(例如治疗性蛋白、抗体或RNA)的表达增加来治疗的病症。

最近的进展允许对人类细胞的基因组进行精确修饰。虽然这种基因工程能够实现广泛的应用，但还需要新的方法来控制细胞行为。用于细胞的替代控制系统是营养缺陷型，其可以通过靶向代谢中的基因进行工程化。已经针对微生物探索了这一概念(参见，Steidler等人,(2003)Nat.Biotechnol.21,785–789，将其通过引用以其整体并入本文)，并且已被酵母遗传学家广泛地用作近乎通用的研究工具。如果它是通过基因敲除而不是通过引入复杂的控制机制产生的，并且如果营养缺陷型是针对作为细胞内源性代谢的一部分的无毒化合物，则它在哺乳动物细胞中将是特别强大的。这可以通过破坏代谢途径中的必需基因来实现，允许只有该途径的产物在外部提供并被细胞从其环境中摄取时，细胞才能发挥功能。此外，如果相应的基因也参与细胞毒性剂的活化，则基因敲除(KO)将使细胞对该药物具有抗性，从而能够耗尽细胞群体中的未修饰的细胞并纯化工程化细胞。一些单基因先天性代谢错误可以通过提供代谢物来治疗，因此可被视为人类营养缺陷型的模型。

公开内容的概述

在一些实施方案中，本文公开了供体模板，其包含：(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。在一些实例中，所述供体模板是单链的。在一些实例中，所述供体模板是双链的。在一些实例中，所述供体模板是质粒或DNA片段或载体。在一些实例中，所述供体模板是质粒，所述质粒包含复制必需的元件，任选地包含启动子和3’UTR。在一些实施方案中，本文公开了载体，其包含：(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和(b)编码治疗因子的转基因。在一些实例中，所述载体是病毒载体。在一些实例中，所述载体选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。在一些实例中，所述载体还包含所述病毒载体复制必需的基因。在一些实例中，所述转基因在两侧连接有与所述营养缺陷型诱导基因座的片段或其互补物同源的核苷酸序列。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座是编码参与营养缺陷型因子的合成、再循环或救助的蛋白质的基因。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在表1中的基因内或在表1中控制基因表达的区域内。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码尿苷单磷酸合成酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码全羧化酶合成酶的基因内。在一些实例中，与所述营养缺陷型诱导基因座的片段同源的核苷酸序列与所述营养缺陷型诱导基因座的至少200个连续的核苷酸是98％相同的。在一些实例中，与所述营养缺陷型诱导基因座的片段同源的核苷酸序列与人类尿苷单磷酸合成酶或全羧化酶合成酶或表1中所述基因的任一种的至少200个连续的核苷酸是98％相同的。在一些实例中，所述供体模板或载体还包含与所述转基因可操作连接的表达控制序列。在一些实例中，所述表达控制序列是组织特异性表达控制序列。在一些实例中，所述表达控制序列是启动子或增强子。在一些实例中，所述表达控制序列是诱导型启动子。在一些实例中，所述表达控制序列是组成型启动子。在一些实例中，所述表达控制序列是转录后调控序列。在一些实例中，所述表达控制序列是微小RNA。在一些实例中，所述供体模板或载体还包含标志物基因。在一些实例中，所述标志物基因包含NGFR或EGFR的至少一个片段、CD20或CD19的至少一个片段、Myc、HA、FLAG、GFP、抗生素抗性基因。在一些实例中，所述转基因选自激素、细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素、白介素结合蛋白、酶、抗体、Fc融合蛋白、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白、受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂、以及共刺激因子、结构蛋白、细胞表面抗原、离子通道、表观遗传修饰剂或RNA编辑蛋白。在一些实例中，所述转基因编码T细胞抗原受体。在一些实例中，所述转基因编码RNA，任选地调控性微小RNA。

在一些实施方案中，本文公开了用于靶向整合转基因至营养缺陷型诱导基因座的核酸酶系统，其包含cas9蛋白，和对营养缺陷型诱导基因座具有特异性的向导RNA。在一些实施方案中，本文公开了用于使转基因靶向整合至营养缺陷型诱导基因座的核酸酶系统，其包含对所述营养缺陷型诱导基因座具有特异性的兆核酸酶。在一些实例中，所述兆核酸酶是ZFN或TALEN。在一些实例中，所述核酸酶系统还包含本文公开的供体模板或载体。

在一些实施方案中，本文公开了离体的修饰的宿主细胞，其包含：编码在营养缺陷型诱导基因座处整合的治疗因子的转基因，其中所述修饰的宿主细胞针对营养缺陷型因子是营养缺陷型的并且能够表达所述治疗因子。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是人类细胞。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(iPS)细胞、成体干细胞、分化细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、NK细胞、B细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞来源于待用所述修饰的宿主细胞治疗的对象的细胞。

在一些实施方案中，本文公开了产生修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：(a)将靶向并切割所述营养缺陷型诱导基因座处的DNA的一种或多种核酸酶系统，或者编码所述一种或多种核酸酶系统的一种或多种组分的核酸引入所述哺乳动物宿主细胞以及(b)将本文公开的供体模板或载体引入所述哺乳动物宿主细胞。在一些实例中，所述方法还包括引入第二核酸酶或第二向导RNA以靶向并切割在第二基因组基因座处的DNA，或者引入编码所述第二核酸酶或第二向导RNA的核酸以及任选地(b)第二供体模板或载体。

在一些实施方案中，本文公开了将转基因靶向整合至离体哺乳动物细胞中营养缺陷型诱导基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与本文公开的供体模板或载体，以及核酸酶接触。在一些实例中，所述核酸酶是ZFN。在一些实例中，所述核酸酶是TALEN。

在一些实施方案中，本文公开了产生修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：将以下物质引入所述哺乳动物宿主细胞中：(a)Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的核酸，(b)对营养缺陷型诱导基因座具有特异性的向导RNA或编码所述向导RNA的核酸，和(c)本文公开的供体模板或载体。所述方法还包括将以下物质引入所述哺乳动物宿主细胞中：(a)对第二营养缺陷型诱导基因座具有特异性的第二向导RNA或编码所述向导RNA的核酸，以及任选地(b)第二供体模板或载体。

在一些实施方案中，本文公开了靶向整合转基因至离体哺乳动物细胞中营养缺陷型诱导基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与本文公开的供体模板或载体、cas9多肽和向导RNA接触。在一些实例中，所述向导RNA嵌合RNA。在一些实例中，所述向导RNA包含两个杂交的RNA。在一些实例中，所述方法在所述营养缺陷型诱导基因座内产生一个或多个单链断裂。在一些实例中，所述方法在所述营养缺陷型诱导基因座内产生双链断裂。在一些实例中，使用所述供体模板或载体通过同源重组来修饰所述营养缺陷型诱导基因座。在一些实例中，在扩增所述细胞以及任选地培养所述细胞之前或之后进行步骤(a)和(b)。在一些实例中，所述方法还包括(c)选择含有整合至所述营养缺陷型诱导基因座中的所述转基因的细胞。在一些实例中，所述选择包括：(i)选择需要所述营养缺陷型因子以存活的细胞；以及任选地(ii)选择包含整合至所述营养缺陷型诱导基因座中的所述转基因的细胞。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座是编码尿苷单磷酸合成酶的基因，并且通过与5-FOA接触来选择所述细胞。

在一些实施方案中，本文公开了无菌组合物，其含有所述供体模板或载体，或者所述核酸酶系统，和无菌水或药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文公开了无菌组合物，其包含所述修饰的哺乳动物宿主细胞和无菌水或药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文公开了试剂盒，其含有前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体或核酸酶系统或修饰的宿主细胞或它们的组合，任选地具有容器或小瓶。

在一些实施方案中，本文公开了在对象中表达治疗因子的方法，其包括：(a)施用所述修饰的宿主细胞；(b)任选地施用调理方案(conditioning regime)以允许修饰的细胞植入；以及(c)施用所述营养缺陷型因子。在一些实例中，同时施用所述修饰的宿主细胞和营养缺陷型因子。在一些实例中，依次施用所述修饰的宿主细胞和营养缺陷型因子。在一些实例中，持续定期施用所述营养缺陷型因子一段时间，所述时间足以促进所述治疗因子表达。在一些实例中，减少所述营养缺陷型因子的施用以减少所述治疗因子的表达。在一些实例中，增加所述营养缺陷型因子的施用以增加所述治疗因子的表达。在一些实例中，停止所述营养缺陷型因子的施用以产生导致所述修饰的宿主细胞的生长抑制或死亡的状况。在一些实例中，暂时中断所述营养缺陷型因子的施用以产生导致所述修饰的宿主细胞的生长抑制的状况。在一些实例中，所述营养缺陷型因子的施用持续足以在对象中发挥治疗效果的时间。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是再生的。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞的施用包括局部递送。在一些实例中，所述所述营养缺陷型因子的施用包括全身递送。在一些实例中，修饰之前的宿主细胞来源于待治疗的对象。

在一些实施方案中，本文公开了治疗患有疾病、病症或病况的对象的方法，其包括：向所述对象施用足以产生治疗量的所述治疗因子表达的量的(a)所述修饰的宿主细胞和(b)所述营养缺陷型因子。在一些实例中，所述疾病、所述病症或所述病况选自癌症，帕金森病，移植物抗宿主病(GvHD)，自身免疫病况，过度增殖性病症或病况，恶性转化，肝脏病况，遗传病况包括遗传性遗传缺陷、青少年发病型糖尿病和眼腔病况。在一些实例中，所述疾病、所述病症或所述病况影响身体的至少一种系统，所述系统选自肌肉系统、骨骼系统、循环系统、神经系统、淋巴系统、呼吸内分泌系统、消化系统、排泄系统和生殖系统。

在一些实施方案中，本文公开了本文公开的修饰的宿主细胞用于治疗疾病、病症或病况中的用途。在一些实施方案中，本文公开了本文公开的修饰的宿主细胞，其用于施用至人类或者用于治疗疾病、病症或病况。

在一些实施方案中，本文公开了营养缺陷型因子，其用于向已经接收修饰的人类宿主细胞的人类施用。

在一些实施方案中，本文公开了缓解或治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用：(a)包含修饰的宿主细胞的组合物，所述修饰的宿主细胞包含编码在营养缺陷型诱导基因座处整合的蛋白质的转基因，其中所述修饰的宿主细胞对营养缺陷型因子是营养缺陷型的；和(b)足以产生所述蛋白质的治疗性表达的量的营养缺陷型因子。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码尿苷单磷酸合成酶(UMPS)的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是尿苷。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码全羧化酶合成酶(HLCS)的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是生物素。在一些实例中，所述蛋白质是酶。在一些实例中，所述蛋白质是抗体。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(iPS)细胞、成体干细胞、分化细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、NK细胞、B细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实例中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞来源于待用修饰的宿主细胞治疗的对象。在一些实例中，同时施用所述组合物和所述营养缺陷型因子。在一些实例中，依序施用所述组合物和所述营养缺陷型因子。在一些实例中，所述组合物在所述营养缺陷型因子之前施用。在一些实例中，同时施用所述组合物和所述营养缺陷型因子。在一些实例中，定期连续施用所述营养缺陷型因子持续足以促进所述蛋白质的治疗性表达的时间段。在一些实例中，减少所述营养缺陷型因子的施用以减少所述蛋白质的表达。在一些实例中，增加所述营养缺陷型因子的施用以增加所述蛋白质的表达。在一些实例中，停止所述营养缺陷型因子的施用诱导所述修饰的宿主细胞的生长抑制或细胞死亡。在一些实例中，所述营养缺陷型因子的施用持续足以在所述对象中发挥治疗效应的时间。在一些实例中，所述修饰的宿主细胞是再生的。在一些实例中，所述组合物的施用包括局部递送。在一些实例中，所述营养缺陷型因子的施用包括全身递送。在一些实例中，所述疾病是溶酶体贮积病(LSD)。在一些实例中，所述LSD是高雪氏病(1/2/3型)、MPS2(亨特氏)病、庞贝氏症、法布里病、克拉伯病、磷酸酶过少症、尼曼匹克病A/B型、MPS1、MPS3A、MPS3B、MPS3C、MPS3、MPS4、MPS6、MPS7、苯丙酮尿症、MLD、山德霍夫氏病、Tay-Sachs病或巴顿病。在一些实例中，所述酶是葡糖脑苷脂酶、艾度硫酸酯酶、阿糖苷酶α、半乳糖苷酶α/β、半乳糖神经酰胺酶、Asfotasealfa、酸性鞘磷脂酶、拉罗尼酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、Elosulfase alfa、Glasulfate、B-葡糖苷酸酶、苯丙氨酸羟化酶、芳基硫酸酯酶A、己糖胺酶-B、己糖胺酶-A或三肽基肽酶1。在一些实例中，所述疾病是弗里德希氏共济失调、遗传性血管性水肿或脊髓性肌肉萎缩症。在一些实例中，所述蛋白质是共济蛋白、C1酯酶抑制剂(其也可以被称为

本文所述的各种实施方案提供了减小对象中的肿瘤大小或降低对象中的肿瘤生长率的方法，所述方法包括：向所述对象施用本文所述的修饰的人类宿主细胞。

通过引用并入

将本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每份单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地表示为通过引用并入。

附图简述

在所附权利要求书中具体阐述了本公开内容所涵盖的主题的特征。通过参考阐述了示例性实施方案的以下详细描述将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，其中利用了本文公开内容所涵盖的主题的原理，以及附图：

图1A和图1B例示出血清对电穿孔后最佳恢复的影响。图1A是用于确定最佳电穿孔恢复条件的测定的示例性示意图。电穿孔后，向细胞提供/不提供血清、5-氟乳清酸(5-FOA)或外源性尿嘧啶来源(尿苷)。图1B说明了在指示的培养基条件下电穿孔后恢复4天后通过CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)进行的细胞计数。该图显示了施用血清的细胞，在没有血清的情况下用/不用5-FOA处理的模拟编辑的细胞，和在没有血清的情况下用/不用5-FOA处理的尿苷单磷酸合成酶(UMPS)敲除细胞。

图2A-图2F例示出含有UMPS InDel的细胞的维持和生长需要外源性尿嘧啶来源。图2A是用于在电穿孔和回收后测定UMPS或模拟编辑的T细胞生长的程序的示例性示意图。图2B说明了在指示的培养条件下通过UMPS InDel的分解(TIDE)分析来示踪indel。用寡核苷酸UMPS-O-1和UMPS-O-2对UMPS基因座进行Sanger测序来进行TIDE分析。图2C说明了通过在第8天进行的TIDE分析的含有移码InDel的等位基因的百分比。图2D说明了通过TIDE鉴定的含有等位基因的第8天的细胞的预测的绝对数。图2E说明了在具有/没有UMP的情况下的细胞计数的时间过程。图2F说明了在具有/没有尿苷的情况下的细胞计数的时间过程。

图3A-图3C例示出5-FOA在UMPS靶向细胞系中毒性较小。图3A是5-FOA选择程序的示例性示意图。图3B和图3C说明了在指示的培养条件下5-FOA选择4天后的细胞计数。在图3B和图3C中，模拟结果由每种培养条件的左边柱条表示，UMPS-7的结果由每种培养条件的右边柱条表示。

图4A-图4D例示出5-FOA选择的UMPS靶细胞系仅在外源性尿嘧啶来源存在下才表现出最佳生长。图4A是用于显示尿嘧啶营养缺陷型的方案的示例性示意图。在5-FOA中选择4天后，将细胞培养物分到测试培养基中，并在细胞计数前再生长4天。图4B-图4D说明了在含有或缺乏外源性尿嘧啶(UMP或尿苷)的培养基中5-FOA选择的细胞的细胞计数。

图5A例示出通过ICE分析在UMPS基因座进行的InDel定量。图5B例示出模拟处理、CCR5敲除或UMPS敲除后T细胞的增殖。图5C说明了在具有或没有UMP或尿苷的情况下具有UMPS敲除的T细胞的增殖。图5D说明了在不同培养条件下UMPS敲除后第8天的InDel频率。图5E说明了被预测为导致移码的InDel的频率。

图6A例示出用于靶向UMPS基因座的DNA供体构建体。图6B说明了靶向K562细胞后表面标志物的表达。图6C例示出将纳米荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)整合至HBB基因座中的靶向方法。图6D说明了在细胞分选前K562细胞中3种整合标志物的表达。图6E说明了当在不同尿苷浓度存在下培养时，第8天的K562细胞生长和细胞计数。图6F说明了在具有5-FOA的情况下培养期间UMPS

图7A例示出T细胞的UMPS靶向后的表面标志物表达。图7B说明了UMPS

通过如使用Prism 7(GraphPad)指示的统计学检验来比较各组。星号表示统计显著性水平：*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。

详述

I.引言

最近的进展允许对人类细胞的基因组进行精确的修饰。虽然这种基因工程能够实现广泛的应用，但还需要新的方法来控制细胞行为。用于细胞的替代控制系统是营养缺陷型，其可以通过靶向代谢中的基因进行工程化。本文所述的通过破坏代谢的中心基因来基因工程化营养缺陷型的方法是产生对细胞功能的外部控制机制的替代范例，尚未针对人类细胞对其进行探索。通过破坏嘧啶代谢中的关键基因，产生了被动的遏制(containment)系统(Steidler等人,2003)，其是用于人类细胞的系统的现有工具箱的补充和替代，规避了先前提到的局限性。它能够通过添加或撤除无毒物质尿苷来控制人类细胞的生长。先前已经在微生物中例如通过引入工程化的基因回路而针对非天然物质(参见，Kato,Y.(2015)Anengineered bacterium auxotrophic for an unnatural amino acid:a novelbiological containment system.PeerJ 3,e1247,将其通过引用以其整体并入本文)或通过细菌基因的敲除而针对嘧啶(参见，Steidler等人(2003)Nat.Biotechnol.21,785–789,将其通过引用以其整体并入本文)工程化营养缺陷型。后一个概念是吸引人的，因为它依赖于基因的敲除而不是复杂表达盒的引入，这阻止了细胞逆转基因修饰或抗性机制的发展，因此解决了替代系统的这种挑战。嘧啶核苷和核苷酸在广泛的细胞过程(包括DNA和RNA合成、能量转移、信号转导和蛋白质修饰)中起重要作用的事实(参见van Kuilenburg,A.B.P.和Meinsma,R.(2016).Biochem.Biophys.Acta-Mol.Basis Dis.1862,1504–1512，将其通过引用以其整体并入本文)使其合成途径成为理论上吸引人的目标。

人类细胞对于某些化合物(如必须从外部来源或共生有机体中获得的氨基酸)是天然营养缺陷型的(参见，Murray,P.J.(2016).Nat.Immunol.17,132–139,将其通过引用以其整体并入本文)。另外，营养缺陷型是例如通过差别供给或耗尽细胞营养缺陷的代谢物而调节免疫细胞功能的天然机制(参见，Grohmann等人,(2017).Cytokine Growth FactorRev.35,37–45,将其通过引用以其整体并入本文)。细胞营养缺陷型在防御恶性生长的机制中也起着重要作用，例如，在通过清除精氨酸抑制肿瘤生长的巨噬细胞的情况下(Murray,2016)。另外，已经显示一些恶性细胞类型对于某些代谢物是营养缺陷型的(参见，Fung,M.K.L.和Chan,G.C.F.(2017).J.Hematol.Oncol.10,144,将其通过引用以其整体并入本文)，这是通过天冬酰胺的治疗性耗尽用于治疗白血病患者来开发的(参见，Hill等人,(1967).JAMA 202,882)。

除了先前开发的用于微生物的遏制策略外，本文所述的使用基于Cas9核糖核蛋白(RNP)/rAAV6的基因编辑的方法允许对原代和治疗相关的人类细胞类型进行高效工程化。虽然营养缺陷型和对5-FOA的抗性对于完全破坏UMPS基因的所有细胞是固有的，但为了显示概念证明，通过选择标志物的靶向整合，用双等位基因敲除促进群体的鉴定。最近开发的方法允许对原代人类细胞进行有效的靶向修饰(Bak等人(2017)。

使用CRISPR/Cas9和AAV6对人类造血干细胞和祖细胞的多重基因工程(Elife 6,e27873；Bak,等人,(2018).Nat.Protoc.13,358–376；Porteus,M.H.和Baltimore,D.(2003).Science(80-.).300,763–763；将其各自通过引用以其整体并入本文)以及建立代谢营养缺陷型为在需要使用人类细胞的背景中，例如在具有特定效应子功能和降低的免疫原性的干细胞或干细胞衍生的组织或其它自体体细胞的使用中，进一步开发治疗性方法奠定了基础。显然，已经使用了会促进加速的临床翻译的构建体和试剂，例如在避免免疫原性的靶向构建体中的选择标志物tNGFR和tEGFR，以及使用其FDA批准的前药在体内模型中提供的尿苷。

控制细胞功能的工程化机制具有选择表达介导控制机制的蛋白质的完全纯的细胞群体的另外的挑战。通过使工程化细胞对细胞毒性剂具有抗性来选择所述工程化细胞的可能性是特别吸引人的，这是因为其可以通过允许产生可以使用无毒物质控制的高纯度细胞群体而显著提高效率，以及对重要代谢途径的功能至关重要的基因的去除防止细胞发展逃脱机制。因此，这种方法在遗传不稳定性和恶性转化的风险起作用并且甚至少量逃脱它们遏制的细胞可能具有灾难性作用(例如在体细胞或多能干细胞的使用中)的背景中提供了优于现有控制机制的一些优点。

已经针对微生物探索了这一概念(Steidler等人,2003)，并且被酵母遗传学家广泛地用作近乎通用的研究工具。如果它是通过基因敲除而不是通过引入复杂的控制机制产生的，并且如果营养缺陷型是针对作为细胞内源性代谢的一部分的无毒化合物，则它在哺乳动物细胞中将是特别强大的。这可以通过破坏代谢途径中的必需基因来实现，允许只有该途径的产物在外部提供并被细胞从其环境中摄取时，细胞才能发挥功能。此外，如果相应的基因也参与细胞毒性剂的活化，则基因敲除(KO)将使细胞对该药物具有抗性，从而能够耗尽细胞群体中的未修饰的细胞并纯化工程化细胞。一些单基因先天性代谢错误可以通过提供代谢物来治疗，因此可被视为人类营养缺陷型的模型。

在某些实施方案中，通过基因组编辑破坏从头嘧啶合成途径中的UMPS，将营养缺陷型引入人类细胞。这使得细胞的功能依赖于外源性尿苷的存在。此外，这取消了细胞将5-氟乳清酸代谢成5-FU的能力，使得能够耗尽具有完整UMPS等位基因的剩余细胞。通过基因工程化营养缺陷型使用代谢物影响人类细胞功能和耗尽其它细胞的能力为需要纯的可控细胞群体的一系列应用提供了这种方法的发展。

一个实例是遗传性乳清酸尿症，其中UMPS基因中的突变导致可以通过补充高剂量的尿苷来治疗的功能障碍(参见，Fallon等人,(1964).N.Engl.J.Med.270,878–881,将其通过引用以其整体并入本文)。将这一概念转移至感兴趣的细胞类型，基因工程用于敲除人类细胞中的UMPS基因，这使得细胞对尿苷是营养缺陷型的和对5-氟乳清酸(5-FOA)具有抗性。我们显示UMPS-/-细胞系和原代细胞仅在体外存在尿苷的情况下存活和增殖，并且在体内没有补充尿苷的情况下抑制UMPS工程化细胞增殖。此外，可以通过在5-FOA存在下培养从混合群体中选择细胞。

在某些实施方案中，通过基因组编辑破坏从头嘧啶合成途径中的UMPS，将营养缺陷型引入人类细胞。这使得细胞的功能依赖于外源性尿苷的存在。此外，这取消了细胞将5-氟乳清酸代谢成5-FU的能力，使得能够耗尽具有完整UMPS等位基因的剩余细胞。通过基因工程化营养缺陷型使用代谢物影响人类细胞功能和耗尽其它细胞的能力为需要纯的可控细胞群体的一系列应用提供了这种方法的发展。

营养缺陷型的一个实例是遗传性乳清酸尿症，其中UMPS基因中的突变导致可以通过补充高剂量的尿苷来治疗的功能障碍(Fallon等人,1964)。将这一概念转移至感兴趣的细胞类型，基因工程用于敲除人类细胞中的UMPS基因，这使得细胞对尿苷是营养缺陷型的和对5-氟乳清酸(5-FOA)具有抗性。本文显示UMPS-/-细胞系和原代细胞仅在体外存在尿苷的情况下存活和增殖，并且在体内没有补充尿苷的情况下抑制UMPS工程化细胞增殖。此外，可以通过在5-FOA存在下培养从混合群体中选择细胞。

II.某些实施方案的组合物和使用方法

本文公开了用于基因治疗的方法和组合物的一些实施方案。在一些实例中，所述方法包括将编码治疗因子的转基因以使修饰的宿主细胞营养缺陷型的，并可以通过转基因表达提供基因治疗的改进的功效、效力和/或安全性的方式递送至宿主细胞。将转基因递送至特定的营养缺陷型诱导基因座产生了营养缺陷型细胞(例如，通过基因的破坏或敲除或者基因活性的下调)，其现在依赖于营养缺陷型因子的持续施用用于生长和繁殖。在一些实例中，所述方法包括靶向营养缺陷型诱导基因座的核酸酶系统，用于插入转基因的供体模板或载体，试剂盒，以及使用这种系统、模板或载体以产生是营养缺陷型的且能够表达引入的转基因的修饰的细胞的方法。

在一些实施方案中，本文还公开了使用修饰的宿主细胞的方法、组合物和试剂盒，其包括药物组合物、治疗方法和施用营养缺陷型因子以控制-增加、减少或停止-修饰的细胞的生长和繁殖以及控制转基因的表达和控制治疗因子的水平的方法。

在一些实例中，可以通过诸如同源重组的方法实现转基因至期望基因座的递送。如本文所用，“同源重组(HR)”是指在DNA中双链断裂的修复期间经由同源定向修复机制插入核苷酸序列。该过程使用与断裂区域中的核苷酸序列具有同源性的“供体”分子或“供体模板”作为修复双链断裂的模板。双链断裂的存在促进了供体序列的整合。供体序列可以被物理整合或用作经由同源重组修复断裂的模板，导致引入全部或部分核苷酸序列。这个过程被产生双链断裂的许多不同的基因编辑平台使用，如兆核酸酶、如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9基因编辑系统。

在一些实施方案中，将基因递送至两个或更多个基因座，例如，用于表达多种治疗因子，或用于引入第二基因，所述第二基因充当合成调节物或用于将修饰的细胞偏向特定谱系(例如，通过表达来自第二基因座的转录因子)。在一些实施方案中，将基因递送至两个或更多个营养缺陷型诱导基因座。例如，将不同基因或相同基因的第二拷贝递送至第二营养缺陷型诱导基因座。

在一些实施方案中，因为细胞不再具有产生营养缺陷型因子的能力，所以细胞是营养缺陷型的。如本文所用，“细胞”、“修饰的细胞”或“修饰的宿主细胞”是指起源于相同细胞的细胞群体，所述群体中的每个细胞具有相似的遗传组成并保留相同的修饰。

在一些实施方案中，营养缺陷型因子包括一种或两种或更多种营养物、酶、改变的pH、改变的温度、非有机分子、非必需氨基酸、或改变的部分浓度(与正常生理浓度相比)、或它们的组合。本文中对营养缺陷型因子的所有提及涉及多种因子的施用。在本文所述的任何实施方案中，营养缺陷型因子是在足以维持修饰的宿主细胞的浓度下在对象中既无毒性也不是生物可利用的营养物或酶，并且应理解，在整个申请中任何提及的“营养缺陷型因子”可以包括提及的营养物或酶。

在一些实例中，如果未向修饰的细胞连续地提供营养缺陷型因子，则细胞停止增殖或死亡。在一些实例中，修饰的细胞提供了安全开关，其降低与包括致癌转化的其它基于细胞的疗法相关的风险。

本文公开的方法和组合物提供了许多优点，例如：由于整合至相同的基因座而不是随机整合(如用慢病毒载体的情况下)导致的一致结果和条件；转基因的恒定表达，这是因为避免了具有天然启动子或增强子的区域或沉默的区域；整合的一致拷贝数，1个或2个拷贝，而不是泊松分布；致癌转化的机会有限。在一些实例中，与通过慢病毒载体或其它病毒载体工程化的产物相比，本公开内容的修饰的细胞的异质性较少。

在一些实施方案中，本文公开了产生100％营养缺陷型的细胞群体的反选择方法，限制了逆转至非营养缺陷型状态的可能性。当前的安全开关依靠插入转基因，并且修饰的细胞可以通过转基因的突变或其表达的表观遗传学沉默而逃脱(参见，例如，Wu等人,MolTher Methods Clin Dev.1:14053(2014),将其通过引用以其整体并入本文)。因此，从长远来看，转基因插入与营养缺陷型机制的产生的组合通常是更安全的。

在一些实施方案中，将营养缺陷型因子的施用降低至低水平可导致修饰的细胞进入静止状态而不是被杀死，允许暂时中断和重新开始用宿主中已经存在的细胞进行治疗。与必须重新编辑宿主细胞和重新引入修饰的宿主细胞相比，这将是一个优点。

在一些实施方案中，当需要时，例如如果已经检测到异常增殖或致癌转化，或者如果需要停止治疗，停止营养缺陷型因子的施用将导致修饰的细胞的死亡。

在一些实施方案中，增加营养缺陷型因子的施用增加了修饰的细胞的生长和繁殖，并导致转基因表达的增加，从而增加了治疗因子的水平。在一些实例中，营养缺陷型因子的施用提供了控制基因产物剂量的手段。

基于营养缺陷型的安全机制为与当前细胞治疗相关的患者规避了许多风险。通过在治疗过程中给患者补充确定的营养缺陷型因子并在治疗停止或一些其它基于安全的适应症时去除所述因子，细胞生长在物理上受到限制。在一些实例中，如果营养缺陷型因子不再可用于细胞，则细胞停止分裂并且不具有形成抗性的自明机制。通过操纵营养缺陷型因子的水平，控制体内细胞的生长速率。通过使用单独的营养缺陷型可以在体内独立地控制多种细胞系。位置特异性生长可以通过局部营养物释放来控制，如在释放营养物并防止细胞逃脱的生物相容性装置内施用的外源生长的胰腺B细胞。例如，本文公开的方法和组合物可以与嵌合抗原受体(CAR)-T细胞技术结合使用，以允许更明确地控制体内CAR-T细胞的活性。在一些实例中，本文公开的组合物用于抑制或减少肿瘤生长。例如，营养缺陷型因子(例如尿苷或生物素)的撤除可导致肿瘤消退。

相当多的病症是由基因产物的不足引起的，或者可以通过治疗因子(例如蛋白质、肽、抗体或RNA)的表达的增加来治疗。在一些实施方案中，本文公开了包含修饰的宿主细胞的组合物，所述修饰的宿主细胞包含编码在营养缺陷型诱导基因座处整合的感兴趣的治疗因子的转基因，其中所述修饰的宿主细胞对营养缺陷型因子是营养缺陷型的。在一些实施方案中，本文进一步公开了使用当前公开内容中的组合物以治疗有需要的个体中的病况的方法，其通过提供足以产生营养缺陷型因子的治疗性表达的量的所述因子来进行。

示例性治疗因子

以下实施方案提供了通过在营养缺陷型宿主细胞中产生治疗因子来治疗的病症。

例如，凝血病症是相当常见的遗传病症，其中由于突变，凝血级联中的因子不存在或具有降低的功能。这些包括血友病A(因子VIII缺乏症)、血友病B(因子IX缺乏症)或血友病C(因子XI缺乏症)。

α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症是由α1-抗胰蛋白酶的缺陷产生引起的常染色体隐性疾病，其导致血液和肺中的A1AT水平不足。它可能与慢性阻塞性肺病(COPD)和肝脏病症的形成有关。

I型糖尿病是其中免疫介导的胰腺β细胞的破坏导致胰岛素产生极大缺乏的病症。并发症包括缺血性心脏病(心绞痛和心肌梗塞)、中风和周围性血管疾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病和糖尿病性肾病，其可能导致需要透析的慢性肾病。

抗体是用于中和或清除引起疾病的靶蛋白以及高度选择性杀死某些类型细胞(例如癌细胞，自身免疫疾病中的某些免疫细胞，诸如人类免疫缺陷病毒(HIV)、RSV、Flu、Ebola、CMV等的病毒感染的细胞)的分泌蛋白产物。抗体治疗已经广泛应用于许多人类病况中，包括肿瘤学、风湿病学、移植和眼部疾病。在一些实例中，由本文公开的组合物编码的治疗因子是用于预防或治疗诸如癌症、感染性疾病和自身免疫疾病的病况的抗体。在某些实施方案中，通过降低肿瘤的生长速率或通过降低对象中的肿瘤大小来治疗癌症。

由FDA批准用于治疗用途的单克隆抗体包括阿达木单抗、Bezlotoxumab、阿维鲁单抗(Avelumab)、度匹鲁单抗、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、布罗达单抗(Brodalumab)、瑞替珠单抗(Reslizumab)、奥拉单抗(Olaratumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、Obiltoxaximab、阿特珠单抗(Atezolizumab)、苏金单抗(Secukinumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、依达赛珠单抗(Idarucizumab)、依洛尤单抗(Evolocumab)、地努图希单抗(Dinutuximab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、雷莫芦单抗、维多珠单抗(Vedolizumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、阿仑单抗、恩美曲妥珠单抗(Trastuzumab emtansine)、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗、阿托珠单抗(Obinutuzumab)、本妥昔单抗(Brentuximab)、瑞西巴库单抗(Raxibacumab)、贝利木单抗(Belimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、地诺单抗(Denosumab)、地诺单抗、奥法木单抗(Ofatumumab)、贝西索单抗(Besilesomab)、托珠单抗(Tocilizumab)、卡那津单抗(Canakinumab)、戈利木单抗(Golimumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、依库珠单抗(Eculizumab)、兰尼单抗(Ranibizumab)、帕尼单抗、那他珠单抗、卡妥索单抗、贝伐珠单抗、奥马珠单抗、西妥昔单抗、依法利珠单抗、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、法索单抗(Fanolesomab)、阿达木单抗、托西莫单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗(Gemtuzumab ozogamicin)、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、耐昔妥珠单抗、巴利昔单抗、利妥昔单抗、伏妥莫单抗、硫索单抗(Sulesomab)、阿西莫单抗、Imiciromab、卡罗单抗(Capromab)、Nofetumomab、阿昔单抗、沙妥莫单抗和莫罗单抗-CD3。由FDA批准用于治疗用途的双特异性抗体包括博纳吐单抗。在一些实施方案中，抗体用于预防或治疗HIV或其它感染性疾病。用于治疗HIV的抗体包括人类单克隆抗体(mAb)VRC-HIVMAB060-00-AB(VRC01)；mAb VRC-HIVMAB080-00-AB(VRC01LS)；mAb VRC-HIVMAB075-00-AB(VRC07-523LS)；mAbF105；mAb C2F5；mAb C2G12；mAb C4E10；抗体UB-421(靶向T淋巴细胞和单核细胞的CD4分子(结构域1)上的HIV-1受体)；Ccr5mab004(针对Ccr5的人类单克隆IgG4抗体)；mAbPGDM1400；mAb PGT121(靶向HIV包膜蛋白的V1V2(PGDM1400)和V3聚糖依赖性(PGT121)表位区域的重组人类IgG1单克隆抗体)；KD-247(人类源化单克隆抗体)；PRO 140(单克隆CCR5抗体)；mAb 3BNC117；和PG9(抗HIV-1gp120单克隆抗体)。

治疗性RNA包括反义、siRNA，适配子、微小RNA模拟物/抗miR和合成mRNA，并且其中一些可以通过转基因表达。

LSD是遗传性代谢疾病，其特征在于由于酶缺乏而在人类体细胞中异常积聚各种有毒物质。这些病症总共有几乎50种，并且它们影响身体的不同部位，包括骨骼、脑、皮肤、心脏和中枢神经系统。常见的实例包括神经鞘脂贮积病、Farber病(ASAH1缺乏症)、克拉伯病(半乳糖神经酰胺酶或GALC缺乏症)、半乳糖唾液酸贮积症、神经节苷脂沉积症、α-半乳糖苷酶、法布里病(α-半乳糖苷酶缺乏症-GLA或agalsidaseα/β)、Schindler病(α-NAGA缺乏症)、GM1神经节苷脂沉积症、GM2神经节苷脂沉积症(β-己糖胺酶缺乏症)、山德霍夫氏病(己糖胺酶-B缺乏症)、Tay-Sachs病(己糖胺酶-A缺乏症)、高雪氏病1/2/3型(葡糖脑苷脂酶缺乏症-基因名称：GBA)、Wolman病(LAL缺乏症)、尼曼匹克病A/B型(鞘磷脂磷酸二酯酶1缺乏症--SMPD1或酸性鞘磷脂酶)、脑硫脂沉积病、异染性脑白质营养不良、Hurler综合征(α-L艾杜糖醛酸酶缺乏症--IDUA)、Hunter综合征或MPS2(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏症-艾度硫酸酯酶或IDS)、Sanfilippo综合征、Morquio、Maroteaux-Lamy综合征、Sly综合征(β-葡萄糖醛酸酶缺乏症)、粘多糖症、I-细胞疾病、脂沉积症、＝神经元蜡样质脂褐质沉积症、巴顿病(三肽基肽酶-1缺乏症)、Pompe(阿葡糖苷酶α缺乏症)、磷酸酶过少症(asfotaseα缺乏症)、MPS1(拉罗尼酶缺乏症)、MPS3A(肝素N-硫酸酯酶缺乏症)、MPS3B(α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶缺乏症)、MPS3C(肝素-a-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶缺乏症)、MPS3D(N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶缺乏症)、MPS4(elosulfaseα缺乏症)、MPS6(glasulfate缺乏症)、MPS7(B-葡糖苷酸酶缺乏症)、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶缺乏症)和MLD(芳基硫酸酯酶A缺乏症)。总体上，LSD在7000例出生的人群中具有约1例的发病率，并且具有严重的效果，包括早期死亡。虽然对这些疾病中的一些的可能治疗正在进行临床试验，但目前尚无许多LSD的批准治疗。一些但不是所有LSD的当前治疗选择包括酶替代疗法(ERT)。ERT是一种替代体内缺乏或缺失的酶的医学治疗。在一些实例中，这是通过给患者静脉内(IV)输注含有所述酶的溶液来完成的。

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体中的LSD的方法，所述方法包括使用本文公开的组合物向个体提供酶替代疗法。在一些实例中，所述方法包括离体的修饰的宿主细胞，其包括编码在营养缺陷型诱导基因座处整合的酶的转基因，其中所述修饰的宿主细胞对营养缺陷型因子是营养缺陷型的，并且能够表达在个体中缺乏的酶，从而治疗个体中的LSD。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在表1的基因内或在表1中控制基因表达的区域内。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码尿苷单磷酸合成酶(UMPS)的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是尿苷。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码全羧化酶合成酶(HLCS)的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是生物素。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码天冬酰胺合成酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是天冬酰胺。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码天冬氨酸转氨酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是天冬氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码丙氨酸转氨酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是丙氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在胱硫醚β合成酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是半胱氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码胱硫醚γ-裂解酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是半胱氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码谷氨酰胺合成酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是谷氨酰胺。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码丝氨酸羟甲基转移酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是丝氨酸或甘氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码甘氨酸合成酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是甘氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是丝氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是丝氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码苯丙氨酸羟化酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是酪氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码精氨基琥珀酸合成酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是精氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码精氨基琥珀酸裂解酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是精氨酸。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码二氢叶酸还原酶的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是叶酸或四氢叶酸。

在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体中的疾病或病症的方法，所述方法包括使用本文公开的组合物向个体提供蛋白质替代疗法。在一些实例中，所述方法包括离体的修饰的宿主细胞，其包括编码在营养缺陷型诱导基因座处整合的蛋白质的转基因，其中所述修饰的宿主细胞对营养缺陷型因子是营养缺陷型的，并且能够表达在个体中缺乏的蛋白质，从而治疗个体中的疾病或病症。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在表1的基因内或在表1中控制基因表达的区域内。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码尿苷单磷酸合成酶(UMPS)的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是尿苷。在一些实例中，所述营养缺陷型诱导基因座在编码全羧化酶合成酶(HLCS)的基因内。在一些实例中，所述营养缺陷型因子是生物素。在一些实例中，所述疾病是弗里德希氏共济失调，并且蛋白质是共济蛋白。在一些实例中，所述疾病是遗传性血管性水肿，并且蛋白质是C1酯酶抑制剂(例如，

III.用于制备修饰的细胞的组合物和方法

A.细胞

在一些实施方案中，本文公开了包含修饰的宿主细胞，优选人类细胞的组合物，所述修饰的宿主细胞经基因工程化为营养缺陷型的(通过在营养缺陷型诱导基因座处插入编码治疗因子的转基因)并且能够表达所述治疗因子。预期了离体、体外或体内修饰的动物细胞，哺乳动物细胞，优选人类细胞。还包括其它灵长类的细胞；哺乳动物的细胞，所述哺乳动物包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠、大鼠；禽类，包括商业上相关的禽类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。

在一些实施方案中，细胞是胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(iPS)细胞、成体干细胞、分化细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、NK细胞、B细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。例如，可以将细胞工程化以表达CAR，从而产生CAR-T细胞。在一些实施方案中，细胞系是基因工程化为营养缺陷型的T细胞。工程化的营养缺陷型T细胞可以与营养缺陷型因子一起施用至患有癌症的患者。在癌症破坏后，可以去除营养缺陷型营养物，这导致工程化的营养缺陷型T细胞的消除。在一些实施方案中，细胞系是基因工程化为营养缺陷型的多能干细胞。工程化的营养缺陷型多能干细胞可以与营养缺陷型因子一起施用至患者。在工程化的营养缺陷型多能干细胞转化为癌细胞时，可以去除营养缺陷型因子，这导致癌细胞和工程化的营养缺陷型多能干细胞的消除。

为了防止当施用至对象时修饰的细胞的免疫排斥，待修饰的细胞优选来源于对象自身的细胞。因此，优选地，哺乳动物细胞来自待用修饰的细胞治疗的对象。在一些实例中，将哺乳动物修饰为自体细胞。在一些实例中，将哺乳动物细胞进一步修饰为同种异体细胞。在一些实例中，可以将修饰的T细胞进一步修饰为同种异体的，例如通过灭活T细胞受体基因座。在一些实例中，可以将修饰的细胞进一步修饰为同种异体的，例如，通过缺失B2M以去除细胞表面上的MHC I类，或通过缺失B2M，然后将HLA-G-B2M融合物加回到表面以防止在其表面上不具有MHC I类的细胞的NK细胞排斥。

细胞系可以包括使用U.S.8,945,862中显示的以下技术维持和分化的干细胞，将U.S.8,945,862通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，干细胞不是人类胚胎干细胞。此外，细胞系可以包括通过WO 2003/046141或Chung等人(Cell Stem Cell,2008年2月,第2卷,113-117页)公开的技术制备的干细胞；将其各自通过引用以其整体并入本文。

例如，细胞可以是分离自对象的干细胞，其用于上皮、软骨、骨骼、平滑肌、横纹肌、神经上皮、分层的鳞状上皮和神经节中任一种的再生医学治疗。由一种或一些细胞类型的死亡或功能障碍导致的疾病，如帕金森病和青少年发病型糖尿病，也通常使用干细胞进行治疗(参见，Thomson等人,Science,282:1145-1147,1998,将其通过引用以其整体并入本文)。

在一些实施方案中，根据本文公开的方法从对象收获细胞并对其进行修饰，其可以包括选择某些细胞类型，任选地扩增细胞和任选地培养细胞，并且其可以另外包括选择含有整合到所述营养缺陷型诱导基因座中的转基因的细胞。

B.用于插入转基因的供体模板或载体

在一些实施方案中，本文公开的组合物包含用于将转基因插入营养缺陷型诱导基因座的供体模板或载体。

在一些实施方案中，供体模板包含(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。例如，在核酸酶系统用于切割DNA后，供体模板的引入可以在DNA断裂的修复期间利用同源定向修复机制插入转基因序列。在一些实例中，供体模板包含与断裂区域中的核苷酸序列同源的区域，使得供体模板与邻近断裂的区域杂交，并用作修复断裂的模板。

在一些实施方案中，转基因的两侧连接与营养缺陷型诱导基因座的片段或其互补物同源的核苷酸序列。

在一些实例中，供体模板是单链的、单链的、质粒或DNA片段。

在一些实例中，质粒包含复制必需的元件，包括启动子和任选地3’UTR。

本文还公开了载体，其包含：(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和(b)编码治疗因子的转基因。

载体可以是病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒(有整合能力的慢病毒载体和整合缺陷型慢病毒载体)、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体。病毒载体还可以包含病毒载体复制必需的基因。

在一些实施方案中，靶向构建体包含：(1)病毒载体骨架，例如AAV骨架，以产生病毒；(2)在每侧与至少200bp但理想地400bp的靶位点同源的臂，以确保对该位点的高水平的可再现性靶向(参见，Porteus,Annual Review of Pharmacology and Toxicology,第56卷:163-190(2016)；将其通过引用以其整体并入本文)；(3)编码治疗因子并且能够表达所述治疗因子的转基因；(4)可操作地连接至转基因的表达控制序列；和任选地(5)另外的标志物基因，以允许富集和/或监测修饰的宿主细胞。

合适的标志物基因是本领域已知的，并且包括Myc、HA、FLAG、GFP、截短的NGFR、截短的EGFR、截短的CD20、截短的CD19以及抗生素抗性基因。

可以使用本领域中已知的任何AAV。在一些实施方案中，主要的AAV血清型是AAV6。

在任何前述实施方案中，供体模板或载体包含与营养缺陷型诱导基因座(任选地以下表1中的任何基因)的片段同源的核苷酸序列，其中核苷酸序列与营养缺陷型诱导基因座的至少200、250、300、350或400个连续核苷酸至少85、88、90、92、95、98或99％相同；多达400个核苷酸通常足以确保精确的重组。设想了前述参数的任何组合，例如与至少200个连续的核苷酸至少85％相同、或与至少200个连续的核苷酸至少88％相同、或与至少200个连续的核苷酸至少90％相同、或与至少200个连续的核苷酸至少92％相同、或与至少200个连续的核苷酸至少95％相同、或与至少200个连续的核苷酸至少98％相同、或与至少200个连续的核苷酸至少99％相同、或与至少250个连续核苷酸至少85％相同、或与至少250个连续核苷酸至少88％相同、或与至少250个连续核苷酸至少90％相同、或与至少250个连续核苷酸至少92％相同、或与至少250个连续核苷酸至少95％相同、或与至少250个连续核苷酸至少98％相同、或与至少250个连续核苷酸至少99％相同、或与至少300个连续核苷酸至少85％相同、或与至少300个连续核苷酸至少88％相同、或与至少300个连续核苷酸至少90％相同、或与至少300个连续核苷酸至少92％相同、或与至少300个连续核苷酸至少95％相同、或与至少300个连续核苷酸至少98％相同、或与至少300个连续核苷酸至少99％相同、或与至少350个连续核苷酸至少85％相同、或与至少350个连续核苷酸至少88％相同、或与至少350个连续核苷酸至少90％相同、或与至少350个连续核苷酸至少92％相同、或与至少350个连续核苷酸至少95％相同、或与至少350个连续核苷酸至少98％相同、或与至少350个连续核苷酸至少99％相同、或与至少400个连续核苷酸至少85％相同、或与至少400个连续核苷酸至少88％相同、或与至少400个连续核苷酸至少90％相同、或与至少400个连续核苷酸至少92％相同、或与至少400个连续核苷酸至少95％相同、或与至少400个连续核苷酸至少98％相同、或与至少400个连续核苷酸至少99％相同。

本文公开内容还涵盖了用于使转基因靶向整合至营养缺陷型诱导基因座的系统，其包含所述供体模板或载体、cas9蛋白和向导RNA。

本文公开内容还涵盖了用于使转基因靶向整合至营养缺陷型诱导基因座的系统，其包含所述供体模板或载体和对所述营养缺陷型诱导基因座具有特异性的兆核酸酶。兆核酸酶可以是，例如，ZFN或TALEN。

插入的构建体还可以包括其它安全开关，如在由于急性毒性可能需要快速去除细胞的情况下进入基因座的标准自杀基因(例如iCasp9)。本公开内容提供了稳健的安全开关，使得可以通过去除营养缺陷型因子来消除移植到体内的任何工程化细胞。如果工程化细胞已经转化成癌细胞，这是特别重要的。

在一些实例中，供体多核苷酸或载体还任选地包含可操作地连接至所述转基因的表达控制序列。在一些实施方案中，所述表达控制序列是启动子或增强子,诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子或表达控制序列、转录后调控序列或微小RNA。

C.核酸酶系统

在一些实施方案中，本文公开的组合物包含靶向营养缺陷型诱导基因座的核酸酶系统。例如，本公开内容涉及(a)靶向并切割所述营养缺陷型诱导基因座处的DNA的兆核酸酶，或(b)编码所述兆核酸酶的多核苷酸，包括用于表达所述兆核酸酶的载体系统。作为一个实例，兆核酸酶是作为融合蛋白的TALEN，其包含(i)与营养缺陷型诱导基因座结合的转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域，其中TALE DNA结合蛋白包含多个TALE重复单元，每个TALE重复单元包含与营养缺陷型诱导基因座中的靶序列中的核苷酸结合的氨基酸序列，和(ii)DNA切割结构域。

本文还公开了靶向并切割所述营养缺陷型诱导基因座处的DNA的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统，其包含(a)Cas(例如Cas9)或Cpf1多肽或编码所述多肽的核酸，和(b)与所述营养缺陷型诱导基因座特异性杂交的向导RNA或编码所述向导RNA的核酸。实际上，Cas9系统由cas9多肽、crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)组成。如本文所用，“cas9多肽”是指天然存在的cas9多肽或修饰的cas9多肽，其保留了切割至少一条DNA链的能力。修饰的cas9多肽可以与天然存在的Cas9多肽例如至少75％、80％、85％、90％或95％相同。可以使用来自不同细菌物种的Cas9多肽；酿脓链球菌(S.pyogenes)通常是商业销售的。cas9多肽通常产生双链断裂，但可以通过将失活突变引入HNH或RuvC结构域而转化成仅切割DNA单链(即产生“单链断裂”)的切口酶。类似地，可以修饰天然存在的tracrRNA和crRNA，只要它们继续杂交并保留靶向期望DNA的能力和结合cas9的能力。向导RNA可以是嵌合RNA，其中两个RNA例如用人工环融合在一起，或向导RNA可以包含两个杂交的RNA。兆核酸酶或CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统可以在营养缺陷型诱导基因座内产生双链断裂或者一个或多个单链断裂，例如，以产生包括突出端的切割末端。

在一些实例中，本文所述的核酸酶系统还包含本文所述的供体模板。

用于编辑核酸的各种方法是本领域已知的，例如引起基因敲除或基因表达下调。例如，本领域已知各种核酸酶系统，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、兆核酸酶或它们的组合用于编辑核酸，并且其可以用于本公开内容中。兆核酸酶是天然存在的限制酶的修饰形式，其通常具有延伸的或融合的DNA识别序列。

CRISPR/Cas系统详细说明于例如WO 2013/176772、WO 2014/093635和WO 2014/089290中；将其各自通过引用以其整体并入本文。其在T细胞中的用途提出在WO 2014/191518中，将其通过引用以其整体并入本文。在EP 3004349中讨论了T细胞的CRISPR工程化，将其通过引用以其整体并入本文。

用于产生突变(敲除、敲入或基因替换)细胞系的时间限制因素是在CRISPR/Cas9平台开发之前的克隆筛选和选择。本文所用的术语“CRISPR/Cas9核酸酶系统”是指包括具有Cas9结合位点的向导RNA(gRNA)和对待修饰区域具有特异性的靶向序列的基因工程工具。Cas9结合gRNA以形成结合并切割靶区域的核糖核蛋白。CRISPR/Cas9允许多种基因编辑的轻松多路复用。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

除了CRISPR/Cas 9平台(其是II型CRISPR/Cas系统)外，还存在替代系统，包括I型CRISPR/Cas系统、III型CRISPR/Cas系统和V型CRISPR/Cas系统。已经公开了多种CRISPR/Cas9系统，包括化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)Cas9(StCas9)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)Cas9(CjCas9)和灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)Cas9(NcCas9)等。Cas系统的替代物包括新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)Cpf1(FnCpf1)、氨基酸球菌(Acidaminococcussp.)Cpf1(AsCpf1)和毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1(LbCpf1)系统。上述CRISPR系统中的任一种都可以用于产生本文公开的细胞系的方法中。例如，使用的CRISPR系统可以是CRISPR/Cas9系统，如酿脓链球菌CRISPR/Cas9系统。

IV.产生修饰的宿主细胞的方法

在一些实施方案中，所述营养缺陷型诱导基因座在选自表1中公开的那些靶基因内或在控制该基因表达的区域内。在一些实施方案中，靶基因选自UMPS(产生尿嘧啶营养缺陷型的细胞系)和全羧化酶合成酶(产生生物素营养缺陷型的细胞系)。在一些实施方案中，营养缺陷型因子选自生物素、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、尿嘧啶和胆固醇。

本文还公开了使用所述核酸酶系统产生本文所述的修饰的宿主细胞的方法，其包括向所述细胞中引入(a)靶向并切割营养缺陷型诱导基因座处的DNA的一种或多种核酸酶系统的组分，例如兆核酸酶如ZFN或TALEN，或CRISPR/Cas核酸酶如CRISPR/Cas9，和(b)如本文所述的供体模板或载体。可以将每种组分直接引入细胞中，或者可以通过引入编码所述一种或多种核酸酶系统的组分的核酸而在细胞中表达每种组分。所述方法还可以包括引入第二核酸酶系统，例如靶向并切割第二基因座处的DNA的第二兆核酸酶或第二CRISPR/Cas核酸酶，或靶向第二基因座处的DNA的第二向导RNA，或编码前述任一种的核酸，和(b)第二供体模板或载体。第二供体模板或载体可以含有不同的转基因，或相同转基因的第二拷贝，然后根据这种方法在第二基因座处整合。

此类方法将使编码治疗因子的转基因靶向整合至离体宿主细胞中的营养缺陷型诱导基因座。

此类方法还可以包括(a)任选地在扩增所述细胞后，或任选地在扩增所述细胞前，将供体模板或载体引入细胞，和(b)任选地培养细胞。

在一些实施方案中，本文的公开内容涉及产生修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括向哺乳动物细胞中引入：(a)Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的核酸，(b)对营养缺陷型诱导基因座具有特异性的向导RNA或编码所述向导RNA的核酸，和(c)本文所述的供体模板或载体。所述方法还可以包括引入(a)对第二营养缺陷型诱导基因座具有特异性的第二向导RNA和(b)第二供体模板或载体。在此类方法中，向导RNA可以是嵌合RNA或两个杂交的RNA。

在这些方法中的任一种中，核酸酶可以在营养缺陷型诱导基因座内产生一个或多个单链断裂，或在营养缺陷型诱导基因座内产生双链断裂。在这些方法中，通过与所述供体模板或载体同源重组来修饰营养缺陷型诱导基因座，从而将转基因插入基因座中。

所述方法还可以包括(c)选择含有整合到营养缺陷型诱导基因座中的转基因的细胞。选择步骤可以包括(i)选择需要营养缺陷型因子存活的细胞，以及任选地(ii)选择包含整合至营养缺陷型诱导基因座中的转基因的细胞。

在一些实施方案中，营养缺陷型诱导基因座是编码尿苷单磷酸合成酶的基因，并且通过使细胞与5-FOA接触来对其进行选择。需要UMPS基因将5-FOA代谢成5-FUMP，由于将其掺入RNA/DNA而导致其对细胞有毒。因此，在UMPS基因中具有破坏的细胞将在5-FOA处理后存活。虽然不是所有细胞都可以含有转基因，但所得细胞都是营养缺陷型的。随后对转基因的阳性选择将仅分离出是营养缺陷型的且也能够表达转基因的修饰的宿主细胞。

在一些实施方案中，本文的公开内容提供了产生修饰的人类宿主细胞的方法，其包括以下步骤：(a)获得细胞池，(b)使用核酸酶将转基因引入营养缺陷型诱导基因座，例如通过敲除或下调基因的表达，和(c)筛选营养缺陷型，和(d)筛选转基因的存在。

筛选步骤可以通过在具有或没有表1中公开的营养缺陷型因子之一的情况下培养细胞来进行。

用于插入能够表达功能因子、抗体和细胞表面受体的转基因(包括大的转基因)的技术是本领域已知的(参见，例如Bak和Porteus,Cell Rep.2017年7月18日；20(3):750–756(EGFR的整合)；Kanojia等人,干细胞.2015年10月；33(10):2985-94(抗Her2抗体的表达)；Eyquem等人,Nature.2017年3月2日；543(7643):113-117(CAR的位点特异性整合)；O’Connell等人,2010PLoS ONE 5(8):e12009(人类IL-7的表达)；Tuszynski等人,NatMed.2005年5月；11(5):551-5(成纤维细胞中NGF的表达)；Sessa等人,Lancet.2016年7月30日；388(10043):476-87(在离体基因治疗中表达芳基硫酸酯酶A以治疗MLD)；Rocca等人,Science Translational Medicine,2017年10月25日:第9卷,第413期,eaaj2347(共济蛋白的表达)；Bak和Porteus,Cell Reports,第20卷,第3期,2017年7月18日,750-756页(大的转基因盒至单基因座的整合),Dever等人,Nature,2016年11月17日:539,384-389(将tNGFR添加到造血干细胞(HSC)和HSPC中以选择和富集修饰的细胞)；将其各自通过引用以其整体并入本文。

A.营养缺陷型诱导基因座和营养缺陷型因子

在一些实施方案中，单基因的破坏引起期望的营养缺陷型。在替代的实施方案中，多基因的破坏产生期望的营养缺陷型。

在一些实施方案中，营养缺陷型诱导基因座是编码产生营养缺陷型因子的蛋白质的基因，所述蛋白质包括在产生营养缺陷型因子的途径上游的蛋白质。

在本文所述的一些实施方案中，营养缺陷型诱导基因座是编码尿苷单磷酸合成酶(UMPS)(相应的营养缺陷型因子是尿嘧啶)或编码全羧化酶合成酶的基因(相应的营养缺陷型因子是生物素)的基因。在一些实施方案中，营养缺陷型诱导基因座选自表1中的以下基因。表1的基因通过选择具有被注释为“营养缺陷型”的表型的酿酒酵母(S.cerevisiae)基因来核对，所述表型用来自酵母基因组数据库(SGD)中酵母表型本体数据库中的“化学”数据下载到的(参见，Cherry等人2012,Nucleic Acids Res.40:D700-D705,将其通过引用以其整体并入本文)。使用

表1.营养缺陷型诱导基因座

CCBL1也可以被称为KYAT1。CCBL2也可以被称为KYAT3。DHFRL1也可以被称为DHFR2。PYCRL也可以被称为PYCR3。HRSP12也可以被称为RIDA。

营养缺陷型因子可以是一种或两种或更多种营养素、酶、改变的pH、改变的温度、非有机分子、非必需氨基酸、或改变的部分浓度(与正常生理浓度相比)、或它们的组合。本文中对营养缺陷型因子的所有提及涵盖多种因子的施用。任何因子都是合适的，只要它对对象无毒且在未处理的对象中不是生物可利用的或者以足够的浓度存在以维持修饰的宿主细胞的生长和繁殖。

例如，营养缺陷型因子可以是营养物，其是增殖所必需的物质或在修饰的宿主细胞的代谢中作为辅因子发挥功能。表1中公开了多种营养缺陷型因子。在某些实施方案中，营养缺陷型因子选自生物素、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、尿嘧啶、缬氨酸和胆固醇。生物素，也称为维生素B7，是细胞生长所必需的。在一些实例中，需要缬氨酸用于造血干细胞的增殖和维持。在一些实例中，本文公开的组合物用于在HSC中表达酶，其减轻了对缬氨酸补充的需要，并由此当从饮食中去除缬氨酸时赋予那些细胞与未修饰的细胞相比的选择优势。

B.转基因

由修饰的宿主细胞的基因组编码的治疗实体可以产生治疗效果，如分子运输、诱导细胞死亡、募集另外的细胞、或细胞生长。在一些实施方案中，治疗效果是治疗蛋白的表达。在一些实施方案中，治疗效果是诱导的细胞死亡，包括肿瘤细胞的细胞死亡。

C.转基因表达的控制

在一些实例中，转基因任选地与一个或多个表达控制序列连接，所述表达控制序列包括基因的内源性启动子、或异源组成型或诱导型启动子、增强子、组织特异性启动子、或转录后调控序列。例如，可以使用组织特异性启动子(转录靶向)驱动转基因表达，或者可以包括RNA中的调控序列(微小RNA(miRNA)靶位点)以避免在某些组织中表达(转录后靶向)。在一些实例中，表达控制序列按照与正常个体中相同的表达模式(生理表达)发挥功能以表达治疗性转基因(参见Toscano等人,Gene Therapy(2011)18,117–127(2011)，由于其提及启动子和调控序列通过引用以其整体并入本文)。

组成型哺乳动物启动子包括但不限于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPTR)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、α-肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。在真核细胞中组成型发挥功能的示例性病毒启动子包括，例如，来自猿猴病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒的长末端重复(LTR)和其它逆转录病毒的启动子以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。常用的启动子包括CMV(巨细胞病毒)启动子/增强子、EF1a(延伸因子1a)、SV40(猿猴病毒40)、鸡β-肌动蛋白和CAG(CMV、鸡β-肌动蛋白、兔β-珠蛋白)、泛素C和PGK，其全部在大多数细胞类型中提供组成型活性的、高水平的基因表达。其它组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。

诱导型启动子在诱导剂存在下被活化。例如，在某些金属离子存在下，金属硫蛋白启动子被活化以增加转录和翻译。其它诱导型启动子包括酒精调控的启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子、营养调控的启动子和温度调控的启动子。

对于肝脏特异性靶向：已经将天然的和嵌合的启动子和增强子掺入病毒载体和非病毒载体中，以将因子VIIa、因子VIII或因子IX的表达靶向肝细胞。来自肝特异性基因如白蛋白和人类α1抗胰蛋白酶(hAAT)的启动子区域是天然启动子的优良实例。可选地，已经开发了嵌合启动子以提高特异性和/或载体效率。优良实例是(ApoE)4/hAAT嵌合启动子/增强子，其具有四个拷贝的肝脏特异性ApoE/hAAT增强子/启动子组合和DC172嵌合启动子，由一个拷贝的hAAT启动子和两个拷贝的α(1)-微球蛋白增强子组成。

对于肌肉特异性靶向：天然的(肌酸激酶启动子-MCK，结蛋白)和合成的(α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7))启动子已经包括在病毒载体和非病毒载体中以实现有效和特异性的肌肉表达。

对于内皮特异性靶向，天然的(vWF、FLT-1和ICAM-2)和合成的启动子都已经用于驱动内皮特异性表达。

对于髓样细胞靶向，已经报道了合成嵌合启动子主要指导转基因在髓样细胞中的表达，所述合成嵌合启动子含有在粒细胞分化期间高度表达的髓样转录因子CAAT盒增强子-结合家族蛋白(C/EBP)和PU.1的结合位点(参见，Santilli等人,Mol Ther.2011年1月；19(1):122-32,将其通过引用以其整体并入本文)。CD68也可以用于骨髓靶向。

用于遗传疾病的基因治疗的组织特异性载体的实例显示在表2中。

表2.组织特异性载体

用于遗传疾病的基因治疗的生理学上调控的载体的实例显示在表3中。

表3.生理学上调控的载体

组织特异性和/或生理学上调控的表达也可以通过修饰转基因的mRNA稳定性和/或翻译效率(转录后靶向)来实现。可选地，将miRNA靶识别位点(miRT)掺入表达的mRNA中已经被用于募集内源性宿主细胞机制以阻断特定组织或细胞类型中的转基因表达(去靶)。miRNA是约22个核苷酸的非编码RNA，其与特定mRNA的3'UTR区(被称为miRT)完全或部分互补。miRNA与其特定miRT的结合促进翻译弱化/失活和/或降解。通过miRNA调节表达描述在Geisler和Fechner,World J Exp Med.2016年5月20日,6(2):37–54；Brown和Naldini,NatRev Genet.2009年8月,10(8):578-85；Gentner和Naldini,Tissue Antigens.2012年11月,80(5):393-403；将其各自通过引用以其整体并入本文中。已经显示工程化被特定miRNA细胞类型识别的miRT-载体是在不期望的细胞类型中敲除治疗基因表达的有效方法(参见，Toscano等人,见上文,将其通过引用以其整体并入本文)。

D.药物组合物

在一些实施方案中，本文公开了使用修饰的细胞的方法、组合物和试剂盒，包括药物组合物、治疗方法和营养缺陷型因子的施用方法以控制-增加、减少或停止-修饰的细胞的生长和繁殖以及通过转基因控制治疗因子的表达。

修饰的哺乳动物宿主细胞可以与营养缺陷型因子分开地或与营养缺陷型因子组合地施用至对象。虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合施用至人类的药物组合物，但本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合施用至任何动物。

涉及药物组合物所施用的对象，包括但不限于人类和/或其他灵长类；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠、大鼠；禽类，包括商业上相关的禽类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。在一些实施方案中，将组合物施用至人类、人类患者或对象。

在一些实例中，本文所述的药物组合物用于治疗对象的疾病、病症或病况的方法中，所述方法包括：(i)产生对于营养物、酶、改变的pH、改变的温度、改变的部分浓度和/或小生境环境是营养缺陷型的细胞系，使得营养物、酶、改变的pH、改变的温度和小生境环境在对象中不存在；(ii)使对象与步骤(i)中所得的营养缺陷型细胞系接触；(iii)使(ii)中的对象与选自营养物、酶、改变pH和/或温度的部分、以及对象中的细胞小生境环境的营养缺陷型因子接触，使得营养缺陷型因子激活营养缺陷型系统或元件，导致细胞系的生长和/或对象的一种或多种治疗实体的表达。

本文公开内容的药物组合物还可以用于治疗对象的疾病、病症或病况的方法中，所述方法包括(a)向对象施用根据本文公开内容的修饰的宿主细胞，和(b)以足以促进修饰的宿主细胞生长的量向对象施用营养缺陷型因子。

包含营养的营养缺陷型因子的组合物还可以用于施用至包含本文公开内容的修饰的宿主细胞的人类。

V.制剂

A.细胞工程化制剂

将修饰的宿主细胞基因工程化以将编码治疗因子的转基因插入到营养缺陷型诱导基因座。靶向期望基因座的Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)的递送可以通过脂质体介导的转染、电穿孔或核定位来进行。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞在电穿孔后与含有血清的培养基接触。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞在电穿孔后与含有减少的血清或不含血清的培养基接触。

B.治疗性制剂

本文公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子可以使用一种或多种赋形剂配制以：(1)增加稳定性；(2)改变生物分布(例如，将细胞系靶向特定的组织或细胞类型)；(3)改变编码的治疗因子的释放曲线；和/或(4)改善营养缺陷型因子的摄取。

本公开内容的制剂可以包括但不限于盐水、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、肽、蛋白质、以及它们的组合。

本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。本公开内容的药物组合物可以是无菌的。

通常，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合的步骤。如本文所用，短语“活性成分”通常指(a)修饰的宿主细胞或供体模板，包括能够表达插入到营养缺陷型诱导基因座的治疗因子的转基因，或(b)相应的营养缺陷型因子，或(c)用于靶向营养缺陷型诱导基因座内的切割的核酸酶系统。

本文所述的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的制剂和药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来制备。

根据本公开内容的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。

根据本公开内容的药物组合物中的活性成分(例如修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子)、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以变化，这取决于治疗对象的特性、大小和/或状况，并且还取决于组合物的施用途径。例如，组合物可以包含0.1％-99％(w/w)的活性成分。例如，组合物可以包含0.1％-100％，例如0.5-50％、1-30％、5-80％或至少80％(w/w)的活性成分。

C.赋形剂和稀释剂

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和兽医使用。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药物级的。在一些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。

本文所用的赋形剂包括但不限于适于期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用以其整体并入本文)。常规赋形剂介质的使用可以预期在本公开内容的范围内，除非任何常规赋形剂介质可以与物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分在其他方面相互作用。

示例性的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等、和/或它们的组合。

D.非活性成分

在一些实施方案中，制剂可以包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指对制剂中包含的药物组合物的活性成分的活性没有贡献的一种或多种试剂。在一些实施方案中，可以在本公开内容的制剂中使用的全部、没有或一些非活性成分可以由美国食品和药物管理局(FDA)批准。

E.药学上可接受的盐

营养缺陷型因子可以以其药学上可接受的盐施用。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，使得通过将存在的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开内容的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒的盐。

VI.给药和施用

包含在上述药物组合物中的本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子可以通过任何递送途径，全身递送或局部递送施用，这导致治疗上有效的结果。这些包括但不限于肠内(进入肠)、gastroenteral、硬膜外(进入硬脑膜)、口服(通过口)、透皮、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、上皮(epicutaneous)(应用到皮肤)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下方)、鼻腔施用(通过鼻子)、静脉内(进入静脉)、静脉推注(intravenous bolus)、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心脏内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、实质内(进入脑组织)、腹膜内(输注或注入腹膜内)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵体内注射(进入病理腔)、腔内(进入阴茎底部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(通过完整的皮肤扩散用于全身分布)、经粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(在结膜上)或在滴耳剂中，耳(在耳朵中或通过耳朵)、颊(指向脸颊)、结膜、皮肤、牙齿(至一颗或多颗牙齿)、电渗、子宫颈内、鼻窦、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆道内(intrabiliary)、支气管内、法氏囊内(intrabursal)、软骨内(在软骨内)、尾部内(马尾内)、脑池内(在小脑延髓池(cisternamagna cerebellomedularis)内)、角膜内(在角膜内)、牙齿牙冠内(dental intracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内))、海绵体(intracorporus cavernosum)(在阴茎海绵体(corporus cavernosa)的可扩张空间内)、椎间盘内(在圆盘内)、管内(在腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬脑膜内或下方)、表皮内(至表皮)、食道内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在齿龈内)、回肠内(intraileal)(在小肠的远侧部内)、病灶内(在局部病变内或直接引入局部病变)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻窦或眶周窦(periorbital sinuses)内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平的脑脊液内)、胸内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在aurus介质内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(通过其中可溶盐中的离子迁移到人体组织中的电流)、冲洗(沐浴或冲洗开放性伤口或体腔)、喉部(直接在喉上)、鼻饲(通过鼻子并进入胃)、闭塞性敷料技术(局部途径施用，然后用闭塞该区域的敷料覆盖)、眼睛(至外眼)、口咽(直接至口腔和咽)、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(在通过口或鼻吸入以产生局部或全身作用的呼吸道内)、眼球后(在脑桥后或眼球后)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(穿过或越过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓室(transtympanic)(越过或穿过鼓膜腔)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断性、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光除去法(photopheresis)和脊椎麻醉。

A.肠胃外施用和注射施用

在一些实施方案中，可以肠胃外施用修饰的宿主细胞。

可以根据已知的技术，使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳剂，例如如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可以用于注射剂的制备。

可注射制剂可以例如通过细菌截留过滤器过滤，和/或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。

为了延长活性成分的作用，通常期望减缓来自皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。活性成分的吸收速率取决于溶解速率，其继而可以取决于晶体大小和结晶形式。可选地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收是通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中来实现的。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比例和所用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储库可注射制剂。

B.储库(depot)施用

如本文所述，在一些实施方案中，将包含本公开内容的修饰的宿主细胞的药物组合物配制在储库中用于延长释放。通常，靶向特定的器官或组织(“靶组织”)用于施用。在一些实施方案中，经由生物相容性装置的利用来影响局部释放。例如，生物相容性装置可以限制细胞系在对象中的扩散。

在本文公开内容的一些方面，包含本公开内容的修饰的宿主细胞的药物组合物在空间上保留在靶组织内或靶组织附近。提供了向哺乳动物对象的靶组织提供包含修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的药物组合物的方法，所述方法通过使靶组织(其包含一种或多种靶细胞)与包含修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的药物组合物在使得其基本上保留在靶组织的条件下接触进行，意味着至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的组合物保留在靶组织中。例如，在施用后的一段时间存在施用至对象的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的包含修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的药物组合物。

本公开内容的某些方面涉及向哺乳动物对象的靶组织提供包含本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的药物组合物的方法，所述方法通过使靶组织与包含修饰的宿主细胞的药物组合物在使得其基本上保留在此类靶组织中的条件下接触进行。包含修饰的宿主细胞的药物组合物包含足够的活性成分，使得在至少一种靶细胞中产生感兴趣的效果。在一些实施方案中，虽然也预期了具有或没有药学上可接受的赋形剂的“裸”制剂(如没有细胞渗透剂或其它试剂)，但包含修饰的宿主细胞的药物组合物通常包含一种或多种细胞渗透剂。

C.治疗方法

本公开内容另外提供了将上述修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子中的任一种(包含作为药物组合物或制剂的一部分)递送至对象，包括哺乳动物对象的方法。

D.剂量和方案

本公开内容提供了向有需要的对象施用根据本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的方法。可以使用有效预防、治疗、管理或诊断疾病、病症和/或病况的任何量和任何施用途径将包含修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的药物组合物以及本公开内容的组合物施用至对象。所需的确切量将因对象而异，这取决于对象的种类、年龄和一般状况，疾病的严重程度，特定组成，其施用方式，其活性模式等。对象可以是人、哺乳动物或动物。针对任何特定个体的特定治疗有效的、预防有效或适当的诊断剂量水平将取决于多种因素，包括正治疗的病症和病症的严重程度；所使用的特定有效载荷的活性；使用的具体组成；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；营养缺陷型因子的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。

在某些实施方案中，可以以足以递送约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约1mg/kg至约25mg/kg的对象体重/天的剂量水平，一天一次或多次施用根据本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子药物组合物，以获得期望的治疗、诊断或预防效果。

在某些实施方案中，可以施用在约10至约600μl/位点、50至约500μl/位点、100至约400μl/位点、120至约300μl/位点、140至约200μl/位点、约160μl/位点的根据本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子药物组合物。作为非限制性实例，可以施用在50μl/位点和/或150μl/位点的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子。

本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的期望剂量可以仅递送一次，可以以每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每隔两天、每周、每两周、每三周、或每四周递送。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)递送期望剂量。

本公开内容的修饰的宿主细胞的期望剂量可以施用一次或多次。在一段时间内以设定频率定期地施用，或作为“连续流”连续地施用营养缺陷型因子。可以通过这些方法中的任一种或以这些方法的组合来施用总日剂量(24小时内给定或规定的量)。

在一些实施方案中，本公开内容的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子向对象的递送提供了至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年的治疗效果。

修饰的宿主细胞可以与一种或多种其它治疗、预防、研究或诊断的药剂或者医学程序的组合依序或同时使用。通常，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。在一些实施方案中，本公开内容涵盖药物、预防、研究或诊断的组合物与可以改善它们的生物利用度、降低和/或改变它们的代谢、抑制它们的排泄和/或改变它们在体内分布的药剂的组合的递送。

例如，修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子作为生物相容性装置施用，所述生物相容性装置限制对象中的扩散以增加靶向治疗的区域中的生物利用度。修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子也可以通过局部递送施用。

本文中的公开内容预期了在对象中表达治疗因子的方法，其包括(a)施用所述修饰的细胞，(b)任选地施用调理方案以允许修饰的细胞植入，和(c)施用所述营养缺陷型因子。

术语“调理方案(conditioning regime)”是指患者在干细胞移植之前经历的治疗过程。例如，在造血干细胞移植之前，患者可能会经历清髓性治疗、非清髓性治疗或降低的强度调节，以防止干细胞移植的排斥，即使该干细胞起源于同一患者亦如此。调理方案可涉及细胞毒性剂的施用。调理方案还可以包括免疫抑制、抗体和辐射。其它可能的调理方案包括抗体介导的调节(参见，例如,Czechowicz等人,318(5854)Science 1296-9(2007)；Palchaudari等人,34(7)Nature Biotechnology 738-745(2016)；Chhabra等人,10:8(351)Science Translational Medicine 351ra105(2016))和CAR-T介导的调节(参见，例如，Arai等人,26(5)Molecular Therapy 1181-1197(2018)；将其各自通过引用以其整体并入本文)。需要使用调理以在脑中为来源于工程化HSC的小神经胶质创造空间以迁移到脑中来递送感兴趣的蛋白质(针对ALD和MLD的最近基因治疗试验)。调理方案还被设计成产生小生境(niche)“空间”，以允许移植的细胞在体内具有移植和增殖的位置。例如，在造血干细胞移植中，调理方案在骨髓中产生用于移植的造血干细胞植入到其中的小生境空间。在没有调理方案的情况下，移植的造血干细胞不能植入。在一些实施方案中，细胞系是基因工程化为营养缺陷型的T细胞。工程化的营养缺陷型T细胞可以用作CAR T细胞以充当活药物(living drug)，并与营养缺陷型因子一起施用至患者以使患者适应造血干细胞移植。在递送供体造血干细胞之前，可以去除营养缺陷型因子，这导致工程化的营养缺陷型T细胞的消除。在一些实施方案中，细胞系是基因工程化为营养缺陷型的同种异体T细胞。工程化的营养缺陷型同种异体T细胞可以与营养缺陷型因子一起施用至患者以提供治疗效果。在患者患有移植物抗宿主病(GvHD)时，可以去除营养缺陷型因子，这导致已经变成同种异体反应性的工程化的营养缺陷型同种异体T细胞的消除。

在一些实施方案中，定期持续施用所述营养缺陷型因子足以表达治疗因子的时间，并且优选地治疗因子足以发挥治疗效果的时间。在一些实施方案中，减少所述营养缺陷型因子的施用以减少治疗因子的表达。在一些实施方案中，增加所述营养缺陷型因子的施用以增加治疗因子的表达。在一些实施方案中，停止所述营养缺陷型因子的施用以产生导致修饰的细胞的生长抑制或死亡的状况。在一些实施方案中，暂时中断所述营养缺陷型因子的施用以产生导致修饰的细胞生长抑制的状况。

本文的公开内容还涉及治疗患有疾病、病症或病况的对象的方法，其包括向对象施用足以产生治疗量的治疗因子表达的量的(a)所述修饰的哺乳动物宿主细胞和(b)所述营养缺陷因子。

本公开内容还涵盖了根据本公开内容的修饰的哺乳动物宿主细胞用于治疗疾病、病症或病况的用途。

某些实施方案提供了如选自以下的疾病、病症或病况：癌症、帕金森病、移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫病况、过度增殖性病症或病况、恶性转化、肝脏病况、遗传病况，包括遗传性遗传缺陷、青少年发病型糖尿病和眼腔病况。

在某些实施方案中，所述疾病、所述病症或所述病况影响身体的至少一种系统，所述系统选自肌肉系统、骨骼系统、循环系统、神经系统、淋巴系统、呼吸内分泌系统、消化系统、排泄系统和生殖系统。影响对象中一种以上细胞类型的病况可以用一种以上修饰的宿主细胞治疗，其中每种细胞系被不同的营养缺陷型因子活化。在一些情况下，对象可以施用一种以上的营养缺陷型因子。

某些实施方案提供了再生的细胞系。在本公开内容的方面中，对象可以与一种以上修饰的宿主细胞和/或与一种或多种营养缺陷型因子接触。某些实施方案提供了营养缺陷型因子，例如营养物或酶的局部释放。替代实施方案提供了全身递送。例如，经由生物相容性装置的利用影响局部释放。在本公开内容的方面中，生物相容性装置可以限制细胞系在对象中的扩散。方法的某些实施方案提供了去除营养缺陷型因子，以耗尽修饰的宿主细胞在对象中的治疗效果或诱导修饰的宿主细胞中的细胞死亡。方法的某些实施方案提供了如包括选自以下中的至少一种的治疗效果：分子运输、诱导细胞死亡、细胞死亡和募集另外的细胞。方法的某些实施方案提供了在用修饰的宿主细胞治疗对象之前，未修饰的宿主细胞来源于同一对象。

本公开内容涉及试剂盒，其包含此类组合物或此类组合物的组分，任选地具有容器或小瓶。

VII.定义

关于数值x的术语“约”意指例如x+10％。

术语“活性成分”通常是指组合物中参与发挥治疗效果的成分。如本文所用，其通常是指(a)包括如本文所述的转基因的修饰的宿主细胞或供体模板，(b)如本文所述的相应的营养缺陷型因子，或(c)营养缺陷型诱导基因座内靶向切割的核酸酶系统。

本文所用的术语“改变的浓度”是指与施用本文所述的药物组合物之前对象中的营养缺陷型因子的浓度相比，营养缺陷型因子的浓度增加。

本文所用的术语“改变的pH”是指与施用本文所述的药物组合物之前对象中的pH相比，对象中诱导的pH变化。

本文所用的术语“改变的温度”是指与施用如本文所述的药物组合物之前的对象中的温度相比，在对象中诱导的温度变化。

本文所用的术语“营养缺陷型(auxotrophy)”或“营养缺陷型的(auxotrophic)”是指需要外源性施用营养缺陷型因子以维持细胞生长和繁殖的细胞状况。

本文所用的术语“营养缺陷型诱导基因座”是指细胞中染色体的区域，其在被破坏时导致细胞是营养缺陷型的。例如，通过破坏编码参与营养缺陷型因子的合成、再循环或补救的酶的基因(直接或上游通过合成用于制备营养缺陷型因子的中间体)，或者通过破坏调控基因表达的表达控制序列，可以使细胞成为营养缺陷型的。

本文所用的术语“生物利用度”是指施用至对象的给定量的修饰的宿主细胞或营养缺陷型因子的全身可用性。

本文所用的术语“Cas9”是指CRISPR相关蛋白9，其是用于基因组编辑的内切核酸酶。

术语“包含(comprising)”意指“包括(including)”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括另外的东西，例如X+Y。

术语“调理方案”是指患者在干细胞移植之前经历的治疗过程。

本文所用的术语“连续流”是指在单一途径/单接触点中连续施用一剂治疗剂持续一段时间，即连续施用事件。

本文所用的术语“CRISPR”是指DNA的规律成簇间隔短回文重复，其配置切割侵入细胞的RNA核苷酸的酶。

本文所用的术语“CRISPR/Cas9核酸酶系统”是指基因工程工具，其包括具有Cas9结合位点的向导RNA(gRNA)序列和对靶DNA中待切割位点具有特异性的靶向序列。Cas9结合gRNA以形成结合并切割靶位点的核糖核蛋白复合物。

术语“扩增”当在细胞的上下文中使用时是指通过后代的产生来增加细胞的数目。

术语“表达控制序列”是指能够调控或控制感兴趣的核苷酸序列表达的核苷酸序列。实例包括启动子、增强子、转录因子结合位点、miRNA结合位点。

术语“同源重组”(HR)是指在DNA断裂修复期间经由同源定向修复机制插入核苷酸序列。该过程使用与断裂区域中的核苷酸序列具有同源性的“供体”分子或“供体模板”作为修复断裂的模板。插入的核苷酸序列可以是基因组中的单碱基变化或大DNA序列的插入。

术语“同源的”或“同源性”，当用于两个或更多个核苷酸序列的上下文中时，是指在生理条件下于细胞中足以将两个核苷酸序列特异性结合在一起的碱基配对或杂交的程度。同源性也可以通过计算与互补序列进行沃森-克里克碱基配对的核苷酸的百分比来描述，例如在特定数目的碱基上至少70％同一性，优选至少至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性。对于供体模板，例如，同源性可以超过200-400个碱基。对于引导序列，例如，同源性可以超过15-20个碱基。

术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子、增强子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列影响第二核酸序列的转录和/或翻译。

本文所用的术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，使得通过将存在的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。本文中所有提及的化合物或组分包含其药学上可接受的盐。

本文所用的术语“再生的”是指对象的器官或系统的更新或恢复。

术语“治疗因子”是指由插入的转基因编码的产物，其治疗和/或减轻对象的疾病、病症或病况的症状。

术语“治疗量”是指足以发挥“治疗效果”的治疗因子的量，这意味着减轻或改善疾病、病症或病况的症状。

本文所用的术语“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。

实施例

将K562细胞(获自ATCC)和Nalm6细胞(由C.Mackall友好提供方)培养在补充有10％牛生长血清、2mM L-谷氨酰胺以及100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI 1640(HyClone)中。从健康供体获得的血沉棕黄层分离后，新鲜使用T细胞。通过Ficoll密度梯度离心，然后使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进行磁性富集，分离T细胞。

将细胞在BAMBANKER

在电穿孔前，用固定的抗CD3(克隆OKT3,Tonbo Biosciences)和可溶性抗CD28(克隆CD28.2,Tonbo Biosciences)活化T细胞3天。

将140万个活化的T细胞重悬于电穿孔溶液中，与预复合的RNP混合，以及使用4D-NUCLEOFECTOR

使用QUICKEXTRACT

使用UMPS-O-1和UMPS-O-2进行UMPS基因座的Sanger测序，其中使用PHUSION

gRNA序列(包括前间区序列邻近基序，也称为PAM)：

UMPS-7

GCC CCG CAG AUC GAU GUA GAG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUAAGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U(SEQ ID NO:1)

用于UMPS基因座TIDE分析的测序寡核苷酸：

UMPS-O-1:CCCGGGGAAACCCACGGGTGC(SEQ ID NO:2)

UMPS-O-2:AGGGTCGGTCTGCCTGCTTGGCT(SEQ ID NO:3)

在初步筛选后，选择显示InDel频率最高的sgRNA“UMPS-7”用于进一步分析。

将T细胞解冻并培养，然后活化并随后用如上所述的Cas9-UMPS-7sgRNA RNP电穿孔。电穿孔后，使细胞在有或没有血清、5-FOA或外源性尿嘧啶来源的培养基中恢复(图1A)。当培养基中包含血清时，电穿孔后的细胞存活显著增加(图1B)，因此在所有随后的实验中进行了在含血清、尿苷和UMP的培养基中的4天恢复期。电穿孔后的细胞计数显示在表4。

表4.细胞计数

将T细胞如实施例2中一样进行电穿孔和编辑，并使其在具有血清、尿苷和UMP的培养基中恢复4天。在第4天，将细胞转移至UMP、尿苷或尿嘧啶来源的培养基。该实验不以选择步骤为特征，因此所得的细胞群体是野生型(WT)、杂合突变体和纯合突变细胞的异质混合物。观察到纯合UMPS突变细胞的生长依赖于外源性尿嘧啶来源-因为这些应是营养缺陷型的(图2A)。当靶向UMPS时，观察到在约50％的细胞中产生InDel(如通过TIDE分析测定的(参见，Brinkman等人,2014,Nucleic Acids Res.42(22):e168),将其通过引用以其整体并入本文)。

当去除外源性尿嘧啶来源时，群体中的InDel频率在生长3天后降低(第7天＝恢复4天和测试培养基中的3天)。这与显示任何纯合营养缺陷型UMPS突变细胞将在群体中被非营养缺陷型杂合突变体胜过以及在编辑后仍然存在的WT细胞-导致降低的表观InDel频率的模型是一致的(参见图2B)。具有InDel的等位基因的百分比显示在表5中。

表5.具有InDel的等位基因

观察到异质UMPS编辑群体的最佳生长依赖于尿嘧啶的外源性来源的存在(图2C-图2F)。具有移码InDel(frameshift InDel)的等位基因的百分比显示在图2C中，并且数值显示在表6中。

表6.具有移码InDel的等位基因

图2D比较了通过TIDE鉴定的含有等位基因的第8天的细胞的预测的绝对数。数值显示在表7中。

表7.预测的活细胞计数

图2E显示了在有/没有UMP的情况下的细胞计数的时间过程(8天)。数值显示在表8中。

表8.细胞密度[细胞/ml]

图2F显示了在有/没有尿苷的情况下的细胞计数的时间过程(8天)。数值显示在表9中。

表9.细胞密度[细胞/ml]

UMP和尿苷将UMPS编辑的培养物的生长救援到与模拟编辑的细胞相同的水平。这种生长的救援依赖于UMPS编辑，并且在用外源性尿嘧啶来源处理的模拟细胞中未见到，表明编辑的UMPS使人类T细胞特异性地依赖于尿嘧啶的补充以获得最佳的细胞生长。

值得重申的是，UMPS编辑的群体含有未预期是营养缺陷型的未编辑的或杂合的细胞，因此UMPS编辑的细胞在尿嘧啶缺陷型培养基中完全缺乏生长是不可预期的。

5-FOA在其它有机体中选择尿嘧啶营养缺陷型细胞(例如Boeke等人,1984,Mol.Gen.Genet.197(2):345-6),将其通过引用以其整体并入本文)。为了研究5-FOA在人类细胞中选择尿嘧啶营养缺陷型的潜在效用，通过Cas9-gRNA复合物电穿孔，随后回收(如实施例2中所示)，随后进行对5-FOA处理的抗性的测定，在人类T细胞中靶向UMPS基因(图3A)。在进行细胞计数之前，细胞在5-FOA和多种血清和尿嘧啶来源的组合中生长4天。

表10比较了在有或没有血清的情况下生长的细胞群体的细胞计数。

表10.细胞计数

虽然血清对于电穿孔后细胞的恢复是重要的，但对5-FOA中细胞的活力没有影响(图3B)。在没有血清的情况下在5-FOA中生长的另外样品的细胞计数显示在图3C和表11中。

表11.细胞计数

与对照相比，尿苷和UMP改善了模拟处理的和UMPS靶向的细胞在5-FOA中的存活。这可能是通过基于竞争的机制(尿苷可以逆转人类中的5-氟尿嘧啶毒性(参见，vanGroeningen等人,1992,Semin.Oncol.19(2Suppl 3):148-54,将其通过引用以其整体并入本文))(图3B和3C)。在所有情况下，与模拟靶向细胞相比，UMPS靶向细胞表现出增加的存活率。该数据表明5-FOA可以用于在人类细胞培养物中选择尿嘧啶营养缺陷型细胞。

为了测定通过5-FOA处理选择的细胞是否是尿嘧啶营养缺陷型的，将模拟或UMPS靶向的T细胞暴露于5-FOA，如实施例4所示。在5-FOA选择4天后，将细胞群体分到含有尿嘧啶的培养基(UMP、尿苷或两者)和尿嘧啶缺乏的培养基。在测试培养基中孵育4天(第8天)后，随后通过细胞计数进行生长测定(图4A)。在所有情况下，模拟靶向细胞培养物中的细胞生长是可以忽略的并且不依赖于尿嘧啶来源补充-表明在5-FOA选择步骤期间成功杀死非UMPS靶向细胞(图4B-图4D)。在UMPS靶向群体中，在所有条件下，细胞生长都是通过添加尿嘧啶刺激的，并且在其不存在时观察到不良的细胞生长(图4B-图4D)。

图4B比较了在没有血清的情况下样品培养第8天的细胞计数。数值显示在表12中。

表12.第8天的细胞计数

图4C比较了补充有UMP且没有血清的培养物中的细胞计数。数值显示在表13中。

表13.第8天的细胞计数

图4D比较了补充有尿苷且没有血清的培养物中的细胞计数。数值显示在表14中。

表14.第8天的细胞计数

总而言之，实施例1-5的结果表明，在人类T细胞中Cas9对UMPS基因座的编辑产生了依赖于外源性尿嘧啶来源以用于最佳细胞生长的细胞。这些结果表明，工程化的人类营养缺陷型可以用作控制T细胞增殖或一些其它细胞治疗的机制。此外，UMPS编辑细胞的5-FOA选择为选择真正的营养缺陷型T细胞群体提供了有用的机制。

实施例6.培养干细胞

为了评价具有潜在治疗相关性的另一种细胞类型，在人类多能细胞中工程化UMPS。作为本文公开内容的主题的修饰的宿主细胞可以包括使用如U.S.8,945,862中所示的以下技术维持和分化的干细胞，将U.S.8,945,862通过引用以其整体并入本文。

未分化的hESC(来自

为了诱导hESC分化，将未分化的hESC培养在含有Iscove's改良的Dulbecco's培养基(IMDM)和15％限定的胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,Utah)、0.1mM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、450μM单硫代甘油(Sigma,St.Louis,Mo.)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的分化培养基中，或者如先前所述的用于形成悬浮的拟胚体(EB)的超低粘附板中(参见，ProcNatl Acad Sci USA,2002.99(7):p.4391-6和Stem Cells,2007.25(2):p.392-401；将其各自通过引用以其整体并入本文)。简而言之，将用条件培养基在

通过对Cas9 RNP进行电穿孔和如基因组基因座的扩增和Sanger测序评价的，选择在外显子1中具有InDel的克隆来破坏hESC中的UMPS基因座。对于基因编辑，在电穿孔前，将hESC用10μm ROCK抑制剂(Y-27632)处理24小时。用

Sanger测序比较了编辑前的hESC群体、RNP电穿孔后的混合群体以及所选克隆的基因型。结果显示，sgRNA靶区域周围缺失了10bp。在该区域中缺少序列示踪表明两个等位基因均已经被修饰。

用不同浓度的尿苷在四天内进行营养缺陷型测定。在以相似的密度接种UMPS

表15.活细胞计数

产生了具有不同浓度的补充物对比对照的杀伤曲线，以证明敲除基因的产物的外源提供形式补救了细胞系的营养缺陷型表型。

为了评估对5-FOA的抗性，将UMPS-KO hESC基因工程化以表达来自整合至安全港基因座(safe-harbor locus)中的表达盒中的GFP，用于在与UMPS-WT细胞共培养时更容易鉴定。

选择显示出GFP的明亮和稳定表达的克隆。将这些UMPS

表16.活细胞计数

类似于先前的细胞类型，观察到随时间GFP+细胞的富集。在没有5-FOA的组中，54.8％的细胞是GFP+，在有5-FOA的组中，95.0％的细胞是GFP+。在这种细胞类型中，UMPS-WT细胞对所有测试的5-FOA浓度均是敏感的，UMPS-KO细胞很好地耐受0.25μg/ml的浓度，同时在较高浓度下显示出增殖受损，如表16中所示。

总之，这些结果确认了可以有效地工程化代谢中的关键途径以在从白血病细胞系到多能细胞系和原代免疫细胞的一系列人类细胞中产生营养缺陷型。两种UMPS等位基因的基因靶向可以用于产生和纯化具有纯合子敲除的细胞群体，或使用5-FOA富集那些细胞。还可以产生具有多个敲除和突变的细胞系以提供快速的多重基因组工程和选择(例如5种营养缺陷型突变和5种抗生素)。

也可以在体内分析体外验证的营养缺陷型敲除细胞系。这些细胞系受到人类中营养缺陷型因子的毒性和生物利用度的限制。基因敲除细胞系工程化自人类T细胞或任何其它淋巴细胞。细胞系的条件性体外生长在营养缺陷型因子存在的情况下而不是在营养缺陷型因子不存在的情况下被证实。可以在小鼠模型中施用确认了对于该因子是营养缺陷型的并且能够表达转基因的修饰的哺乳动物宿主细胞。只有食用营养缺陷型因子补充物的小鼠才能维持人类淋巴细胞的生长。此外，在从小鼠食物源中去除营养物时，体内细胞生长停止。

生物信息学工具(crispor.tefor.net)用于鉴定spCas9的UMPS基因的外显子1中可能的sgRNA靶位点。使用COSMID(crispr.bme.gatech.edu/)预测推定的脱靶(OT)作用(参见，Majzner等人,Cancer Cell.31,476–485(2017)，将其通过引用以其整体并入本文)。使用基于web的生物信息学程序COSMID(crispr.bme.gatech.edu)鉴定了人类基因组(hg38)中的潜在脱靶位点，在19个PAM近端碱基中允许多达3个错配或1个错配中有1bp缺失/插入。sgRNA按高度相似的脱靶位点数排名(COSMID得分<1)，然后按得分较高的OT位点数排名。还通过COSMID程序设计了用于扩增所有位点的引物。所有位点通过基因座特异性PCR扩增，经由第二轮PCR条形码化，以等摩尔量合并，并使用Illumina MiSeq使用250bp配对的末端读取进行测序，如先前在Porteus,M.Mol.Ther.19,439–441(2011)(将其通过引用以其整体并入本文)中所述的。使用自定义脚本indelQuantificationFromFastqPaired-1.0.1.pl(10)分析所得数据(https://github.com/piyuranjan/NucleaseIndelActivityScript/blob/master/indelQuantificationFromFastqPaired-1.0.1.pl)。

鉴定了具有最低OT位点数目的3种sgRNA，并将其用于体外活性筛选。这些sgRNA显示在表17中。

表17.具有最少OT位点的sgRNA

从Synthego公司用化学修饰获得sgRNA。将sgRNA与Cas9蛋白质(IDT)以2.5:1(sgRNA:蛋白质)的摩尔比复合，并使用4D-NUCLEOFECTOR

表18.引物

使用CRISPR编辑推理(ICE)和ICE-D在线工具(ice.synthego.com)对序列进行InDel定量(图5A)。结果显示在表19中。

表19.InDel定量

选择sgRNA“UMPS-7”用于进一步实验。该sgRNA导致产生高比例的大(大于30bp)缺失，所述缺失可通过CRISPR编辑推理-不一致性(ICE-D)检测到，但不能通过常规ICE或TIDE分析(www.deskgen.com/landing/tide.html)检测到。

为了评价如果在没有添加尿苷或尿苷单磷酸(UMP)的情况下培养，UMPS敲除是否导致不同的细胞增殖，用台盼蓝染色通过自动化细胞计数随时间跟踪培养物中的细胞计数。与模拟电穿孔或使用靶向不同基因组基因座(即CCR5)的Cas9电穿孔的细胞相比，UMPS敲除导致从电穿孔后第2天的较低的细胞计数(图5B)。细胞计数显示在表20中。

表20.InDel定量

相比之下，如果以高浓度(各250μg/ml)补充UMP或尿苷，则在UMPS敲除后细胞增殖没有受损(图5C)。每ml的活细胞数显示在表21中。

表21.每ml的活细胞数

为了确认基因组水平上的结果，在实验结束时收获基因组DNA并定量InDel(图5D-图5E)。图5D比较了未暴露于5-FOA的细胞在不同培养条件下的InDel频率。百分比显示在表22中。

表22.总的InDel频率的百分比

图5E比较了未暴露于5-FOA的细胞在不同培养条件下的移码InDel频率。百分比显示在表23中。

表23.移码InDel频率的百分比

在没有尿苷或UMP的情况下培养后，总的InDel频率略微降低，但当定量将导致移码(不是+3/-3的倍数)的InDel时，在没有代谢物添加的情况下细胞群体中的InDel降低。这证实了与UMPS野生型细胞相比或与保存阅读框的外显子1中具有InDel的细胞相比，由于外显子1中的移码InDel导致的UMPS敲除的细胞在存活和增殖方面具有劣势。

接下来，产生了基因靶向构建体，其允许将2种不同的标志物整合到UMPS基因座中，从而破坏基因表达，并能够使用Bak等人,Elife 28:6(2017)(将其通过引用以其整体并入本文)描述的方法，通过tEGFR和tNGFR的共表达(图6A)鉴定具有双等位基因敲除的细胞。使用标准分子生物学方法通过Gibson组装克隆构建体，其具有侧接有AAV2反向末端重复(ITR)的质粒主链。

为了靶向干细胞和原代人类细胞，将构建体包装在6型重组腺相关病毒(rAAV6)中以在产生双链断裂后递送DNA，从而刺激同源重组以整合转基因。通过Gibson装配(

通过转移质粒与pdgm6包装质粒的共转染在HEK293T细胞中进行AAV的产生，并通过碘克沙醇梯度离心进行纯化。利用聚乙烯亚胺，将HEK293细胞用pDGM6辅助质粒和在侧接有AAV2 ITR的同源臂之间携带转基因的相应转移质粒共转染。48小时后，将细胞解离，从上清液中分离并裂解。将悬浮液用Benzonase(Sigma Aldrich)处理并沉淀碎片。将粗制的AAV提取物在碘克沙醇密度梯度上纯化，然后在1x 10

首先在髓样白血病细胞系K562(

磁珠富集用于依序富集表达表面标志物EGFR和NGFR的细胞。对于磁性分离，在LS或MS柱(Miltenyi)上，使用针对具有PE和APC作为荧光染料(Biolegend)的NGFR和EGFR的抗体、抗藻红蛋白(PE MultiSort试剂盒(Miltenyi)和抗APC MicroBeads(Miltenyi)，通过相继的磁珠分选富集表达tNGFR和tEGFR的细胞。在FACS ARIA

为了使鉴定更容易，进行第二编辑步骤，其中将具有萤火虫荧光素酶和TurboGFP的表达盒靶向到安全港基因座(HBB)(图6C)。将K562细胞悬浮在含有6μg Cas9蛋白(IDT)和3.2μg sgRNA(Trilink)的20μl SF细胞系溶液中，并电穿孔。在K562细胞培养基(含有10％BGS并且补充有GLUTAMAX

对分选的UMPS

表24.从第1天至第8天的每ml的细胞数

用Nalm6细胞进行了相同实验，并且观察到对培养物中尿苷浓度的相似依赖性，这对于具有完整UMPS的细胞是不可见的。表25提供了用不同尿苷浓度培养的UMPS

表25.UMPS

在补充有尿苷的组，尤其是补充有25μg/ml和250μg/ml尿苷的组中观察到显著较大的生长。

为了测定UMPS敲除细胞对5-FOA的抗性，将纯化的UMPS

表26.GFP+细胞的百分比

图6G显示了在不同量的5-FOA下GFP+细胞的生长曲线。数值显示在表27中。

表27.每μl GFP+细胞数

在使用的所有浓度下，UMPS

使用Ficoll密度梯度和MACS阴性选择(Miltenyi T细胞富集试剂盒)从获自Stanford Blood Center(Palo Alto,CA)的血沉棕黄层中分离T细胞。在补充有5％人类血清(Sigma)和100IU/ml IL-2的X-VIVO15培养基中培养T细胞。

在电穿孔前，用抗CD3/-CD28珠粒(STEMCELL Technologies)(本领域中也称为Dynabeads)和IL-2(100IU/ml)活化T细胞3天。在电穿孔前通过磁性固定去除活化珠粒。在电穿孔前将K562细胞和Nalm6细胞保持在对数生长期。sgRNA获自Synthego，其中在两端的三个末端核苷酸上具有2’-O-甲基-3’-硫代磷酸酯修饰(参见，Bonifant,等人,Mol.Ther.-Oncolytics.3,16011(2016),将其通过引用以其整体并入本文)。

在从健康供体分离CD3+T细胞并活化细胞后，将两种选择标志物tEGFR和tNGFR靶向到原代人类T细胞中的UMPS基因座中。

通过高效液相色谱(HPLC)纯化获得大规模的sgRNA。高保真(HiFi)Cas9蛋白购自IDT。将sgRNA与HiFi spCas9蛋白(IDT)以2.5:1(sgRNA：蛋白)的摩尔比复合，并在16-比色皿条带中使用4D-NUCLEOFECTOR

为了将转基因靶向至基因组的特定基因座中，如所述编辑细胞，在电穿孔后直接重悬于80μl培养基中，然后与rAAV6一起孵育以在5000vg/细胞的感染复数(MOI)下转导。8-12小时后，用培养基稀释悬浮液以达到0.5-1E6细胞/ml的细胞浓度。为了靶向HBB基因座，使用先前表征的具有靶序列CTTGCCCCACAGGGCAGTAA(SEQ ID NO:7)的sgRNA(参见，Teixeira等人,Curr.Opin.Biotechnol.55,87–94(2019),将其通过引用以其整体并入本文)。将Cas9和sgRNA复合成RNP，与重悬于P3缓冲液中的T细胞混合并且使用程序EO-115在4D NUCLEOFECTOR

靶向后三天，鉴定EGFR+/NGFR+细胞群体，并通过在高尿苷浓度存在下，与抗CD3/-CD28磁珠共培养对其进行扩增。EGFR+/NGFR+细胞群体从仅接受AAV的细胞中分化，这是由于更亮的表达表明稳定整合，与来自AAV的附加体表达相反。

扩增后，使用流式细胞术分选EGFR+/NGFR+群体以获得具有双等位基因UMPS敲除的T细胞群体。结果显示在图7A中。

还对这些T细胞进行营养缺陷型测定，并测试用5-FOA选择这些细胞的可能性。当在抗CD3/-CD28珠粒和不同浓度的尿苷存在下培养细胞时，细胞仅在尿苷存在下增殖，这确认了它们的营养缺陷型细胞生长。较高的尿苷浓度导致较高的增殖速率。UMPS KO或野生型(WT)T细胞的营养缺陷型生长显示在图7B和表28中。

表28.每ml的活细胞

表29显示了第4天细胞群体的相对活力。

表29.每ml的活细胞

为了评价用5-FOA选择UMPS

表30.在混合的细胞群体中UMPS

使用未配对t检验比较各组的统计学显著差异。在用5-FOA处理的组之间没有观察到统计学显著性，而与未处理组相比，处理组中UMPS-KO T细胞的百分比显著增加。

在两个5-FOA处理组中，具有UMPS敲除的细胞的分数随时间增加，表明与野生型细胞相比它们对化合物的抗性增加，并且用5-FOA一次性处理足以导致历经几天的修饰细胞的富集。表30中的数据说明了5-FOA选择具有UMPS敲除的T细胞。

事实上，用5-FOA进行UMPS敲除和野生型T细胞的混合群体的培养物的FACS分析。用eFluor670标记UMPS-KO T细胞，并且用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记野生型细胞。结果显示，在第0天，仅在第1天(第0天)用5-FOA处理的组中，43.7％的细胞是UMPS-KO T细胞，而对于野生型细胞观察到56.0％。在第0天，在未用5-FOA处理的对照组中，47.7％的细胞是UMPS-KO T细胞，52.1％的细胞是野生型细胞。在第3天，在每天补充5-FOA的组中，74.0％的细胞是UMPS-KO T细胞，而25.8％的细胞是野生型细胞。在第3天，在未用5-FOA处理的对照组中，43.1％的细胞是UMPS-KO T细胞，56.4％的细胞是野生型细胞。

将多能干细胞基因工程化以使其依赖于外部提供的因子。将这些细胞注入作为畸胎瘤形成试验中的免疫缺陷的NSG小鼠中以评价安全系统，其通过撤除外部提供的化合物来防止畸胎瘤形成。使用的细胞系是iPSC:iLiF3、iSB7-M3(来源：斯坦福大学的Nakauchi实验室)和hES:H9。

为了测定安全开关是否能够根除源自多能细胞的畸胎瘤，将基因修饰的iPSC或ES细胞(或对照细胞)移植到小鼠中。细胞表达荧光素酶用于体内检测。将1x10

对于K562异种移植试验，将1x10

在植入模型有机体后，通过向动物提供高剂量的尿苷以在体内分析UMPS

表达萤火虫荧光素酶(FLuc)的先前工程化的UMPS

给小鼠饲喂常规的小鼠食物或已经富含8％(w/w)UTA的定制食物，先前已经显示出该量增加小鼠中的血清水平同时良好耐受(参见，Garcia等人,2005)。UTA获自AccelaChemBio Inc.，并且将其加入以占Teklad小鼠食物(Envigo)的8％(w/w)，并且在使用前辐照食物。对照食物是标准小鼠食物Teklad 2018(辐照过的)。

可选地，食物补充有尿苷单磷酸。这些细胞可以通过静脉内(iv)注射局部(后腿)或全身植入免疫受损的小鼠中。

皮下移植UMPS

还分析了UMPS

表31.畸胎瘤重量

体内结果与先前的体外结果一致，其在2.5μg/ml(＝10nmol/ml)的尿苷浓度下显示UMPS

总的来说，这些结果是代谢营养缺陷型可以被工程化以在体外和体内增加对人类细胞的细胞增殖的控制机制的证据。

在小鼠模型中测定了安全系统是否能够防止xeno-GvHD的副作用。将基因修饰的人类T细胞或对照T细胞移植到被辐射的免疫受损小鼠中，并向小鼠提供或不提供UTA。评价小鼠的体重减轻或GvHD的其它体征，并在确立疾病时(最迟16周)将其处死。然后将细胞进行生物发光成像和抽血。

将多能干细胞基因工程化以编码在UMPS基因座处整合的感兴趣的酶，以使其依赖于外部提供的尿苷。对需要用于治疗LSD的特定酶的酶替代疗法的个体施用包含这些细胞以及尿苷的组合物，以促进在个体中缺乏的酶的表达。基于酶的期望表达调整尿苷的施用剂量和施用时间。

在一些实例中，将细胞基因工程化以编码HLC基因座处感兴趣的酶，以使其依赖于外部提供的生物素。

虽然本文已经示出和描述了本公开内容的实施方案，但对于本领域的技术人员显而易见的是，此类实施方案仅通过实施例提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域的技术人员现在会想到许多变型、改变和替换。应理解，在实践本公开内容的主题时，可以采用本文所述的公开内容的实施方案的各种替代。以下权利要求书旨在限定本文公开内容的范围，并由此涵盖在这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

序列表

<110> 奥克索利提克有限公司(AUXOLYTIC LTD)

莱兰斯坦福初级大学评议会(THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORDJUNIOR UNIVERSITY)

<120> 使用营养缺陷型可调控细胞进行基因治疗的方法和组合物

<130> 2158.1001PCT

<140> PCT/US2019/XXXXXX

<141> 2019-05-10

<150> 62/669,848

<151> 2018-05-10

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列的描述：合成的引导RNA”

<400> 1

gccccgcaga ucgauguaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列的描述：合成的UMPS-O-1测序寡核苷酸”

<400> 2

cccggggaaa cccacgggtg c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列的描述：合成的UMPS-O-2测序寡核苷酸”

<400> 3

agggtcggtc tgcctgcttg gct 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

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<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

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<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

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