从磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸产生果糖-6-磷酸的方法

摘要

描述了一种从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛‑3‑磷酸(G3P)产生果糖‑6‑磷酸(F6P)的方法，所述方法包括步骤：(a)使磷酸二羟丙酮(DHAP)酶促转化成二羟丙酮(DHA)；并且(b)使如此产生的二羟丙酮(DHA)和甘油醛‑3‑磷酸(G3P)酶促转化果糖‑6‑磷酸(F6P)；或包括步骤：(a’)使甘油醛‑3‑磷酸(G3P)酶促转化成甘油醛；并且(b’)使如此产生的甘油醛连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起酶促转化成果糖‑1‑磷酸(F1P)；并且(c’)使如此产生的果糖‑1‑磷酸(F1P)酶促转化成果糖‑6‑磷酸(F6P)。

说明书

本发明涉及一种从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)产生果糖-6-磷酸(F6P)的方法，所述方法包括步骤：

(a)使磷酸二羟丙酮(DHAP)酶促转化成二羟丙酮(DHA)；以及

(b)使如此产生的二羟丙酮(DHA)连同甘油醛-3-磷酸(G3P)一起酶促转化果糖-6-磷酸(F6P)或

所述方法包括步骤：

(a’)使甘油醛-3-磷酸(G3P)酶促转化成甘油醛；以及

(b’)使如此产生的甘油醛连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起酶促转化成果糖-1-磷酸(F1P)；并且

(c’)使如此产生的果糖-1-磷酸(F1P)酶促转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

对于过去的数十年，代谢工程实践者已经致力于为生产化学品提供生物解决方案，因此，提供更传统化学方法的替代物。通常而言，生物解决方案允许利用可再生原料(例如糖)并且与基于现有石油化学的方法竞争。一种用于生产化学品的多步骤生物解决方案一般包含微生物作为使原料转化成靶分子的催化剂。用于产生特定靶分子的全套酶反应可以划分成属于中心碳途径的那些酶反应和属于产物特异性途径的那些酶反应。属于中心碳途径和产物特异性途径的反应是关联的，在于必须在有助于该方法的竞争力总体权衡下考虑每种和每一酶反应的氧化还原约束条件(一般是NAD(P)H)和能量学约束条件(一般是ATP)。历史上，已经将依赖糖生长的异养生物的中心碳途径描述为Embden-Meyerhoff-Parnas途径(EMPP)、磷酸戊糖途径(PPP)、Entner-Doudoroff途径(EDP)和磷酸转酮酶途径(PKP)(见Gottschalk(1986)，Bacterial Metabolism，第2版Springer-Verlag，New York)。每个中心途径或中心途径组合相对于特定靶分子提供优点和缺点。为了提供有竞争力的生物加工，已经描述了具有涉及EMPP、PPP和EDP的修饰的重组微生物(M.Emmerling等人，Metab.Eng.1：117(1999)；L.O.Ingram等人，Appl.Environ.Microbiol.53：2420(1987)；C.T.Trinh等人，Appl.Environ.Microbiol.74：3634(2008))。最近，已经描述了具有涉及PKP的修饰的重组微生物(见Sonderegger等人，Appl.Environ.Microbiol.70(2004)，2892-2897，美国专利7,253,001，Chinen等人，J.Biosci.Bioeng.103(2007)，262-269，美国专利7,785,858；Fleige等人，Appl.Microbiol.Cell Physiol.91(2011)，769-776)。

EMPP使1mol葡萄糖转化成2mol丙酮酸(PYR)。当需要乙酰-CoA时，1mol PYR可以转化成1mol乙酰-CoA，同时生成1mol CO

葡萄糖+2ADP+2H

PPP提供使1mol葡萄糖转化成1mol CO

对于从借助PKP和相对于AcCoA部分在氧化还原中性附近产生的AcCoA部分所衍生的特定靶分子，存在总体能量平衡的缺乏。PKP(和，类似地，PPP和EDP)不产生用于使葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的ATP。在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖性葡萄糖摄取的情况下，必须通过其他手段(例如借助EMPP)产生PEP。借助PKP再循环GAP恶化这种情况，特别在产物特异性途径提供少量ATP时。

Sonderegger(见上述引文)和美国专利7,253,001公开了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，所述菌株包含天然或过量表达的磷酸转酮酶活性，连同过量表达的磷酸转乙酰酶以增加葡萄糖/木糖混合物转化成乙醇的产率。这些菌株特征在于EMPP和PPP均可操作的PEP非依赖性葡萄糖摄入。

Chinen(见上述引文)和美国专利7,785,858公开了选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌(Coryneform)细菌和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的重组细菌，所述重组细菌包含增加的磷酸转酮酶活性用于使葡萄糖转化成借助中间体乙酰-CoA产生的靶分子，所述靶分子包括由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯和聚羟丁酸酯组成的组。这些菌株特征在于EMPP可操作的PEP依赖性葡萄糖摄入。值得注意地，与野生型或未修饰的菌株相比，美国专利7,785,858的细菌中磷酸果糖激酶的活性减少(见第33页)。

WO 2013/007786描述了一种具有磷酸转酮酶活性并且其中通过消除或减少磷酸果糖激酶来失活或削弱EMPP及其中通过消除或减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶离来失活或削弱PPP的氧化支路的重组微生物。这些措施导致由磷酸转酮酶转化并输送至PPP的非氧化支路的果糖-6-磷酸(F6P)的量增加。在这种情况下，通过与磷酸二羟丙酮(DHAP)缩合，使从PPP的非氧化支路产生的甘油醛-3-磷酸(G3P)再循环至果糖-1，6-二磷酸(FBP)。该反应由果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)催化。随后通过果糖二磷酸酶(EC3.1.3.11)的作用，使果糖-1，6-二磷酸(FBP)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

果糖二磷酸酶(EC 3.1.3.11)高度受调节(参见，例如，G.A.Tejwani，Advances inEnzymology and Related Areas of Molecular Biology 54：121-194(1983))。为了避免糖酵解期间的无效循环，果糖二磷酸酶活性在葡萄糖存在时下调。对大肠杆菌I型果糖二磷酸酶的变构抑制(为依赖糖新生(neoglucogenic)底物生长所需)由葡萄糖-6-磷酸(当葡萄糖转运进入细胞时生成的第一代谢物(并且还是大肠杆菌中蔗糖输入和代谢途径的部分))和AMP介导(J.Hines等人，J.Biol.Chem.282：24697-24706(2007))。如果培养基中存在葡萄糖或蔗糖，这种酶基本上无活性。

由于在利用微生物的发酵过程中，葡萄糖或蔗糖常用作碳源并且还以相当高的浓度使用，故这类发酵条件可能阻碍磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的效率。因此，需要开发甚至在培养基中或反应容器中高葡萄糖浓度或蔗糖浓度条件下允许磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的途径。

本发明通过提供一种从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)产生果糖-6-磷酸(F6P)的方法满足这种需求，所述方法包括步骤：

(a)使磷酸二羟丙酮(DHAP)酶促转化成二羟丙酮(DHA)；并且

(b)使如此产生的二羟丙酮(DHA)连同甘油醛-3-磷酸(G3P)一起酶促转化果糖-6-磷酸(F6P)；

或包括步骤：

(a’)使甘油醛-3-磷酸(G3P)酶促转化成甘油醛；并且

(b’)使如此产生的甘油醛连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起酶促转化成果糖-1-磷酸(F1P)；并且

(c’)并且使如此产生的果糖-1-磷酸(F1P)酶促转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

磷酸二羟丙酮(DHAP)首先转化成二羟丙酮(DHA)并且其后续与GAP缩合以产生F6P，这提供了使磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)缩合成果糖-1，6-二磷酸(FBP)并且其后续转化成果糖-6-磷酸(F6P)的备选途径，优点在于，它可以通过利用不受葡萄糖或蔗糖调节(尤其抑制)的酶来实现。因此，可以甚至在高浓度的葡萄糖或蔗糖时进行这种转化。对于如步骤(a’)至(c’)中所述DHAP和G3P转化，这同样适用。

当然，如上文所述从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)产生果糖-6-磷酸(F6P)的两种备选方法还可以组合应用(在体外或体内)。

因此，在第一方面，本发明涉及一种从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)产生果糖-6-磷酸(F6P)的方法，所述方法包括步骤：

(a)使磷酸二羟丙酮(DHAP)酶促转化成二羟丙酮(DHA)；并且

(b)使如此产生的二羟丙酮(DHA)连同甘油醛-3-磷酸(G3P)一起酶促转化果糖-6-磷酸(F6P)。

以例如通过使用分类为EC 3.1.3.-的酶，实现根据本发明方法的步骤(a)使磷酸二羟丙酮(DHAP)酶促转化成二羟丙酮(DHA)。这些酶也称作磷单酯水解酶(或磷单酯酶)。磷单酯水解酶是通过半胱氨酸残基或配位的金属离子亲核攻击磷，催化O-P键水解的酶。

在一个优选的实施方案中，分类为EC 3.1.3.-的酶选自：

-糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)；

-6-磷酸葡萄糖酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)；

-磷酸吡哆醛磷酸酶(EC 3.1.3.74)；

-果糖-1-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)；

-二羟丙酮磷酸酶(EC 3.1.3.-)；

-己糖醇磷酸酶(EC 3.1.3.-)

-酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)；

-碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)；

-甘油-1-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.21)；和

-3-磷酸甘油酸磷酸酶(EC 3.1.3.38)。

因此，在一个实施方案中，通过利用糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)是催化以下反应的酶：

糖磷酸+H

这种酶出现于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、原生动物和细菌。例如已经在以下生物中描述该酶：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(UniProt登录号Q9ZVJ5)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(UniProt登录号Q8IJ74)、马链球菌(Streptococcus equinus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)(UniProt登录号P75792)、乳酸埃希氏菌(Escherichiaacidilactici)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

原则上，EC 3.1.3.23的任何糖磷酸酶可以用于本发明的方法中，只要它具有使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)的能力即可。在一个优选的实施方案中，使用来自埃希氏菌(Escherichia)属细菌的酶，更优选地使用大肠杆菌物种的酶。甚至更优选地，使用来自大肠杆菌的YbiV蛋白或YidA蛋白(UniProt登录号P75792(SEQ ID NO：1；由SEQ IDNO：39的核苷酸序列编码)和P0A8Y5(SEQ ID NO：2；由SEQ ID NO：41的核苷酸序列编码)。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：1或2中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：1或2至少x％同源的氨基酸序列并且具有糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

就确定如本申请中所述的序列同一性而言，通常以下应当适用：当被比较的序列没有相同长度时，同一性程度指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数或指较长序列中与较短序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。优选地，它指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。

优选地使用本领域熟知的算法和软件，如Needleman-Wunsch算法连同EMBOSSNEEDLE软件，可以通过进行两两比对确定序列同一性程度。

当使用这种方法确定特定序列例如是否与参考序列至少60％相同时，可以使用EMBOSS NEEDLE软件的默认设置，所述默认设置如下定义：

-矩阵：BLOSUM62

-空位开放：10

-空位延伸：0.5

-无末端空位罚分。

优选地，在所比对序列的整个长度范围内计算同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用6-磷酸葡萄糖酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。6-磷酸葡萄糖酸磷酸酶是催化6-磷酸葡萄糖酸去磷酸化的酶。

例如已经对大肠杆菌描述这种酶。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法中使用来自大肠杆菌的相应酶，更优选地YieH蛋白(UniProt登录号P31467(SEQ ID NO：3；由SEQID NO：40的核苷酸序列编码))。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：3至少x％同源的氨基酸序列并且具有6-磷酸葡萄糖酸磷酸酶活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：3的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用磷酸吡哆醛磷酸酶(EC 3.1.3.74)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。磷酸吡哆醛磷酸酶是催化以下反应的酶：

吡哆醛5′-磷酸+H

这种酶出现于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物和细菌。例如已经在以下生物中描述该酶：智人(Homo sapien)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、侏兔(Brachylagus idahoensis)、普通牛(Bos taurus)、狼(Canis lupus)、家猫(Feliscatus)、原鸡(Gallus gallus)、长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)、小家鼠(Musmusculus)、解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)、草木犀中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、猪(Sus scorfa)和大肠杆菌(Escherichia coli)(UniProt登录号P27848)。原则上，EC 3.1.3.74的任何磷酸吡哆醛磷酸酶可以用于本发明的方法中，只要它具有使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)的能力即可。在一个优选的实施方案中，使用来自埃希氏菌(Escherichia)属细菌的酶，更优选地使用大肠杆菌物种的酶。甚至更优选地，使用来自大肠杆菌的YigL蛋白(UniProt登录号P27848(SEQ ID NO：4；由SEQID NO：42的核苷酸序列编码))。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：4至少x％同源的氨基酸序列并且具有磷酸吡哆醛磷酸酶(EC 3.1.3.74)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：4的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用果糖-1-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。果糖-1-磷酸磷酸酶是催化果糖-1-磷酸去磷酸化的酶。

例如已经对大肠杆菌描述这种酶。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法中使用来自大肠杆菌的相应酶，更优选地YqaB蛋白(UniProt登录号P77475(SEQ ID NO：5；由SEQID NO：43的核苷酸序列编码))。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：5至少x％同源的氨基酸序列并且具有果糖-1-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：5的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用二羟丙酮磷酸酶(EC 3.1.3.-)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。二羟丙酮磷酸酶是催化磷酸二羟丙酮(DHAP)去磷酸化以产生DHA的酶。

例如已经对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)描述这种酶。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法中使用来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的相应酶，更优选地HdpA蛋白(UniProt登录号A4QFW4(SEQ ID NO：6；由SEQ IDNO：48的核苷酸序列编码))。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：6至少x％同源的氨基酸序列并且具有二羟丙酮磷酸酶(EC 3.1.3.-)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：6的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用己糖醇磷酸酶(EC 3.1.3.-)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。己糖醇磷酸酶是催化D-甘露糖醇1-磷酸和D-山梨糖醇6-磷酸的去磷酸化的酶。

例如已经对大肠杆菌描述这种酶。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法中使用来自大肠杆菌的相应酶，更优选地HxpA蛋白(UniProt登录号P77625(SEQ ID NO：7；由SEQID NO：44的核苷酸序列编码))。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：7至少x％同源的氨基酸序列并且具有己糖醇磷酸酶(EC 3.1.3.-)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：7的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。酸性磷酸酶是催化以下反应的酶：

磷酸单酯+H

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)可以用于本发明的方法中，只要它可以使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)即可。

在另一个实施方案中，通过利用碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。类似于酸性磷酸酶，碱性磷酸酶是催化以下反应的酶：

磷酸单酯+H

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)可以用于本发明的方法中，只要它可以使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)即可。

在另一个实施方案中，通过利用甘油-1-磷酸磷酸酶(EC3.1.3.21)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。甘油-1-磷酸磷酸酶天然地催化以下反应：

甘油1-磷酸+H

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何甘油-1-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.21)可以用于本发明的方法中，只要它可以使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)即可。

在另一个实施方案中，通过利用3-磷酸甘油酸磷酸酶(EC 3.1.3.38)，实现磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。3-磷酸甘油酸磷酸酶天然地催化以下反应：

D-甘油酸盐3-磷酸+H

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、真菌和细菌。原则上，3-磷酸甘油酸磷酸酶(EC 3.1.3.38)可以用于本发明的方法中，只要它可以使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)即可。

如前所述，本发明方法的步骤(a)中获得的二羟丙酮(DHA)随后可以如方法的步骤(b)中所述那样，连同甘油醛-3-磷酸(G3P)一起进一步转化成果糖-6-磷酸(F6P)。在体外反应的情况下，可以单纯地添加甘油醛-3-磷酸(G3P)至反应。在体内反应的情况下，甘油醛-3-磷酸(G3P)由其他代谢途径提供。由于甘油醛-3-磷酸(G3P)是糖酵解及Entner-Douderoff-通路里的中间体，它基本出现在全部生物中。另外，它是磷酸二羟丙酮(DHAP)的异构体并且可以通过磷酸丙糖异构酶的作用，从磷酸二羟丙酮(DHAP)产生。

在一个实施方案中，可以使用称作醛裂解酶(有时也称作碳-碳裂解酶)的酶，实现本发明方法的根据步骤(b)使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。这些酶分类于EC 4.1.2.-中。这类酶在具有羰基和羟基的分子中催化C-C键切割，以形成两个分子，分别是醛和酮。但是，已经发现这些酶还能够催化甘油醛-3-磷酸(G3P)和二羟丙酮(DHA)缩合成果糖-6-磷酸(F6P)。

在一个的优选实施方案中，在本发明方法中用于使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的醛裂合酶是果糖-6-磷酸醛缩酶，例如，果糖-6-磷酸醛缩酶1。实例和优选的实施方案是来自大肠杆菌的从基因fsaA编码的果糖-6-磷酸醛缩酶1。可获得这种蛋白质的氨基酸序列，例如，依据UniProt登录号P78055(SEQ ID NO：8；由SEQID NO：34的核苷酸序列编码)。

在另一个的优选实施方案中，在本发明方法中用于使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的醛裂解酶是果糖-6-磷酸醛缩酶2。来自大肠杆菌的从基因fsaB编码的果糖-6-磷酸醛缩酶2是实例和优选的实施方案。可获得这种蛋白质的氨基酸序列，例如，依据UniProt登录号P32669(SEQ ID NO：16；由SEQ ID NO：36的核苷酸序列编码)。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：8、9或16中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：8、9或16至少x％同源的氨基酸序列并且具有果糖-6-磷酸醛缩酶活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：8、9或16的氨基酸序列比较，确定同一性程度。SEQ ID NO：9的氨基酸序列(由SEQ ID NO：35的核苷酸序列编码)是具有更高酶活性的SEQ ID NO：8的序列的突变形式。

在另一个实施方案中，可以使用称作转醛酶的酶，实现本发明方法的根据步骤(b)使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。这些酶分类于EC2.2.1.2中。这类酶催化以下反应：

这种酶出现于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、藻类、动物、真菌和细菌。例如已经在以下生物中描述该酶：嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)、普通牛(Bostaurus)、岸蟹(Carcinus maenas)、小球藻属物种(Chlorella sp.)，Chlorobiumvibriforme f.thiosulfatophilum、着色菌属物种(Chromatium sp.)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、裸藻属物种(Euglena sp.)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(UniProt登录号Q5NFX0)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(UniProt登录号Q76EM7)、智人(Homo sapiens)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、Moniiella megachiliensis、小家鼠(Mus musculus)、家蝇(Musca domestica)、欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、木糖发酵酵母(Scheffersomyces stipitis)、番茄(Solanum lycopersicum)、菠菜(Spinaciaolearacea)、棉叶螨(Tetranychus telarius)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(UniProt登录号Q9WYD1)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(UniProt登录号Q99XT4；SEQ ID NO：12(由SEQ ID NO：50的核苷酸序列编码))、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(UniProt登录号A0A0B5QQ90；SEQID NO：13(由SEQ ID NO：53的核苷酸序列编码))、Caulobacter vibrioides(UniProt登录号Q9A2F1；SEQ ID NO：14(由SEQ ID NO：54的核苷酸序列编码))、变异链球菌(Streptococcus mutans)(UniProt登录号Q8DVJ4；SEQ ID NO：15(由SEQ ID NO：56的核苷酸序列编码))、大肠杆菌(UniProt登录号P0A870；SEQ ID NO：17(由SEQ ID NO：37的核苷酸序列编码))、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(UniProt登录号A0A0M2AGL1；SEQ ID NO：18(由SEQ ID NO：52的核苷酸序列编码))、猪链球菌(Streptococcus suis)(UniProt登录号A0A0E4C393；SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：55的核苷酸序列编码))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(UniProt登录号A0A0D6J3Z8；SEQ ID NO：20(由SEQ ID NO：58的核苷酸序列编码))、戈登链球菌(Streptococcus gordonii)(UniProt登录号A8AZ46；SEQ ID NO：10(由SEQ ID NO：51的核苷酸序列编码))、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(UniProt登录号Q8E738；SEQ ID NO：31(由SEQ ID NO：57的核苷酸序列编码))和单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(UniProt登录号A0A0H3GHX1；SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：49的核苷酸序列编码))。

原则上，EC 2.2.1.2的任何转醛酶可以用于本发明的方法中，只要它具有使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的能力即可。在一个优选的实施方案中，使用来自链球菌属(Streptococcus)或李斯特氏菌属(Listeria)细菌的酶，更优选地使用戈登链球菌(Streptococcus gordonii)物种或单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)物种的酶。

在一个优选的实施方案中，使用来自戈登链球菌(Streptococcus gordonii)的由戈登链球菌SGO_1787基因(UniProt登录号A8AZ46)编码的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NOs：10至15、SEQ ID NOs：17至20、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：31之任一者中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NOs：10至20、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：31之任一者至少x％同源的氨基酸序列并且具有转醛酶(EC 2.2.1.2)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。特别优选来自猪链球菌(Streptococcus suis)的酶(UniProt登录号A0A0E4C393；SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：55的核苷酸序列编码))。

SEQ ID NO：64的氨基酸序列(由SEQ ID NO：38的核苷酸序列编码)是具有更高酶活性的SEQ ID NO：17的序列的突变形式(talB F178Y)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：10或11的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个方面，本发明涉及一种从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)产生果糖-6-磷酸(F6P)的方法，所述方法包括步骤：

(a’)使甘油醛-3-磷酸(G3P)酶促转化成甘油醛；并且

(b’)使如此产生的甘油醛连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起酶促转化成果糖-1-磷酸(F1P)；并且

(c’)使如此产生的果糖-1-磷酸(F1P)酶促转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

根据本发明方法的步骤(a’)使甘油醛-3-磷酸(G3P)酶促转化成甘油醛是根据以下方案的去磷酸化反应：

D-甘油醛-3-磷酸+H

对磷酸酯基团的这种水解切割是不可逆反应。可以例如通过使用分类为EC3.1.3.-的酶实现该反应。这些酶也称作磷单酯水解酶(或磷单酯酶)。磷单酯水解酶是通过半胱氨酸残基或配位的金属离子亲核攻击磷，催化O-P键水解的酶。

在一个优选的实施方案中，分类为EC 3.1.3.-的酶选自：

-甘油醛3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)；

-碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)；

-酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)；

-糖磷酸酶(EC 3.1.2.23)；和

-己糖醇磷酸酶(EC 3.1.3.-)

因此，在一个实施方案中，通过利用甘油醛3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)，实现甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。这些酶催化甘油醛-3-磷酸的去磷酸化。

已经例如对掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)PH1655基因编码的蛋白质或詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus iannaschii)MJ1437基因编码的蛋白质描述了这种活性。因此，在优选的实施方案中，使用来自掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)(UniProt登录号O59346(SEQ ID NO：21；由SEQ ID NO：59的核苷酸序列编码))或来自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)(UniProt登录号Q58832(SEQ ID NO：22；由SEQ ID NO：60的核苷酸序列编码))的相应蛋白质。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：21中所示或如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22至少x％同源的氨基酸序列并且具有甘油醛3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.-)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。

在另一个实施方案中，通过利用碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)，实现甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。碱性磷酸酶是催化以下反应的酶：

磷酸单酯+H

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)可以用于本发明的方法中，只要它可以使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛即可。

在另一个实施方案中，通过利用酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)，实现甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。类似于碱性磷酸酶，酸性磷酸酶是催化以下反应的酶：

磷酸单酯+H

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)可以用于本发明的方法中，只要它可以使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛即可。

在又一个优选的实施方案中，通过利用糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)，实现甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)是催化以下反应的酶：

糖磷酸+H

这种酶出现于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、原生动物和细菌。例如已经在以下生物中描述该酶：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(UniProt登录号Q9ZVJ5)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(UniProt登录号Q8IJ74)、马链球菌(Streptococcus equinus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)(UniProt登录号P75792(SEQ ID NO：1；由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码))、乳酸埃希氏菌(Escherichia acidilactici)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

原则上，EC 3.1.3.23的任何糖磷酸酶可以用于本发明的方法中，只要它具有使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛的能力即可。在一个优选的实施方案中，使用来自埃希氏菌(Escherichia)属细菌的酶，更优选地使用大肠杆菌物种的酶。甚至更优选地，使用来自大肠杆菌的YbiV蛋白(UniProt登录号P75792(SEQ ID NO：1；由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码))。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：1至少x％同源的氨基酸序列并且具有糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用己糖醇磷酸酶(EC 3.1.3.-)，实现甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。己糖醇磷酸酶是催化D-甘露糖醇1-磷酸和D-山梨糖醇6-磷酸的去磷酸化的酶。

例如已经对大肠杆菌描述这种酶。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法中使用来自大肠杆菌的相应酶，更优选地HxpB蛋白(UniProt登录号P77247 (SEQ ID NO：23；由SEQ ID NO：45的核苷酸序列编码))。在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：23至少x％同源的氨基酸序列并且具有己糖醇磷酸酶(EC 3.1.3.-)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：23的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

如前所述，本发明方法的步骤(a’)中获得的甘油醛随后可以如方法的步骤(b’)中所述那样，连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起进一步转化成果糖-6-磷酸(F1P)。在体外反应的情况下，可以单纯地添加磷酸二羟丙酮(DHAP)至反应。在体内反应的情况下，磷酸二羟丙酮(DHAP)由其他代谢途径提供。由于磷酸二羟丙酮(DHAP)是糖酵解及Entner-Douderoff-通路里的中间体，它基本出现在全部生物中。另外，它是甘油醛-3-磷酸(G3P)的异构体并且可以通过磷酸丙糖异构酶的作用，从甘油醛-3-磷酸(G3P)产生。

根据本发明方法的步骤(b’)使磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛转化成果糖-1-磷酸(F1P)是一个醇醛缩合过程并且根据以下反应推进：

例如可以通过利用果糖二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)，实现这种转化。

果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)是可以催化以下反应的酶：

已经在多种生物中鉴定该酶，并且将果糖-1，6-二磷酸醛缩酶划分成依赖于不同反应机理的两个类别。I类果糖-1，6-二磷酸醛缩酶主要存在于动物和高等植物中，而II类果糖-1，6-二磷酸醛缩酶主要存在于藻类、细菌和酵母中。属于II类的酶需要双价金属离子作为辅因子。

已经从不同的原核来源和真核来源分离I型和II型果糖-1，6-二磷酸醛缩酶，并且因此，果糖-1，6-二磷酸醛缩酶是在糖酵解、糖异生和果糖代谢中发挥关键作用的遍存性糖酵解酶(Brovetto M.等人Chem.Rev.111(2011)，4346-4403)。

因此，在优选的实施方案中，果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)源自原核生物、优选地细菌。例如已经描述该酶出现在以下生物中：不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)、大肠杆菌、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、梭菌属物种(Clostridium sp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)、幽门螺旋杆菌(Heliobacter pylori)、乳杆菌属物种物种(Lactobacillus sp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)、青霉素属物种(Penicillinum sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)和兔甲烷球菌(Methylococcuscuniculus)。

另外，在优选的实施方案中，果糖1，6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)源自真核生物。例如已经描述该酶出现在以下生物中：智人(Homo sapiens)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)、原鸡(Gallus gallus)、玉蜀黍(Zeamays)、普通牛(Bos taurus)、小家鼠(Mus musculus)和紫花苜蓿(Medicago sativa)。

Siebers等人的研究首次揭示尚未在任一个测过序的古细菌基因组中鉴定编码经典I类酶和II类酶的基因(Siebers B.等人，J Bol.Chem.276(2001)，28710-28718)。稍后，来自两种极端嗜热古细菌的醛缩酶(附着热变形菌(Thermoproteus tenax)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))的生物化学及结构表征显示这些酶利用西夫碱基机制并且因此属于I类醛缩酶(Siebers等人，参见上述引文；Lorentzen E.等人，Biochem.Soc.Trans.32(2004)，259-263)。

可以将I类果糖-1，6-二磷酸醛缩酶分类成可基于免疫反应性以及相对于果糖-1，6-二磷酸底物和果糖1-磷酸底物的周转率区分的三个同工酶形式(Blonski等人，Biochem.J.323(1997)，71-77)。来自兔肌肉的同工酶A已经是研究最充分的I类果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(Gefflaut等人，Prog.Biophys.Mol.Biol.63(1995)，301-340)。已经对几十种不同的同工酶测序并且已经测定几种醛缩酶同工酶结构，包括来自兔肌肉(Sygusch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84(1987)，7846-7850)、人肌肉(Gamblin等人，FEBS Lett.262(1987)，282-286；Arakaki等人，Protein Sci.13(2004)，3077-3084)和果蝇(Hester等人，FEBS Lett.292(1991)，237-242)的那些酶。除占据C端区域的20个氨基酸残基外，这些同工酶的分子架构是高度保守的。同源四聚体的每个酶亚单位的多肽折叠对应于β-桶的多肽折叠，其中活性部位位于β-桶的中心(Sygusch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84(1987)，7846-7850)。不同于其他β-桶同工酶，活性部位由庞大数目的带电荷氨基酸残基即Asp-33、Lys-107、Lys-146、Glu-187和Lys-229组成(Blonski等人，Biochem.J.323(1997)，71-77)。

II类FBP-醛缩酶需要二价阳离子，通常是Zn

II类FBP酶可以进一步划分成IIA类和IIB类家族。传统上，IIA类和IIB类FBP酶根据序列同源性和其低聚状态归类。IIA类FBP酶视为二聚体，而IIB类FBA可以是二聚体、四聚体或八聚体。(Izard和Sygush，J.Biol.Chem 279(2004)，11825-11833；Galkin等人，Biochemistry 48(2009)，3186-3196；Nakahara等人，Plant Cell Physiol.44(2003)，326-333)。比对各FBP-蛋白的序列，显示属于每个家族的成员显示出40％序列相似性，并且在A型和B型II类FBP醛缩酶之间的氨基酸序列同一性属于25-30％数量级(Plaumann等人，Curr.Genet.31(1997)，430-438)。对八种已知的II类FBP醛缩酶的后续序列比对显示Arg-331是高度保守的残基之一。化学修饰和位点定向诱变已经确认这个氨基酸在活性部位中的至关重要作用(Qamar等人，Protein Sci.5(1996)，154-161)。

已经测定几种酶的晶体结构，即来自大肠杆菌(Hall等人，J.Mol.Biol.287(1999)，383-394)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Izard和Sygush；参见上述引文)、Thermus caldophilus(Lee等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.347(2006)，616-625)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)(Galkin等人；参见上述引文)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Pegan等人，J.Mol.Biol.386(2009)，1038-1053)的酶。结核分枝杆菌FBP醛缩酶的二级结构类似于其他的细菌II类醛缩酶(Pegan等人，参见上述引文)。该酶具有八链β-折叠核心，其中每条β-链(β1-β8)通常尾随一个α-螺旋(α1-α8a)，产生一个总体(β/α)8-桶折叠，也称作TIM桶折叠(InterPro数据库中的参考号是IPR013785)。

原则上，任何果糖1，6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)可以用于根据本发明方法使D-赤藓糖转化成乙醇醛。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中所用的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)是来自大肠杆菌(Escherichia coli)(菌株K12)的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(即，II类果糖-二磷酸醛缩酶)(Uniprot P0AB71)，其显示如SEQ ID NO：24中所述的氨基酸序列(由基因fbaA的SEQ ID NO：46的核苷酸序列编码)；或来自大肠杆菌(菌株K12)的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(即，I类果糖-二磷酸醛缩酶)(Uniprot P0A991)，其显示如SEQ ID NO：25中所述的氨基酸序列(由基因fbaB的SEQ ID NO：47的核苷酸序列编码)；或来自智人(Homosapiens)的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶B(Uniprot P05062)，其显示如SEQ ID NO：26中所述的氨基酸序列(由基因ALDOB的SEQ ID NO：61的核苷酸序列编码)；或来自智人的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶A(Uniprot P04075)，其显示如SEQ ID NO：27中所述的氨基酸序列，或来自智人的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶C(Uniprot P09972)，其显示如SEQ ID NO：28中所述的氨基酸序列。

因此，在优选的实施方案中，本发明方法中所用的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)具有如SEQ ID NOs：24至28之任一者中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NOs：24至28之任一者至少x％同源的氨基酸序列并且具有果糖-1，6-二磷酸醛缩酶活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使D-赤藓糖转化成乙醇醛。优选地，如上文所述确定同一性程度。

可以用本领域技术人员已知的方法评估果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的酶活性。例如在Blonski K.等人，Biochem.J.323(1997)，71-77和Szwergold等人，Arch.Biochem.Biophys.317(1995)，244-252中描述这类方法。

如前所述，本发明方法的步骤(b’)中获得的果糖-1-磷酸(F1P)随后可以酶促进一步转化成果糖-6-磷酸(F6P)(参见步骤(c’))。这种转化是异构化过程并且根据以下反应推进：

可以例如通过使用葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)、磷酸甘露糖变位酶(EC5.4.2.8)或β-葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.6)实现转化。

因此，在一个实施方案中，通过利用葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)，实现根据本发明方法的步骤(c’)的果糖-1-磷酸(F1P)到果糖-6-磷酸(F6P)的转化。葡萄糖磷酸变位酶是天然催化以下反应的酶：

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)可以用于本发明的方法中，只要它可以使果糖-1-磷酸(F1P)转化转化成果糖-6-磷酸(F6P)即可。在一个优选的实施方案中，该酶是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，优选地嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonashydrophila subsp.hydrophila)的pgm基因编码的酶，如具有如UniProt登录号A0KIH4中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：29；由基因pgm的SEQ ID NO：62的核苷酸序列编码)的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：29至少x％同源的氨基酸序列并且具有葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：29的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用磷酸甘露糖变位酶(也称作葡萄糖磷酸变位酶)(EC 5.4.2.8)，实现根据本发明方法的步骤(c’)的果糖-1-磷酸(F1P)到果糖-6-磷酸(F6P)的转化。已经报告磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)天然地催化以下反应：

和

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)可以用于本发明的方法中，只要它可以使果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)即可。在一个优选的实施方案中，该酶是由嗜水气单胞菌、优选地嗜水气单胞菌嗜水亚种的AHA_2903基因编码的酶，如具有如UniProt登录号A0KMA6中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：30；由基因AHA 2903的SEQ ID NO：63的核苷酸序列编码)的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：30至少x％同源的氨基酸序列并且具有磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：30的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

在另一个实施方案中，通过利用β-葡萄糖磷酸变位酶(也称作磷酸甘露糖变位酶)(EC 5.4.2.6)，实现根据本发明方法的步骤(c’)的果糖-1-磷酸(F1P)到果糖-6-磷酸(F6P)的转化。已经报告β-葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.6)天然地催化以下反应：

这种酶出现于庞大种类的生物中，包括原核生物，如细菌。原则上，任何β-葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.6)可以用于本发明的方法中，只要它可以使果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)即可。在一个优选的实施方案中，该酶是由大肠杆菌(菌株K12)的pgm基因编码的酶，如具有如UniProt登录号P36938中所示氨基酸序列(由称作pgm的基因编码的SEQ ID NO：32)的蛋白质；或由大肠杆菌(菌株K12)的ycjU基因编码的酶，如具有如UniProt登录号P77366中所示氨基酸序列(由称作YcjU的基因编码的SEQ ID NO：33)的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33至少x％同源的氨基酸序列并且具有β-葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.6)活性，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样使果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

优选地，通过相应序列与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列比较，确定同一性程度。

本发明的方法可以在体外或在体内实施。体外反应理解为其中不使用细胞的反应，即无细胞反应。因此，体外优选地意指在无细胞系统中。在一个实施方案中，术语“在体外”意指在分离的酶(或酶系统，任选地包含可能要求的辅因子)存在下。在一个实施方案中，该方法中所用的酶以纯化形式使用。

为了体外实施该方法，将反应的底物和酶在允许酶有活性并允许酶促转化发生的条件下(缓冲液、温度、协同底物、辅因子等)温育。允许该反应推进足以产生相应产物的时间。可以通过本领域已知的方法，如可能与质谱法检测连接的气相色谱，测量各自产物的产生。

酶可以处于允许酶促反应发生的任何合适形式。它们可以是纯化或部分纯化的或处于细胞粗提物或部分纯化的提取物形式。酶还可能固定在合适的载体上。

在另一个实施方案中，本发明的方法在生物、优选微生物存在下以培养方式实施，产生对如上文所述的本发明转化方法所述的酶。利用微生物实施本发明方法的方法称作“体内”方法。可以使用天然产生上文对本发明转化方法所述的酶的微生物或已经过基因修饰从而它表达(包括过量表达)这类酶中一者或多者的微生物。因此，微生物可以是这样的工程化微生物，所述工程化微生物表达上述用于本发明方法转化的酶，即在其基因组中具有编码这类酶的核苷酸序列并且已经过修饰以过量表达它们。表达可以按组成型方式或按诱导或受调节的方式发生。

在另一个实施方案中，微生物可以是这样的微生物，所述微生物已经通过引入一种或多种核酸分子被基因修饰，所述核酸分子含有编码上述用于本发明方法转化的一种或多种酶的核苷酸序列。该核酸分子可以稳定地整合到该微生物的基因组中或可以按染色体外方式例如在质粒上存在。

这种基因修饰微生物可以是例如这样的微生物，所述微生物不天然地表达上述用于本发明方法转化的酶并且已经过基因修饰以表达这类酶，或所述微生物天然地表达这类酶并且已经过基因修饰，例如用核酸(例如编码相应酶的载体)转化和/或在编码该酶的内源核苷酸序列前方插入启动子以增加所述微生物中的相应活性。

然而，本发明优选地排除如自然界中所存在那样的天然存在的微生物，所述微生物按照自然界中存在的水平表达如上文所述的酶。相反，本发明的和在本发明方法中使用的微生物优选地是非天然存在的微生物，无论它是否已经过基因修饰以表达(包括过量表达)正常情况下不存在于其基因组中的本发明外源酶或无论它是否已经过工程化以过量表达外源酶。

因此，本发明使用的酶和(微)生物优选地是非天然存在的酶或(微)生物，即它们是与天然存在的酶或微生物显著不同并且在自然界中不存在的酶或微生物。就这些酶而言，它们优选地是天然存在酶的变体，所述变体本身不存在于自然界中。这类变体例如包括突变体，尤其通过分子生物学方法制备的突变体，其显示改善的特性，如更高酶活性、更高底物专一性、更高耐温性等。就(微)生物而言，它们优选地是因基因修饰而不同于天然存在生物的如上文所述的基因修饰生物。基因修饰生物是不天然存在的，即，不能在自然界中存在并且因引入外来核酸分子而与天然存在生物明显不同的生物。

通过过量表达如上文所述的外源酶或内源酶，酶浓度大幅度高于自然界中存在的浓度，这随后可以出乎意料地迫使利用相应非天然酶的本发明反应进行。优选地，过量表达的酶的浓度是总宿主细胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。

将“非天然”底物理解为这样的分子，所述分子在自然界中不受相应的酶作用，甚至它可以实际上与内源酶一起共存于微生物中。这种个“非天然”底物在自然界中不被微生物转化，因为其他底物是优选的(例如“天然底物”)。因此，本发明构思用上文描述的酶在自然界中不存在的环境下利用非天然底物。

因此，在本发明的上下文中，还可能该微生物是天然不具有相应酶活性，但经基因修饰从而包含允许相应酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地，该微生物也可以是天然具有相应酶活性，但是经基因修饰从而增强这种酶活性(例如通过引入编码相应酶的外源核苷酸序列或通过引入针对编码该酶的内源性基因的启动子以增加内源产生至过量表达(非天然)水平)的微生物。

如果使用天然表达相应酶的微生物，可以如此修饰这种微生物，从而在微生物中过量表达相应的活性。可以例如通过以下方式实现这一点：在相应基因的启动子区中实施突变或引入高表达性启动子，从而导致确保基因的更高表达的启动子。供选地，还可能是基因如此突变，从而导致显示更高活性的酶。

通过使用表达上文对本发明转化方法所述的酶的微生物，可以在不需要分离或纯化酶的情况下，在培养基中直接实施本发明的方法。

在一个实施方案中，本发明方法中使用的生物是这样的微生物，所述微生物已经过基因修饰以含有编码上述用于本发明方法转化的至少一种酶的外来核酸分子。在这种语境下，术语“外来”或“外源”意指核酸分子不天然地存在于所述微生物中。这意味着它不出现在微生物中的相同结构内或在相同位置处。在一个优选的实施方案中，外来核酸分子是包含启动子和编码相应酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在这种语境下，“异源”意指该启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同编码序列表达的启动子，即，它衍生自另一个基因，或是合成性启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是微生物异源的启动子，即在相应的微生物中不天然存在的启动子。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。在不同类型的生物中、尤其在微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的。

在又一个实施方案中，核酸分子相对于微生物是外来的，在于编码的酶相对于微生物不是内源的，即当微生物未经基因修饰时不由该微生物天然表述。换句话说，编码的酶相对于微生物是异源的。外来核酸分子可以在微生物中以染色体外形式存在，例如作为质粒，或稳定整合在染色体中。优选稳定整合。因此，基因修饰可以例如在于整合编码酶的相应基因至染色体中，或在于从含有酶编码序列上游的启动子的质粒表达所述酶，所述启动子和编码序列优选地源自不同生物；或本领域技术人员已知的任何其他方法。

在本发明的上下文中，术语“微生物”指细菌，以及指真菌，如酵母，并且也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在本发明方法中待使用的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在一个特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属并且甚至更优选地属于大肠杆菌种。在另一个优选实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌物种，或属于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)物种，或属于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)物种或属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。

还可能使用极端嗜热性细菌如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。

在另一个优选实施方案中，微生物是真菌，更优选地是的酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)、曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的真菌，并且甚至更优选地是以下物种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pichia torula或Pichia utilis。

在另一个实施方案中，本发明的方法利用光合微生物，所述光合微生物表达至少一种用于如上文所述的本发明转化的酶。优选地，微生物是光合细菌或微藻。在又一个实施方案中，微生物是藻类，更优选地属于硅藻类的藻类。

还可构思在本发明方法中使用微生物的组合，其中不同微生物表达如上文所述的不同酶。下文还将进一步详细描述为表达目的酶对微生物的基因修饰。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括步骤：提供生物，优选地携带相应酶活性或(细胞)培养物形式、优选液态细胞培养物形式的活性的微生物，后续步骤是在发酵器(经常也称作生物反应器)中允许相应酶表达的合适条件下培育所述生物，优选地微生物，并且还包括步骤：实现如本文上述的本发明方法的酶促转化。合适的发酵器或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵器指支持生物活性环境的本领域已知的任何制造或工程化装置或系统。因此，生物反应器或发酵器可以一种容器，其中实施化学/生物化学过程(如本发明的方法)，所述方法涵盖生物、优选地微生物和/或生物化学活性物质，即，携带上述酶的这类生物或从这类生物衍生的上述酶。在生物反应器或发酵器中，这种过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器常见是圆柱状，并且可以具有从数升至若干立方米的一系列规格，并经常由不锈钢制成。在这个方面，不受理论约束，发酵器或生物反应器可以按照这样的方式设计，从而它适合以分批培养、补料分批培养、灌流培养或恒化培养来培养生物，优选地微生物，全部培养方法通常均是本领域已知的。

培养基可以是适于培养相应生物或微生物的任何培养基。

如上所述，在如WO 2013/007786中所述的微生物里实施时，本发明的方法可能特别地有用及有利。该文件描述了一种具有磷酸转酮酶活性并且其中通过消除或减少磷酸果糖激酶，失活或削弱EMPP及其中通过消除或减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，失活或削弱PPP的氧化支路的重组微生物。这些措施导致由磷酸转酮酶转化并输送至PPP的非氧化支路的果糖-6-磷酸(F6P)的量增加。在这种情况下，通过与磷酸二羟丙酮(DHAP)缩合，使从PPP的非氧化支路产生的甘油醛-3-磷酸(G3P)再循环至果糖-1，6-二磷酸(FBP)。该反应由果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)催化。随后通过果糖二磷酸酶(EC 3.1.3.11)的作用，使果糖-1，6-二磷酸(FBP)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。本发明的方法规避了果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)和果糖二磷酸酶(EC 3.1.3.11)的调控作用和在发酵培养基中较高葡萄糖或蔗糖水平时它们的抑制作用。因此，本发明的方法允许这种微生物中甚至在培养基里或反应容器里在高葡萄糖浓度或蔗糖浓度的条件下将磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。因此，在优选的实施方案中，在如WO 2013/007786中所述的微生物里实施产生果糖-6-磷酸的本发明上述方法。

因此，在优选的实施方案中，在下述微生物中实施本发明的方法，所述微生物不仅特征在于重组表达上文关联该方法描述的酶，还进一步特征在于该微生物：

a)具有磷酸转酮酶活性；

b)(i)因失活编码磷酸果糖激酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)；或

(ii)没有磷酸果糖激酶活性；

和

c)(i)因失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或因基与未修饰的微生物相比减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的磷酸戊糖途径氧化支路(PPP)；或

(ii)没有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。

这种微生物特征在于具有磷酸转酮酶活性，从而增加产生的乙酰-CoA的通量。通常，微生物借助Embden-Meyerhof-Parnas途径使转葡萄糖转化成丙酮酸，所述丙酮酸随后可以由丙酮酸脱氢酶转化成乙酰-CoA。然而，这种转化伴随着CO

如本文中所用的术语“磷酸转酮酶活性”意指能够根据以下反应将D-木酮糖-5-磷酸转化成D-甘油醛-3-磷酸的酶活性：

D-木酮糖-5-磷酸+磷酸根→D-甘油醛-3-磷酸+乙酰基-磷酸+水

或者能够催化上文所示反应并且也能够根据以下反应使D-果糖-6-磷酸转化成D-赤藓糖-4-磷酸的酶活性：

D-果糖6-磷酸+磷酸根→乙酰磷酸+D-赤藓糖4-磷酸+水

前者磷酸转酮酶通常分类为EC 4.1.2.9并且后者分类为EC 4.1.2.22。两种类型的磷酸转酮酶均可以在本发明的范围内使用。图1显示使用两种选项的如本文所述的磷酸转酮酶的总体反应的方案。

可以通过本领域已知的测定法测量这种酶活性。下文实施例部分中给出这种测定法的实例。

在本发明的上下文中，具有磷酸转酮酶活性的微生物可以例如是天然具有磷酸转酮酶活性的微生物或不天然具有磷酸转酮酶活性并且已经过基因修饰以表达磷酸转酮酶的微生物或天然具有磷酸转酮酶活性并且已经过基因修饰(例如用编码磷酸转酮酶的核酸(例如载体)转化)以便增加所述微生物中磷酸转酮酶活性的微生物。

内在地即天然地具有磷酸转酮酶活性的微生物是本领域已知的，并且它们的任一种可以用于本发明的上下文中。

在本发明的上下文中该微生物也可能是不天然具有磷酸转酮酶活性，但经基因修饰从而包含允许磷酸转酮酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地，该微生物也可以是天然具有磷酸转酮酶活性，但是经基因修饰从而增强磷酸转酮酶活性(例如通过引入编码磷酸转酮酶的外源核苷酸序列)的微生物。

下文将详细描述为表达目的酶对微生物的基因修饰。

在该微生物中表达的磷酸转酮酶可以是任何磷酸转酮酶，特别是来自原核生物或真核生物的磷酸转酮酶。描述了例如来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的原核磷酸转酮酶。

在该微生物中表达的磷酸转酮酶可以是天然存在的磷酸转酮酶或它可以是(例如通过引入例如改变或改进酶活性、稳定性等的突变或其他改变)从天然存在的磷酸转酮酶衍生的磷酸转酮酶。

该微生物优选地进一步特征在于：因失活编码磷酸果糖激酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)或没有磷酸果糖激酶活性。因而，该微生物是这样的微生物，所述微生物天然具有包括磷酸果糖激酶活性的EMPP，但是已经被修饰，特别地被基因修饰，从而磷酸果糖激酶活性是完全消除，或从而与相应未修饰的微生物相比，该活性减少，或者该微生物是天然没有磷酸果糖激酶活性的微生物。

如上文已经提到，在葡萄糖经EMPP加工成乙酰-CoA时，一个碳原子因最后步骤中CO

“磷酸果糖激酶活性”意指使ATP和果糖-6-磷酸转化成ADP和果糖-1，6-二磷酸的酶活性(EC 2.7.1.11)。可以通过本领域已知(例如，由Kotlarz等人(Methods Enzymol.(1982)90，60-70)描述)的测定法测量这种酶活性。

术语“特征在于因失活编码磷酸果糖激酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的微生物”优选地指这样的微生物，其中编码磷酸果糖激酶的基因的失活或与未修饰的微生物相比磷酸果糖激酶活性减少由致所述失活或减少的微生物基因修饰实现。

在一个优选实施方案中，该重组微生物是因失活编码磷酸果糖激酶的基因而具有失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的重组微生物。在本发明的上下文中，编码磷酸果糖激酶的基因的失活意指微生物中存在的编码磷酸果糖激酶的基因失活，从而它们不再表达和/或不导致有功能的磷酸果糖激酶合成。可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。可以例如通过破坏编码磷酸果糖激酶的基因或通过导入选择标记彻底缺失所述基因，实现失活。可选地，编码磷酸果糖激酶的基因的启动子可以按基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码磷酸果糖激酶的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与磷酸果糖激酶基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可能翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码磷酸果糖激酶的基因的失活。

在本发明的上下文中，术语“失活”优选地意指完全失活，即，微生物不显示磷酸果糖激酶活性。这特别意指该微生物与所用的生长条件无关不显示磷酸果糖激酶活性。

优选地，“失活”意指微生物中存在的编码磷酸果糖激酶的基因被如此基因修饰，从而防止该酶的表达。可以例如通过以下方式实现这点：缺失基因或其部分，其中缺失其部分防止酶的表达，或在编码区中或启动子区中破坏基因，其中所述破坏具有无蛋白质表达或表达功能异常蛋白质的作用。

在一个优选实施方案中，该重组微生物是因与未修饰的微生物相比减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的重组微生物。优选地，通过基因修饰该微生物实现这种减少。这可以例如通过随机诱变或位点定向诱变启动子和/或酶并后续选择具有所需特性的启动子和/或酶或通过如上文所述的互补性核苷酸序列或RNAi效应来实现。

在本发明的上下文中，“降低的活性”意指基因修饰的微生物中酶的、尤其磷酸果糖激酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中低至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％或50％、甚至更优选地至少70％或80％并且特别优选至少90％或100％。本领域技术人员熟知用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法。本领域已知用于测量磷酸果糖激酶的减少的酶活性的测定。

在另一个实施方案中，该微生物是没有磷酸果糖激酶活性的微生物。这优选地意指这种微生物天然地没有磷酸果糖激酶活性。这意指这种微生物在其基因组中天然地不含有编码具有磷酸果糖激酶活性的酶的核苷酸序列。这类微生物的例子是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(J.S.Suo等人，Nat.Biotechnol.23：63(2005))和真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(C.Fleige等人，Appl.Microb.Cell Physiol.91：769(2011))。

该微生物进一步特征如下：因失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的磷酸戊糖途径氧化支路(PPP)或没有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。因而，该微生物优选地是这样的微生物，所述微生物天然具有包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的PPP，但是已经过修饰，特别地经基因修饰，从而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性完全消除，或从而与相应的未修饰的微生物相比，该活性降低，或者该微生物是天然没有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的微生物。

削弱或失活磷酸戊糖途径氧化支路进一步增加乙酰-CoA的产率，因为葡萄糖-6-磷酸将不再通过磷酸戊糖循环而抽出。微生物中的全部或几乎全部葡萄糖-6-磷酸将转化成果糖-6-磷酸，后者随后将进一步转化成乙酰-CoA。

“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性”意指将葡萄糖-6-磷酸和NADP

术语“特征在于因失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的磷酸戊糖途径(PPP)氧化支路的微生物”优选地指这样的微生物，其中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的失活或与未修饰的微生物相比葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性减少由致所述失活或减少的微生物基因修饰实现。

在一个优选实施方案中，该重组微生物是因失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因而具有失活的磷酸戊糖途径(PPP)氧化支路的重组微生物。在本发明的上下文中，编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的失活意指微生物中存在的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因失活，从而它们不再表达和/或不导致有功能的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶合成。可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。可以例如通过破坏编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或通过导入选择标记彻底缺失所述基因，实现失活。可选地，编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的启动子可以按该基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可能翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因的失活。

在本发明的上下文中，术语“失活”优选地意指完全失活，即，微生物不显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这特别意指该微生物与所用的生长条件无关不显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。

优选地，“失活”意指微生物中存在的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因被如此基因修饰，从而防止该酶的表达。可以例如通过以下方式实现这点：缺失基因或其部分，其中缺失其部分防止酶的表达，或在编码区中或启动子区中破坏基因，其中所述破坏具有无蛋白质表达或表达功能异常蛋白质的作用。

在一个优选实施方案中，该重组微生物是因与未修饰的微生物相比减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱的磷酸戊糖途径(PPP)氧化支路的重组微生物。优选地，通过基因修饰该微生物实现这种减少。这可以例如通过随机诱变或位点定向诱变启动子和/或酶并后续选择具有所需特性的启动子和/或酶或通过如上文所述的互补性核苷酸序列或RNAi效应来实现。

在本发明的上下文中，“减少的活性”意指基因修饰的微生物中酶的、尤其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中低至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％或50％、甚至更优选地至少70％或80％并且特别优选至少90％或100％。本领域技术人员熟知用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法。本领域已知用于测量葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的减少的酶活性的测定。

在另一个实施方案中，该微生物是没有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的微生物。这优选地意指这种微生物天然地没有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这意指这种微生物在其基因组中天然地不含有编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的酶的核苷酸序列。这类微生物的例子是贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)(Barbe等人，Nucl.Acids Res.32(2004)，5766-5779)、极端嗜热门古细菌如硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Nunn等人，J.Biol.Chem.285(2010)，33701-33709)、附着热变形菌(Thermoproteus tenax)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)(Reher和

该微生物可以原则上特征在于具有果糖-1，6-二磷酸磷酸酶活性。但是，如上文所述的，由于这种酶可以被高水平葡萄糖抑制，故优选将其作用被替换为从磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)产生果糖-6-磷酸(F6P)的本发明方法。果糖-6-磷酸随后可以经磷酸转酮酶途径再次转化成乙酰-CoA。实际上，磷酸转酮酶的产物乙酰磷酸通过磷酸乙酰转移酶EC 2.3.1.8的作用反转化成乙酰-CoA。因此，该重组微生物能够从葡萄糖以接近3∶1的化学计量产生乙酰-CoA。在方程2中给出反应的总和：

葡萄糖+ATP+3CoA→3乙酰-CoA+ADP+H

在另一个实施方案中，该微生物进一步特征在于：EMPP进一步因失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而削弱或失活。在进一步下游的某步骤通过削弱或失活甘油醛3-磷酸脱氢酶进一步削弱EMPP确保了，可以在微生物中产生的甘油醛3-磷酸将均不或几乎均不通过糖酵解加工成乙酰-CoA，其中一个碳原子将在丙酮酸脱氢酶催化的最末步骤中通过释放CO

“甘油醛3-磷酸脱氢酶活性”意指使甘油醛3-磷酸、磷酸根和NAD

术语“特征在于因失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的另外Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)的微生物”优选地指这样的微生物，其中编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的失活或与未修饰的微生物相比甘油醛3-磷酸脱氢酶活性减少由致所述失活或减少的微生物基因修饰实现。

在一个优选实施方案中，该重组微生物是这样的重组微生物，其中EMPP进一步因失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而削弱或失活。在本发明的上下文中，编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的失活意指微生物中存在的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因失活，从而它们不再表达和/或不导致有功能的甘油醛3-磷酸脱氢酶合成。可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。可以例如通过破坏编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或通过导入选择标记彻底缺失所述基因，实现失活。可选地，编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的启动子可以按该基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可能翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的失活。

在本发明的上下文中，术语“失活”优选地意指完全失活，即，微生物不显示甘油醛3-磷酸脱氢酶活性。这特别意指该微生物与所用的生长条件无关不显示甘油醛3-磷酸脱氢酶活性。

优选地，“失活”意指微生物中存在的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因被如此基因修饰，从而防止该酶的表达。可以例如通过以下方式实现这点：缺失基因或其部分，其中缺失其部分防止酶的表达，或在编码区中或启动子区中破坏基因，其中所述破坏具有无蛋白质表达或表达功能异常蛋白质的作用。

在一个优选实施方案中，该重组微生物是因与未修饰的微生物相比减少甘油醛3-磷酸脱氢酶活性而具有削弱的EMPP的重组微生物。优选地，通过基因修饰该微生物实现这种减少。这可以例如通过随机诱变或位点定向诱变启动子和/或酶并后续选择具有所需特性的启动子和/或酶或通过如上文所述的互补性核苷酸序列或RNAi效应来实现。

在本发明的上下文中，“减少的活性”意指基因修饰的微生物中酶的、尤其甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中低至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％或50％、甚至更优选地至少70％或80％并且特别优选至少90％或100％。本领域技术人员熟知用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法。本领域已知用于测量甘油醛3-磷酸脱氢酶的减少的酶活性的测定。

在其中重组微生物是细菌的另一个实施方案中，已经使编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因失活。在本发明的上下文中，失活意指微生物中存在的编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因失活，从而它们不再表达和/或不导致有功能的PEP依赖性PTS转运蛋白合成。编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因失活应当是这样的，从而细菌不再能够通过PEP依赖性PTS转运蛋白运输葡萄糖。

本领域已知PEP依赖性PTS转运蛋白(例如来自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))。在下文实施例部分中显示失活PEP依赖性PTS转运蛋白的例子。

可以通过本领域已知的许多不同方式实现失活。可以例如通过破坏编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因或通过导入选择标记彻底缺失所述基因，实现失活。可选地，编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因的启动子可以按该基因不再转录成mRNA的方式突变。本领域已知的失活编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因的其他方式是：表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有与PEP依赖性PTS转运蛋白基因的转录物互补的核苷酸序列，从而该mRNA不再可能翻译成蛋白质；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过RNAi效应阻抑所述基因表达；表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA具有特异性切割所述基因的转录物的活性；或表达编码RNA的多核苷酸，所述RNA通过共抑制作用抑制所述基因的表达。可以将这些多核苷酸并入载体中，其中可以通过转化将所述载体引入微生物中以实现编码PEP依赖性PTS转运蛋白的基因的失活。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗葡萄糖的生物，优选地微生物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗果糖的生物，优选地微生物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗木糖的生物，优选地微生物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗甘露糖的生物，优选地微生物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗多于一种糖的生物，优选地微生物。优选地，所述多于一种糖包括蔗糖、葡萄糖、甘露糖和/或木糖。在一个更优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗两种或更多种选自蔗糖、葡萄糖、甘露糖和木糖的糖的生物，优选地微生物。能够消耗葡萄糖、果糖、木糖和/或甘露糖的生物和/或微生物的确天然地存在并且是本领域已知的。

在另一个实施方案中，所述生物和/或微生物经基因修饰，旨在能够消耗葡萄糖、果糖、木糖和/或甘露糖和/或经基因修饰，旨在增加生物和/或微生物消耗葡萄糖、果糖、木糖和/或甘露糖的能力。本领域已知相应的基因修饰。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)消耗糖的生物，优选地微生物。

在另一个实施方案中，本发明的方法利用能够通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的生物，优选地微生物。

能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)和/或通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的生物和/或微生物是本领域已知的。

在另一个实施方案中，所述生物和/或微生物经基因修饰，旨在能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)或通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖。在另一个优选的实施方案中，所述生物和/或微生物经基因修饰，旨在增加生物和/或微生物通过磷酸转移酶转运系统(PTS)或通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的能力。本领域已知相应的基因修饰。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用具有削弱或失活的磷酸转移酶转运系统(PTS)的生物，优选地微生物。

在不受约束理论的情况下，可以优选地通过缺失或失活所述磷酸转移酶转运系统(PTS)的基因，对这种生物、优选地微生物进行基因修饰。

本领域已知相应的基因修饰。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用具有增强的非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的生物、优选地微生物以摄取糖。

在不受约束理论的情况下，可以优选地通过过量表达所述非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的基因，对这种生物、优选地微生物进行基因修饰以摄取糖。

本领域已知相应的基因修饰。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用具有削弱或失活的磷酸转移酶转运系统(PTS)和增强的非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的生物、优选地微生物以摄取糖。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗蔗糖的生物，优选地微生物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用能够消耗蔗糖的生物，优选地微生物，其中已经通过引入非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的至少一个基因对所述生物、优选地所述微生物进行基因修饰。在不受约束理论的情况下，已经通过引入选自来自大肠杆菌W的cscA、cscB和cscK的基因对这种生物和/或微生物进行基因修饰(M.Bruschi等人，Biotechnology Advances 30(2012)1001-1010)。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用这样的生物、优选地微生物，其已经过基因修饰以具有削弱或失活的磷酸转移酶转运系统(PTS)和至少一个选自galP、glk和glf的基因的过量表达。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用这样的生物、优选地微生物，其经过基因修饰以避免乙酰-CoA泄漏，因而增加乙酰-CoA的胞内浓度。本领域已知导致乙酰-CoA胞内浓度增加的基因修饰。在不受约束理论的情况下，可以优选地通过缺失或失活一个或多个以下基因，对这种生物、优选地微生物进行基因修饰：

ΔackA(乙酸激酶)、Δldh(乳酸脱氢酶)、ΔadhE(醇脱氢酶)、ΔfrdB和/或ΔfrdC(延胡索酸还原酶和延胡索酸酯脱氢酶)、ΔpoxB(丙酮酸氧化酶)、Δpgk(磷酸甘油酸激酶)、ΔiclR(DNA结合转录阻遏蛋白IclR)。

另外，在本发明上下文中可能有利的缺失是在编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因(例如大肠杆菌中的edd基因)中和/或在编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因(例如大肠杆菌中的eda基因)中的缺失。

备选地或除任何上述缺失外，可以通过以下方式对该生物或微生物进行基因修饰：过量表达编码泛酸激酶的基因panK/coaA，因而增加CoA/乙酰-CoA胞内汇集物。

这些避免乙酰-CoA泄漏的修饰是本领域已知的，并且相应的修饰的生物已经用于外源异戊醇由表达ATF2的大肠杆菌菌株生物转化成乙酸异戊酯的方法中(Metab.Eng.6(2004)，294-309)。

可以在生物或微生物中过量表达的其他基因包括以下：

○pckA(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)

○tktA(转酮醇酶1)

○tktB(转酮醇酶2)

○talA(转醛醇酶A)

○talB(转醛醇酶B)

○rpiA(核糖-5-磷酸异构酶A)

○rpiB(核糖-5-磷酸异构酶B)

○rpE(核酮糖-磷酸3-差向异构酶)

○pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)

○galP(半乳糖：H

○glk(葡萄糖激酶)

○glf(葡萄糖协助扩散蛋白)

○pta(磷酸酯乙酰转移酶)

重组微生物还可以进一步特征在于：它能够使乙酰-CoA转化成丙酮。用于提供这种重组微生物的方法例如在EP 2 295 593中公开。在本发明的上下文中，术语“能够使乙酰-CoA转化成丙酮”意指生物/微生物因存在下述酶而具有在细胞内部产生丙酮的能力，所述酶提供允许从乙酰-CoA产生丙酮的酶活性。

丙酮由某些微生物产生，如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、多粘芽胞杆菌(Bacillus polymyxa)和恶臭假单胞菌。在丙酮丁醇梭菌中最佳地表征丙酮的合成。它始于其中两分子乙酰-CoA缩合成乙酰乙酰-CoA的反应(反应步骤1)。该反应由乙酰-CoA乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)催化。随后通过其中乙酸或丁酸也导致乙酰-CoA或丁酰-CoA产生的反应(反应步骤2)，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸酯。该反应由例如乙酰乙酰CoA转移酶(EC 2.8.3.8)催化。乙酰乙酰CoA转移酶已知来自各种生物，例如来自其中该酶由atoAD基因编码的大肠杆菌或来自其中该酶由ctfAB基因编码的丙酮丁醇梭菌。然而，其他酶也可以催化这种反应，例如3-含氧酸CoA转移酶(EC 2.8.3.5)或琥珀酸CoA连接酶(EC 6.2.1.5)。

最后，乙酰乙酸酯通过乙酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.4)催化的脱羧步骤(反应步骤3)转化成丙酮。

上述反应步骤1和2和催化它们的酶不是丙酮合成特有的，并且可以存在于多种生物中。相反，由乙酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.4)催化的反应步骤3仅存在于能够产生丙酮的那些生物中。

在一个优选的实施方案中，该重组微生物是天然具有产生丙酮的能力的微生物。因此，优选地，该微生物属于梭菌属、芽孢杆菌属或假单胞菌属，更优选地属于以下物种：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽胞杆菌或恶臭假单胞菌。

在另一个优选实施方案中，该重组微生物是源自下述生物/微生物的微生物，所述生物/微生物天然地不产生丙酮，但是已经过基因修饰，从而产生丙酮，即，通过引入允许在微生物中产生丙酮所必需的基因。原则上，任何微生物可以按这种方式进行基因修饰。上文已经描述了负责合成丙酮的酶。编码相应酶的基因是本领域已知并且可以用来基因修饰给定的微生物，从而产生丙酮。如上文描述，丙酮合成的反应步骤1和2天然地存于大多数生物中。然而，反应步骤3是特征性的并且对于丙酮合成至关重要。因此，在优选的实施方案中，源自天然不产生丙酮的微生物的基因修饰微生物经修饰，从而含有编码酶(例如，乙酰乙酸酯脱羧酶(EC 4.1.1.4))的核苷酸序列，所述酶催化乙酰乙酸酯通过脱羧转化成丙酮。本领域已知来自编码这种酶的几种生物中的核苷酸序列，例如来自以下者的adc基因：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(Uniprot登录号P23670和P23673)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(梭菌属(Clostridium)MP；Q9RPK1)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)(Uniprot登录号P81336)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)(菌株BTAi1/ATCC BAA-1182；Uniprot登录号A5EBU7)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)(ATCC 10399 A9LBS0)、鼻疽伯克霍尔德菌(Uniprot登录号A3MAE3)、鼻疽伯克霍尔德菌FMH A5XJB2、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)(Uniprot登录号A0B471)、双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)(Uniprot登录号Q0b5P1)、Burkholderia phytofirmans(Uniprot登录号B2T319)、伯克霍尔德菌属物种(Burkholderia spec.)(Uniprot登录号Q38ZU0)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)(Uniprot登录号B2TLN8)、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)(Uniprot登录号B2UIG7)、黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)(Uniprot登录号Q9EYI7)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)(Uniprot登录号Q82NF4)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)(Uniprot登录号Q5ZXQ9)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)(Uniprot登录号Q1WVG5)、红球菌属物种(Rhodococcus spec)(Uniprot登录号Q0S7W4)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Uniprot登录号Q890G0)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(Uniprot登录号Q1M911)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Uniprot登录号Q03B66)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(Uniprot登录号Q0BLC9)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythreae)(Uniprot登录号A4FKR9)、Korarchaeumcryptofilum(Uniprot登录号B1L3N6)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacins)(Uniprot登录号A7Z8K8)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)(Uniprot登录号Q8NJQ3)、冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)(Uniprot登录号C3ML22)和土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种(Francisella tularensis subsp.holarctica)(菌株OSU18)。

更优选地，微生物经基因修饰，从而用编码酶的核酸分子转化，所述酶能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2，即乙酰乙酰CoA转化成乙酰乙酸酯。

甚至更优选地，微生物经基因修饰，从而用编码酶的核酸分子转化，所述酶能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1，即两分子乙酰基CoA缩合成乙酰乙酰CoA。

在一个特别优选的实施方案中，微生物经基因修饰，从而用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1的酶的核酸分子并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2的酶的核酸分子转化，或者用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1的酶的核酸分子并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤3的酶的核酸分子转化，或者用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2的酶的核酸分子并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤3的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤1的酶的核酸分子并且用编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤2的酶的核酸分子并且用编码编码能够催化上文提到的丙酮合成反应步骤3的酶的核酸分子转化。

本领域熟知用于制备上文提到的基因修饰微生物的方法。因而，通常，用允许相应酶在微生物中表达的DNA构建体转化该微生物。这种构建体在正常情况下包含与允许相应宿主细胞中转录和翻译的调节序列(例如启动子和/增强子和/或转录终止子和/或核糖体结合位点等)连接的所讨论编码序列。现有技术已经描述了已经过基因修饰从而能够产生丙酮的微生物。具体而言，已经将来自例如丙酮丁醇梭菌的基因引入大肠杆菌中，因而允许在大肠杆菌(天然不产生丙酮的细菌)中合成丙酮(Bermejo等人，Appl.Environ.Microbiol.64(1998)；1079-1085；Hanai等人，Appl.Environ.Microbiol.73(2007)，7814-7818)。具体而言，Hanai等人(见上述引文)显示引入编码乙酰乙酸酯脱羧酶(如来自丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸酯脱羧酶)的核酸序列足以在大肠杆菌中实现丙酮产生，表明大肠杆菌中催化上述反应步骤1和2(即，大肠杆菌atoB和atoAD基因的表达产物)的内源酶足以为丙酮产生提供底物。

在另一个方面，该重组微生物进一步特征在于：它能够使乙酰-CoA转化成丙酮并且使丙酮转化成异丁烯。例如以下文献中公开了用于提供这种重组微生物的方法：EP-A 2295 593(EP 09 17 0312)、WO 2011/032934、WO 2015/101493、WO 2014/086780、WO 2010/001078、WO 2012/052427、WO 2017/071124、WO 2015/004211、WO 2014/064198和WO 2014/086781。

在另一个方面，该重组微生物进一步特征在于，它能够使用不包含丙酮中间体的代谢途径，使乙酰-CoA转化成异丁烯。例如以下文献中公开了用于提供这种重组微生物的方法：WO2016042012、WO2017/085167、WO2018/206262、WO2013/186215、WO2016/034691、WO2017/191239、US2019/0100742、WO 2016/042011、WO 2017/162738、WO2015082447、WO2010/001078、WO 2012/052427、WO 2017/071124、WO 2015/004211、WO 2014/064198和WO2014/086781。

在另一个方面，该重组微生物特征在于：它能够使乙酰-CoA转化成丙酮并且使丙酮转化成丙烯。用于提供这种重组微生物的方法例如在Hanai等人，Appl.Environ.Microbiol.73(2007)，7814-7818中公开。

在另一个方面，该重组微生物特征在于：它能够使乙酰-CoA转化成丙酮并且使丙酮转化成异丙醇。

丙酮转化成异丙醇需要在NADPH-依赖性反应中使丙酮转化成异丙醇的仲醇脱氢酶(Chen，J.-S.，FEMS Microbiol.Rev.17：263-273(1995))。

因此，在另一个方面，该重组微生物特征在于：它能够通过(过量)表达仲醇脱氢酶，使丙酮转化成异丙醇。

为增加NADPH可用性，可以修饰转氢酶酶(如PntAB和UdhA(SthA))表达(Jan等人，Biotechnol Prog.29(5)：1124-30(2013))。

因此，在另一个方面，该重组微生物特征在于通过例如(过量)表达一种或多种转氢酶酶、优选地PntAB和UdhA(SthA)，增加NADPH的可用性。

在一个优选的实施方案中，构思实现进一步基因缺失以增加丙酮产生并因此增加异丙醇产生。这种情况下，例如缺失一个或多个、优选地全部以下基因可能有利：fsaA(编码果糖-6-磷酸醛缩酶1)和fsaB(编码果糖-6-磷酸醛缩酶2)。

优选地，为了进一步增加异丙醇产生，可以被修饰以过量表达的其他基因是pntAB(吡啶核苷酸转氢酶亚基α和β，Uniprot P07001和P0AB67，NCBI参考序列：NP_416120.1和NP_416119.1)基因，其优选地来自大肠杆菌。

在一个更优选的实施方案中，生物或微生物特征在于，它过量表达以下一个或多个基因以使乙酰-CoA转化成丙酮和/或异丙醇：

○对于上文步骤1：thlA(乙酰-CoA转移酶；NCBI参考号WP_010966157.1；UniProt登录号P45359)；优选地来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobulyticum)的thlA基因

○对于上文步骤2：atoD、atoA(乙酸酯CoA-转移酶；NCBI参考号NP_416725.1和NP_416726.1；UniProt登录号P76458和P76459，分别地)；优选地来自大肠杆菌的atoD、atoA基因

○对于上文步骤3：adc(乙酰乙酸酯脱羧酶；NCBI参考号NP_149328.1；UniProt登录号P23670)；优选地来自丙酮丁醇梭菌的adc基因

○对于步骤4：adh(NADP-依赖性异丙醇脱氢酶；NCBI参考号AF_157307.2；UniProt登录号P25984)；优选地来自拜氏梭菌的adh基因。

本领域技术人员将认识到，进一步对本发明微生物的基因修饰可能导致改善本发明的微生物使原料籍此转化成产物的功效。例如，天然微生物常产生产物如甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、乙醇、丙三醇、2，3-丁二醇、甲基乙二醛和氢；它们均将损害从糖产生例如丙酮、异丁烯或丙烯。消除或大幅度减少这类不想要的副产物可以由消除或减少导致它们的生产的关键酶活性实现。这类活性包括但不限于由以下组成的组：

-乙酰-CoA+甲酸盐＝CoA+丙酮酸(例如，由甲酸C-乙酰转移酶催化，也称作丙酮酸甲酸-裂合酶(EC 2.3.1.54)；对于大肠杆菌-pflB，NCBI-GeneID：945514)；

-ATP+乙酸盐＝ADP+乙酰磷酸(例如，由乙酸盐激酶(EC 2.7.2.1)催化；对于大肠杆菌-ackA，NCBI-GeneID：946775)；

-(R)-乳酸盐+NAD

-琥珀酸酯+接纳体＝延胡索酸酯+还原型接纳体(例如，由琥珀酸酯脱氢酶(EC1.3.99.1)催化；对于大肠杆菌-包含frdA和frdB，NCBI-GeneID分别为：948667和948666)；

-2-氧代羧化物(例如丙酮酸)＝醛(例如乙醛+CO

-乙醛+CoA+NAD

-sn-丙三醇3-磷酸+NAD(P)

-2丙酮酸＝2-乙酰乳酸+CO

-磷酸甘油酮＝甲基乙二醛+磷酸根(例如，由甲基乙二醛合酶(EC 4.2.3.3)催化；对于大肠杆菌-mgsA，NCBI-GeneID：945574)；和

-甲酸+H

因而，在一个优选实施方案中，该微生物可以进一步特征在于消除或减少上文所列的一种或多种酶活性。

本领域技术人员还将认识到，对本发明微生物中调节元件的基因修饰可能导致改善本发明的微生物使原料籍次转化成产物的功效。在大肠杆菌内部，这类基因修饰包括但不限于，由以下组成的组：

-缺失fnr基因(NCBI-GeneID：945908)，厌氧生长的总体调节物；和

-缺失rpoS基因(NCBI-GeneID：947210)，RNA聚合酶，sigma S(sigma 38)因子；和

-缺失iclR基因(DNA结合转录阻遏蛋白IclR)。

因而，在另一个优选实施方案中，该微生物显示这些缺失中至少一者。

因此，如上文所述，本发明的方法可以在如上文所述的可以用于使葡萄糖转化成乙酰-CoA的重组微生物中实施。乙酰基CoA(也称作乙酰辅酶A)在化学结构上是辅酶A(巯基)和乙酸之间的硫酯并且是产生有用代谢物的重要前体分子。乙酰-CoA随后可以由该重组微生物进一步转化成有用代谢物如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸盐和聚羟丁酸酯。

该重组微生物也可以用于使乙酰-CoA转化成丙酮。

该重组微生物也可以用于使乙酰-CoA转化成异丁烯。

该重组微生物也可以用于使乙酰-CoA转化成丙烯。

该重组微生物也可以用于使乙酰-CoA转化成异丙醇。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供生物，优选地携带相应酶活性或(细胞)培养物形式、优选液态细胞培养物形式的微生物，后续步骤是在发酵罐(经常也称作生物反应器)中允许相应酶表达的合适条件下培育所述生物，优选地微生物，并且还包括步骤：实现如本文上述的本发明方法的酶促转化。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵罐指支持生物学活性环境的本领域已知的任何制造或工程化装置或系统。因此，生物反应器或发酵罐可以是其中实施化学/生物化学过程(如本发明方法)的容器，所述化学/生物化学过程涉及生物、优选地微生物和/或生物化学活性物质，即，从携带上述酶的这类生物或生物衍生的上述酶。在生物反应器或发酵罐中，这种过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器常见是圆柱状，并且可以具有从数升至若干立方米的一系列尺寸，并经常由不锈钢制成。在这个方面，不受理论约束，发酵罐或生物反应器可以按照这样的方式设计，从而它适合以分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养(chemostate-culture)培养生物，优选地微生物，全部培养方法通常均是本领域已知的。

培养基可以是适于培养相应生物或微生物的任何培养基。

通过利用微生物实施时，本发明的方法可以例如设计为连续发酵培养法或设计为分批培养或本领域技术人员已知的任何合适培养法。

本发明也涉及从葡萄糖或其他上文所提到碳源中任意者产生丙酮和/或异丁烯和/或丙烯的方法，其中在允许产生丙酮和/或异丁烯和/或丙烯的条件下培育上述重组微生物并且其中分离丙酮和/或异丁烯和/或丙烯。微生物在允许酶促反应发生的合适培养条件下培育。特定培养条件取决于所用的特定微生物，但是为本领域技术人员熟知。通常以如此方式选择培养条件，从而它们允许编码用于相应反应的酶的基因的表达。多种方法是本领域技术人员已知的，以便在某些培养阶段改进并精细调节某些基因的表达，如通过化学诱导物或通过温度变动诱导基因表达。

在另一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤：采集气态产物，特别地异丁烯或丙烯，从反应中脱气，即回收例如从培养物中脱气的产物。因此在优选的实施方式中，在反应期间采集气体形式的异丁烯或丙烯的系统存在下实施该方法。

作为事实，短链烯如异丁烯和丙烯在室温和常压采取气态。本发明的方法因此不需要从液体培养基提取产物，一个以工业规模进行时总是非常昂贵的步骤。可以根据本领域技术人员已知的何方法进行气体烃的抽空和储存和它们可能的后续物理分离和化学转化。

本发明方法中使用的酶可以是天然存在的酶或是这样的酶，所述酶可以(例如通过引入例如改变或改善酶活性、稳定性等的突变或其他改变)从天然存在的酶衍生。

用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员熟知的并且包括，例如随机诱变或位点定向诱变并随后选择具有所需特性的酶，或所谓“定向进化”方案。

例如，对于原核细胞中的基因修饰，可以将编码相应酶的核酸分子引入质粒，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能插入，缺失或置换的那些些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。随后用如上文所述的测定法，对所产生的酶变体测试所需的活性，例如，酶活性，并且特别是它们增加的酶活性。

如上文所述，本发明方法中所用或本发明组合物中所含的微生物可以是已经通过引入编码相应酶的核酸分子进行基因修饰的微生物。因此，在优选的实施方案中，微生物是这样的重组微生物，所述重组微生物已经过基因修饰以具有上述用于本发明方法转化的至少一种酶的增加的活性。这可以例如通过用编码相应酶的核酸转化该微生物来实现。优选地，引入微生物中的核酸分子是相对于微生物是异源的核酸分子，即，它不天然地存在于所述微生物中。

在本发明的上下文中，“增加的活性”优选意指基因修饰的微生物中酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中高至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％或50％、甚至更优选地至少70％或80％并且特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以是至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，表达比相应未修饰的微生物中高至少10倍、更优选地至少100倍和甚至更优选至少1000倍。

术语“增加的”表达/活性也涵盖如下情况，其中相应未修饰的微生物不表达相应的酶，从而未修饰的微生物中的相应表达/活性是零。优选地，过量表达的酶的浓度是总宿主细胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。

用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应蛋白质的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括蛋白质印迹法、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如Northern印迹。

在本发明的上下文中，术语“重组”意指微生物经基因修饰，从而与野生型或未修饰的微生物相比，含有编码如上文定义的酶的核酸分子。编码如上文定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的部分使用。

所述核酸分子还可以包含与包含于该核酸分子中的多核苷酸有效连接的表达控制序列。如本说明书自始至终使用，术语“有效连接的”或“有效连接”指在一个或多个表达控制序列和待表达的多核苷酸中编码区之间以如此方式连接，从而在与表达控制序列相容的条件下实现表达。

表达包括异源DNA序列的转录，优选地，转录成可翻译的mRNA。确保在真菌中以及在细菌中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们涵盖启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。在下文与相关载体相联系解释时进一步给出实例。

相对于其来源和/或相对于待表达的基因，关于核酸分子使用的启动子可以是同源或异源的。合适的启动子是例如自身导致组成型表达的启动子。然而，也可以使用仅在由外部影响所决定的时间点激活的启动子。在这种情况下，可以使用人工和/或化学诱导型启动子。

所述载体还可以包含与包含于该载体中的所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。这些表达控制序列可以适用于确保可翻译性RNA在细菌或真菌中的转录和合成。

此外，可以通过分子生物学中常规的方法将不同突变插入多核苷酸(见例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，ColdSpring Harbor，NY，USA)，导致合成可能具有修饰的生物学特性的多肽。可构思在氨基酸序列修饰例如影响多肽生物学活性或其调节作用的位置引入点突变。

另外，可以制备拥有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，这类突变体显示增加的活性。可选地，可以制备在不丧失底物结合活性的情况下消除其催化活性的突变体。

另外，将突变引入编码如上文定义的酶的多核苷酸中允许增加或减少所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性。

为了遗传地修饰细菌或真菌，可以将编码如上文定义的酶的多核苷酸或这些分子的部分引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，ColdSpring Harbor，NY，USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用针对片段的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能插入，缺失或置换的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。

因而，根据本发明，重组微生物可以通过遗传修饰真菌或细菌来产生，包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体引入真菌或细菌中。

表达编码相应酶的多核苷酸，从而以导致具有上文描述的任一种活性的多肽产生。不同表达系统的综述例如在Methods in Enzymology 153(1987)，385-516中，Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987)，516-544)并含于Sawers等人，(AppliedMicrobiology and Biotechnology 46(1996)，1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinionin Biotechnology 7(1996)，500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，456-463)、Griffiths等人，(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)中。酵母表达系统的综述例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994)，13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992)，79-93)、Fleer(Current Opinion inBiotechnology 3(1992)，486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)给出。

已经在文献中广泛描述表达载体。通常，它们不仅含有选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，还含有细菌启动子或病毒启动子，和在大多数情况下转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常存至少一个使得插入编码性DNA序列成为可能的限制性位点或多接头。如果在选择的宿主生物中有活性，则天然控制相应基因的转录的DNA序列可以用作启动子序列。然而，这种序列也可以交换为其他启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许人为控制基因表达的诱导型启动子。文献中详述了拥有这些特性的细菌启动子和病毒启动子序列。文献中充分描述了用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列。允许特别高地表达下游序列的启动子例如是T7启动子(Studier等人，Methods in Enzymology 185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人，引自Rodriguez和Chamberlin(编著)，Promoters，Structure and Function；Praeger，NewYork，(1982)，462-481；DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、lp1、rac(Boros等人，Gene 42(1986)，97-100)。诱导型启动子优选地用于多肽的合成。这些启动子经常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳多肽量，经常使用一种两阶段方法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养直至相对高的细胞密度。在第二步骤中，根据使用的启动子的类型诱导转录。在这个方面，tac启动子是特别合适的，所述tac启动子可以由乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导(deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)，21-25)。文献中也描述了转录的终止信号。

可以通过例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA；Methods in Yeast Genetics，ALaboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990中描述的标准方法，用如上所述的多核苷酸或载体实施宿主细胞的转化。宿主细胞在满足所用具体宿主细胞要求(尤其在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面)的营养培养基中培养。

本发明另外涉及已经用以下核苷酸序列转化的重组微生物

(a)编码磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)的核苷酸序列；和

(b)编码酶的核苷酸序列，所述酶选自

(i)醛裂解酶(EC 4.1.2.-)；和/或

(ii)转醛酶(EC 2.2.1.2)。

在一个优选的实施方案中，由相应核苷酸序列编码的磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)相对于微生物为异源，这意指它并不天然地出现在这种微生物中。更优选地，编码的酶源自另一种微生物，尤其来自不同属或不同物种的微生物。在另一个实施方案中，酶是人造的，在于它在自然界中不存在。这包括已经通过诱变方案或基因工程法制备的改进的酶变体。

在另一个优选的实施方案中，由相应核苷酸序列编码的醛裂解酶(EC 4.1.2.-)或转醛酶(EC 2.2.1.2)相对于微生物为异源，这意指它并不天然地出现在这种微生物中。更优选地，编码的酶源自另一种微生物，尤其来自不同属或不同物种的微生物。在另一个实施方案中，酶是人造的，在于它在自然界中不存在。这包括已经通过诱变方案或基因工程法制备的改进的酶变体。

在一个特别优选的实施方案中，上文(a)和(b)中均提到的酶相对于微生物为异源。

本发明还涉及本发明的这种微生物的用途，用于首先通过(a)中提到的酶，使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)，并且随后通过(b)中提到的酶，进一步使产生的二羟丙酮(DHA)连同甘油醛-3-磷酸(G3P)一起转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

本发明另外涉及已经用以下核苷酸序列转化的重组微生物

(a)编码磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)的核苷酸序列；和

(b)编码果糖二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的核苷酸序列；

其中所述微生物还拥有葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)活性或磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)活性。

在一个优选的实施方案中，由相应核苷酸序列编码的磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)相对于微生物为异源，这意指它并不天然地出现在这种微生物中。更优选地，编码的酶源自另一种微生物，尤其来自不同属或不同物种的微生物。在另一个实施方案中，酶是人造的，在于它在自然界中不存在。这包括已经通过诱变方案或基因工程法制备的改进的酶变体。

在另一个优选的实施方案中，由相应核苷酸序列编码的果糖二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)相对于微生物为异源，这意指它并不天然地出现在这种微生物中。更优选地，编码的酶源自另一种微生物，尤其来自不同属或不同物种的微生物。在另一个实施方案中，酶是人造的，在于它在自然界中不存在。这包括已经通过诱变方案或基因工程法制备的改进的酶变体。

在一个特别优选的实施方案中，上文(a)和(b)中均提到的酶相对于微生物为异源。

在又一个优选的实施方案中，这种微生物已经用以下核苷酸序列进一步转化

(c)编码酶的核苷酸序列，所述酶选自：

(i)葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)；或

(ii)磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)。

在一个优选的实施方案中，由相应核苷酸序列编码的葡萄糖磷酸变位酶(EC5.4.2.2)或磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)相对于微生物为异源，这意指它并不天然地出现在这种微生物中。更优选地，编码的酶源自另一种微生物，尤其来自不同属或不同物种的微生物。在另一个实施方案中，酶是人造的，在于它在自然界中不存在。这包括已经通过诱变方案或基因工程法制备的改进的酶变体。

在一个特别优选的实施方案中，上文(a)、(b)和(c)中提到的全部三种酶相对于微生物为异源。

本发明还涉及本发明的这种微生物的用途，用于首先通过(a)中提到的酶，使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛，并且随后通过(b)中提到的酶，进一步使产生的甘油醛连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起转化成果糖-1-磷酸(F1P)，并且随后通过(c)中提到的酶，进一步使产生的果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

本发明的重组微生物还可以显示一个或多个如上文对其中可以实施本发明方法的微生物所述的特征。

因此，在优选的实施方案中，微生物是重组微生物，所述重组微生已经用以下核苷酸序列转化

(a)编码磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)的核苷酸序列；和

(b)编码酶的核苷酸序列，所述酶选自

(i)醛裂解酶(EC 4.1.2.-)；和/或

(ii)转醛酶(EC 2.2.1.2)；

和/或

已经用以下核苷酸序列转化

(a)编码磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)的核苷酸序列；和

(b)编码果糖二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的核苷酸序列；

其中所述微生物还拥有葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)或磷酸甘露糖变位酶(EC5.4.2.8)活性

并且其进一步特征在于它：

a)具有磷酸转酮酶活性；

b)(i)因失活编码磷酸果糖激酶的基因或因与未修饰的微生物相比减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Pamas途径(EMPP)；或

(ii)没有磷酸果糖激酶活性；

和

c)(i)因失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或因基与未修饰的微生物相比减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的磷酸戊糖途径氧化支路(PPP)；或

(ii)没有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。

对于可以由微生物表达的酶和优选的实施方案而言，如上文已经与本发明方法和本发明微生物相关时所描述那样同样适用。

本发明另外涉及酶组合，所述酶组合包含

(a)磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)；和

(b)选自以下的酶

(i)醛裂解酶(EC 4.1.2.-)；和/或

(ii)转醛酶(EC 2.2.1.2)。

本发明另外涉及酶组合，所述酶组合包含

(a)磷单酯水解酶(EC 3.1.3.-)；和

(b)果糖二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)；和

(c)选自以下的酶

(i)葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)；或

(ii)磷酸甘露糖变位酶(EC 5.4.2.8)。

本发明还涉及一种组合物，其包含本发明的微生物或本发明的酶组合。

本发明另外涉及本发明的酶组合或微生物或组合物的用途，用于如上所述首先通过(a)中提到的酶，使磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成二羟丙酮(DHA)，并且随后通过(b)中提到的酶，进一步使产生的二羟丙酮(DHA)连同甘油醛-3-磷酸(G3P)一起转化成果糖-6-磷酸(F6P)，或用于如上所述首先通过(a)中提到的酶，使甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成甘油醛，并且随后通过(b)中提到的酶，进一步使产生的甘油醛连同磷酸二羟丙酮(DHAP)一起转化转化成果糖-1-磷酸(F1P)，并且随后通过(c)中提到的酶，进一步使产生的果糖-1-磷酸(F1P)转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

对于上文中所列举的酶和微生物而言，如上文已经与本发明方法相关时所描述那样同样适用，尤其就优选的实施方案而言。

图1显示AMP浓度对果糖二磷酸酶活性的影响。

图2显示AMP浓度对FsaA129S的影响。

图3显示过量表达负责使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的酶的菌株(GBI 17553，实线)及未过量表达负责使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成果糖-6-磷酸的酶的菌株(GBI 15847，点线)的丙酮和异丙醇比生产率。

在本说明书中，引用了包含专利申请的众多文件。这些文献的公开内容，尽管不认为与本发明可专利性相关，通过引用的方式完整并入在此。更具体地，参考的全部文献通过引用的方式以相同的程度并入，如同专门且个别地指出通过引用的方式并入每份单独的文献。

现在将参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅是示意性的并且不得解释为限制本发明的范围。

实施例

一般方法和材料

本领域熟知连接方法和转化方法。可以在Sambrook J.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，和Sambrook J.，上文中找到适用于以下实施例中的技术。

本领域熟知适于维持及培育细菌培养物的材料和方法。可以在Manual ofMethods for General Bacteriology(Philipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Philips编著)中找到适用于以下实施例中的技术。

除非另外说明，否则用于细菌细胞生长和维持的全部试剂和材料均从Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)获得。

a)来自大肠杆菌的酶

已经使用来自ASKA保藏中心的质粒(Kitagawa，M等人DNA Res.12：291-299(2005))过量表达来自大肠杆菌的酶。

在LB培养基中培育菌株BL21(DE3)细胞(Novagen)并且使其变成电感受态。将电感受态BL21细胞用表达所需酶的相应质粒(参见表1)转化，并且随后铺种在含有氯霉素(25ug/ml)的LB平板上。将平板在30℃温育过夜。

使用ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW，Prot.Exp.Pur.41：207-234(2005))，将转化的细胞在30℃培育20小时，伴以振摇(160转/分钟)。通过4℃，4,000转/分钟离心20分钟收集细胞并且在-80℃储存沉淀物。

使用His trap(Protino Ni-IDA 1000试剂盒，Macherey Nagel)纯化重组蛋白后，在蛋白质凝胶上检验重组酶的表达。根据制造商的推荐进行纯化。

b)来自大肠杆菌以外其他生物的酶

为了大肠杆菌中最佳表达，由

根据标准的热休克方法，用这些载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。使用ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW，Prot.Exp.Pur.41：207-234(2005))，将转化的细胞在30℃培育20小时，伴以振摇(160转/分钟)。通过4℃，4,000转/分钟离心20分钟收集细胞并且在-80℃储存沉淀物。

使用His trap(Protino Ni-IDA 1000试剂盒，Macherey Nagel)纯化重组蛋白后，在蛋白质凝胶上检验重组酶的表达。根据制造商的推荐进行纯化。

实施例1：果糖-6-磷酸醛缩酶和果糖二磷酸

实施一系列测试以确定AMP是否对果糖-6-磷酸醛缩酶和/或果糖二磷酸酶的酶活性具有抑制作用。用来测试酶活性的方法改编自C.Guérard-Hélaine，V.De Berardinis，M.Besnard-Gonnet，E.Darii，M.Debacker等人，Genome Mining for InnovativeBiocatalysts：New Dihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox.ChemCatChem，Wiley，7：1871-1879(2015)。

a)

120μl的每个动力学测定体系含有Tris HCl缓冲液(50mM；pH 7.5)、20mM NaCl、10mM MgCl

b)

120μl的每个动力学测定体系含有Tris HCl缓冲液(50mM；pH 8.5)、1mM NADP

将混合物在30℃温育最多到20分钟，并且假定每个果糖-6-磷酸分子生成1个还原的NADPH分子，通过分光光度法在340nm监测反应(测量NADPH形成)。图2中显示结果。不能观察到伴随FSAA A129S的AMP抑制作用。

实施例2：在体外使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHAP)经二羟丙酮(DHA)中间体转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

实施一系列测试以确定使G3P和DHAP转化成F6P的最佳酶组合。这些酶组合应当执行2个步骤：

1)DHAP→DHA

2)DHA+G3P→F6P

a)

用来测试酶活性的方法改编自C.Guérard-Hélaine，V.De Berardinis，M.Besnard-Gonnet，E.Darii，M.Debacker等人，Genome Mining for InnovativeBiocatalysts：New Dihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox.ChemCatChem，Wiley，7：1871-1879(2015)。

120μl的每个动力学测定体系含有Tris HCl缓冲液(50mM；pH 8.5)、3mM D，L-G3P、200mM DHA、1mM NADP

表3：用不同酶从DHA和G3P产生F6P

a)

用来测试酶活性的方法改编自C.Guérard-Hélaine，V.De Berardinis，M.Besnard-Gonnet，E.Darii，M.Debacker等人，Genome Mining for InnovativeBiocatalysts：New Dihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox.ChemCatChem，Wiley，7：1871-1879(2015)。

120μl的每个动力学测定体系含有Tris HCl缓冲液(50mM；pH 8.5)、10mM MgCl

表4：用不同酶从DHAP产生DHA

实施例3：在体外使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHAP)经甘油醛中间体转化成果糖-6-磷酸(F6P)。

实施一系列测定以确定使G3P和DHAP转化成F6P的最佳酶组合。最佳酶组合应当执行3个步骤：

1)G3P→甘油醛

2)甘油醛+DHAP→F1P

3)F1P→F6P

a)

200μl的每个动力学测定体系含有Tris HCl缓冲液(50mM pH 7.5)、100mM NaCl、10mM MgCl

表5：催化G3P转化成甘油醛的酶。

a)

200μl的每个动力学测定体系含有Tris HCl缓冲液(50mM；pH 7.5)、50mM NaCl、5mM MgCl

表6：催化甘油醛和DHAP转化成F1P并进一步催化F1P转化成F6P的酶。将ALDOB编码的酶连同pgm编码的酶(测定法1)、连同AHA_2903编码的酶(测定法2)或连同这两者(测定法3)一起温育。

实施例4：构建产生丙酮和异丙醇的新大肠杆菌原型

类似于大多数生物，大肠杆菌使葡萄糖转化成乙酰-CoA。先前已经描述其中优化了乙酰-CoA产生产率的修饰的大肠杆菌原型(WO 2013/007786)。构建了具有以下基因型的细菌原型，

MG1655ΔptsHIΔzwf_edd_edaΔpfkAΔpfkB

为了构建具有PKT途径并且能够依赖蔗糖作为碳源稳健生长的菌株，将

将PKT基因在kdgk基因座(kdgK：：P1_RBST7_pkt)引入

MG1655ΔptsHIΔzwf_edd_edaΔpfkAΔpfkB kdgK：：P1_RBST7_pkt

将这个菌株在补充葡萄糖作为碳源的极限培养基上传代几个月，同时针对具有最高生长速率的克隆或群体连续选择，直至实现加倍时间小于5小时。

进行几个基因缺失以增加丙酮和异丙醇产生：ΔhemAΔfsaAΔfsaB。

为了进一步增加异丙醇产生，通过在pntAB基因座插入组成型强启动子过量表达来自大肠杆菌的pntAB(吡啶核苷酸转氢酶亚基α和β，Uniprot P07001和P0AB67，NCBI参考序列：NP_416120.1和NP_416119.1)基因。

所得的菌株此后称作

实施例5：构建从乙酰-CoA产生丙酮和异丙醇的大肠杆菌菌株

这个工作实施例显示通过重组大肠杆菌菌株产生丙酮和异丙醇，所述菌株表达构成丙酮和异丙醇途径的基因。

表7中列出在这项研究中用来使乙酰-CoA转化成丙酮和异丙醇的酶。

表7：催化乙酰-CoA转化成丙酮和异丙醇的酶

大肠杆菌中丙酮/异丙醇生物合成途径的表达。

使用实施例4中所述的

将全部所列基因进行密码子优化用于大肠杆菌中表达，并且由

含有复制起点pSC和壮观霉素抗性标志物的表达载体用于表达基因thlA、atoD、atoA、adc和adh。构建的载体命名为pGB5344。

大肠杆菌中表达负责使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的酶。

含有修饰的多克隆位点(pUC18 MCS)(WO 2013/007786)和氨苄青霉素耐药基因(质粒pGB 271)的修饰形式的pUC18(New England Biolabs)用于过量表达表8中列出的基因。

表8：催化DHAP和G3P转化成F6P的酶。

通过电穿孔，将质粒的不同组合转化入

表9：为使葡萄糖体内转化成丙酮+异丙醇所生成的菌株。

实施例6：大肠杆菌菌株生长和从乙酰-CoA产生丙酮/异丙醇

预培养条件

随后将转化的细胞铺种在供以氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(100μg/ml)的LB平板上。将平板在30℃温育2天。将分离的菌落用来接种补充有氨苄青霉素和壮观霉素的LB培养基。这些预培养物在30℃培育以实现光密度0.6。

生长条件：

在有pH和温度控制的1升生物反应器(Multifors 2，Infors HT)中进行发酵。使用预培养物的细胞接种补充有氨苄青霉素(100μg/ml)、壮观霉素(100μg/ml)、硫胺素(0.6mM)、葡萄糖(1g/l)和甘油(5g/L)的500ml发酵培养基(表10)，以实现0.05的初始光密度(OD

表10.发酵培养基组合物(衍生自ZYM-5052培养基(Studier FW，Prot.Exp.Pur.41，(2005)，207-234))。

丙酮/异丙醇生产阶段

在这个阶段期间，维持温度T＝34℃，pH 6.5和pO

使用配备火焰离子化检测器(FID)以测量丙酮和异丙醇的气相色谱7890A(Agilent Technology)，连续地分析菌株的丙酮/异丙醇产生。在Hi-Plex H USP L17，100x7.7mm(Agilent)，使用Agilent 1260 InfinityII色谱仪色谱分离挥发性有机化合物。使用标准品(Sigma)，对丙酮/异丙醇定量。

图3显示在表达负责使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHA)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的酶的生产菌株或作为对照不表达负责使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHA)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的酶的菌株的观测丙酮和异丙醇比生产率之间的比较。

当过量表达负责使甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成果糖-6-磷酸(F6P)的酶(菌株GBI 17553)时，与菌株GBI 15847相比，丙酮和异丙醇比生产率(每单位时间每单位细胞重量产生的摩尔数)更高。