一种基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗，由strep tag、ZZ domain、GGGGS linker和APEX2四个部分组成。本发明通过ZZ domain和过氧化物酶APEX2的融合表达，分别取代传统HRP耦连二抗的免疫球蛋白和HRP部分，构建一种新型二抗，该抗体的分子较小，容易进出细胞，不易形成包涵体，且经过优化，所述抗体具有较强的稳定性，不易降解。本发明的制备方法摆脱了传统HRP耦连二抗制备需要从植物提取HRP的复杂过程，也避免了实验动物的大量使用。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗及其制备方法和应用。

背景技术

在医学和生命科学研究中，许多检测实验都需要利用以过氧化物酶催动的生物化学反应，例如Western blotting、IHC、ELISA等。HRP耦连二抗是一种十分常用的检测试剂，通过将辣根植株分离的HRP和动物来源的免疫球蛋白进行化学耦连制备而成。HRP耦连二抗的免疫球蛋白部分可以特异性结合抗原，而HRP是过氧化物酶，可以催化底物生成有色产物或发光，从而实现目标抗原的定量和定性分析。

HRP耦连二抗的分子量较大(免疫球蛋白约为150kDa，HRP为40kDa)不利于穿透进入细胞内部。此外，HRP需要从辣根中分离纯化，工艺复杂；而免疫球蛋白则需要用抗原多次免疫动物后获得，实验周期长而且需要使用大量实验动物。HRP的过氧化酶活性依赖二硫键，由于胞质的还原环境，原核表达HRP常形成无活性的包涵体，所以现在都是直接从植物中提取。目前解决富含二硫键蛋白原核表达无活性的策略主要是加入信号肽，让蛋白分泌到氧化型环境的周质，但是此方法所得的蛋白产量将大大降低。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗抗体，其中主要包含两个主题结构：ZZ domain和过氧化物酶APEX2。本发明的二抗抗体分子量较小，稳定性较高。

本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：

一种基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗，包括由strep tag、ZZdomain、GGGGS linker和APEX2四个组成部分。

优选地，所述zz domain用于结合IgG抗体，所述APEX2行使报告基团的功能，所述二抗的氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

葡萄球菌包含5个高度同源的IgG结合结构域，分别为E、D、A、B和Cdomain，而ZZdomain是两个经过亲和力优化的串联B domain序列，对IgG有较强亲和力。APEX2来源于经过序列优化的豌豆和大豆过氧化物酶，由于缺乏二硫键和钙离子结合位点，可以在还原性细胞质中催化反应。经过本发明对所述二抗的优化，提高了本发明基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗的稳定性，其能在室温下48h以及-20℃下2个月还能具有一定的活性。

优选地，所述编辑如SEQ NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQNO：2。

本发明还提供一种制备所述二抗的方法，包括以下步骤：

S1获得组分部分的基因片段：通过化学合成的方式合成strep tag、ZZdomain、GGGGS linker和APEX2四个组成部分的核苷酸片段；

S2构建表达质粒：将S1的片段通过同源重组的方式连在pRseta载体上；

S3转化克隆：将步骤S2的质粒转化克隆宿主菌，进行原核表达培养；

S4诱导表达：从步骤S3中的宿主菌中提取质粒转化表达宿主菌，待宿主菌培养至对数期时加入诱导剂进行诱导；

S5纯化目的蛋白：收集培养液，超声破碎菌体，离心收集上清液，采用strep-Tactin XT纯化柱对上清液进行纯化。

优选地，所述步骤S1四个组成部分的核苷酸片段序列如SEQID NO:2所示。

优选地，所述步骤S2构建的表达质粒载体的序列如SEQID NO:3所示。

优选地，所述步骤S4诱导剂进行诱导的温度为25～37℃。更优选地，所述诱导的温度为25℃。本发明人针对诱导进行了优化实验，实验结果表明在25℃进行诱导，其表达的蛋白含量最高。

优选地，所述步骤S5纯化使用的洗脱液为：100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，50mM biotin，pH 8.0。

本发明还提供了所述基于zz domain与过氧化物酶APEX2的二抗在免疫检测中的应用。

本发明的有益效果为：本发明通过ZZ domain和过氧化物酶APEX2的融合表达，分别取代传统HRP耦连二抗的免疫球蛋白和HRP部分，构建一种新型二抗，该抗体的分子较小，容易进出细胞，不易形成包涵体，且经过优化所述抗体具有较强的稳定性，不易降解。本发明的制备方法摆脱了传统HRP耦连二抗制备需要从植物提取HRP的复杂过程，也避免了实验动物的大量使用。

附图说明

附图1为重组蛋白ZZ-APEX2的结构示意图，其中包含strep tag、ZZ domain、GGGGSlinker和APEX2四个组成部分。

附图2为ZZ-APEX2重组蛋白的表达优化结果示意图。(A)所述重组蛋白在原核表达情况示意图(上图)和用strep tag标签抗体进行Western blotting检测结果示意图(下图)；(B)表达温度的优化测试：Sup为离心后的上清，表示可溶蛋白，pre是离心后的沉淀，表示不溶的包涵体蛋白。

附图3为ZZ-APEX2的纯化和浓度测定结果示意图。(A)经过6倍柱床体积的洗涤可以获得纯度较高的蛋白。Lysate和flow through分别是上柱前后的流穿；W3-W6分别是不同洗涤次数的流穿；E1-E3分别是0.6、1.6、0.8倍柱床体积的Buffer BXT(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，50mM biotin，pH 8.0)洗脱的蛋白液。(B)以BSA为标准品，通过SDS-PAGE测定ZZ-APEX2的浓度。Marker按分子量从大到小分别为170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa。

附图4为过氧化物酶活性检测和Western blotting结果示意图。(A)3ngZZ-APEX2和ECL发光液混合后滴在纸片上进行化学发光检测，结果显示ZZ-APEX2具有催化ECL底物发光的良好特性。(B)鼠源抗GAPDH IgG孵育NC膜后剪成三份，分别为孵育羊抗鼠IgG-HRP二抗(1μg/ml)、终浓度分别为1μg/ml和2μg/ml的ZZ-APEX2，然后进行常规ECL检测。ZZ-APEX2实验组孵育后用PBS漂洗2次，每次1分钟；羊抗鼠IgG-HRP二抗用PBST(含0.5％tween 20)漂洗4次，每次10分钟。结果显示，ZZ-APEX2可以有效的结合鼠源IgG，并催化发光反应，而且无需常规步骤里的多次重复的剧烈漂洗过程(加入去污剂)，节约试剂成本和时间。

附图5为ZZ-APEX2稳定性测定结果示意图。

附图6为愈创木酚比色法测定ZZ-APEX2的过氧化氢酶活性示意图。(A、B)愈创木酚氧化的动力学曲线，愈创木酚浓度分别为1mM(A)和2mM(B)；(C)酶促动力学的Lineweaver-Burk作图；(D)酶促反应的转化数(Kcat)示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了地展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1构建ZZ-APEX2蛋白

1.质粒构建、蛋白表达和纯化

1.1材料

原核表达载体pRseta、大肠杆菌菌株E coli.DH5α、表达菌BL21、高效无缝克隆试剂盒(莫纳生物，MC40101)、质粒提取试剂盒(Omega)、Strep-TactinXT starter Kit(IBA)。其他试剂：LB培养基、氨苄青霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、PBS缓冲液(pH＝7.4)、甘油。

1.2表达质粒的构建

重组蛋白ZZ-APEX2的结构如图1所示，其包含strep tag、ZZ domain、GGGGSlinker和APEX2四个组成部分，其氨基酸序列如SEQ NO：1所示，核苷酸序列如SEQ NO：2所示。基因序列通过化学合成，然后通过同源重组的方式连在pRseta载体上，并转化大肠杆菌E coli.DH5α。pRseta使用的酶切位点为XbaI和EcoRI。克隆引物为5’-CCACAACGGTTTCCCTAATAATTTTGTTTAACTTTAAG-3’和5’-GCCGGATCAAGCTTCGTTAGGCATCAGCAAACCCAAG-3’，其pRseta原核表达载体序列如SEQ NO：3所示。

1.3重组蛋白原核表达和条件优化

(1)表达：从E coli.DH5α中提取质粒，转化表达宿主菌BL21，隔夜培养后挑取菌斑于1ml添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃震荡培养。菌液加入等量50％甘油，-80℃保存菌种。菌种按1：1000接种于1ml新鲜培养基，37℃培养过夜，次日按1：100接种于100ml的新鲜培养基。以220rpm转速在37℃培养约4h，当OD

(2)表达温度优化：菌种按(1)活化后，次日按1：100接种于100ml的新鲜培养基。以220rpm转速在37℃培养约4h，当OD600达0.3-0.4时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，将菌液分成3份，分别在25℃、30℃、37℃诱导表达3h(图2B)，结果发现诱导表达温度为25℃时，其表达量最高，包涵体蛋白含量最低。

1.4蛋白大量表达和纯化

(1)大量表达：菌种按1：1000接种于10ml新鲜培养基，37℃培养过夜，次日按1：100接种于1L的新鲜培养基。以220rpm转速在37℃培养约4h，当OD

(2)蛋白纯化：菌体先用PBS漂洗一次，再用Buffer W(100mM Tris-HCl，150mMNaCl，1mM EDTA，pH8.0)重悬，1L菌液收集的菌体用10ml Buffer W重悬，补加终浓度为1mM的PMSF。超声破碎菌体，功率为70％，总破碎时间30min，工作时破碎10s，休息5s，破碎在4℃水浴进行，菌液呈现透亮即表明菌体已经破碎。菌液用15000×g离心20min后取上清，上清接种用0.22μm滤器进行过滤。strep-Tactin XT纯化柱先用2倍柱床体积的Buffer W进行平衡，然后将上清上柱，接着用6倍柱床体积的Buffer W洗涤柱床，最后分别用0.6、1.6、0.8倍柱床体积的Buffer BXT(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，50mM biotin，pH 8.0)洗脱蛋白。用SDS-PAGE测定ZZ-APEX2的浓度，结果如图3所示。蛋白溶液用超滤离心柱进行浓缩并把buffer置换成PBS(含50％甘油)，-20℃保存，获得本发明的过氧化物酶ZZ-APEX2二抗。

实施例2过氧化物酶ZZ-APEX2Western blotting应用及其活性检测

1、过氧化物酶ZZ-APEX2Western blotting应用

将3ng ZZ-APEX2蛋白和20μl ECL发光液混合，取5μl混合液滴在纸片上，用化学发光仪进行信号检测(BIORAD)。结果如图4A可以看出，本发明的过氧化物酶ZZ-APEX2二抗能够清楚的检测到发光点，说明本发明ZZ-APEX2二抗具备过氧化物酶的底物催化功能。

取6μg总蛋白(肠癌细胞HCT116裂解液)进行SDS-PAGE，并将蛋白转移到NC膜上，5％BSA室温孵育1h，PBST(含0.5％tween-20)漂洗4次，每次5min。将鼠源抗GAPDH IgG孵育NC膜后剪成三份，分别孵育羊抗鼠IgG-HRP二抗、终浓度为1μg/ml和2μg/ml的ZZ-APEX2，室温孵育1h，然后进行常规ECL检测。孵育羊抗鼠IgG-HRP的NC膜用PBST(含0.5％tween-20)漂洗4次，每次5min；孵育ZZ-APEX2的NC膜用PBS漂洗2次，每次1min。结果如图4B所示，ZZ-APEX2可以有效的结合鼠源IgG，并催化发光反应，而且无需常规步骤里的多次重复的剧烈漂洗过程(加入去污剂)，节约试剂成本和时间。

2、稳定性检测

为了检测本发明ZZ-APEX2的过氧化氢酶的稳定，将实施例1制备的蛋白溶液置于室温保存48h以及在-20℃保存2个月后，然后进行化学发光实验。结果由图5可知，本发明的过氧化物酶ZZ-APEX2分别在室温保存48h与-20℃保存2个月后均显示出了发光点，说明本发明的ZZ-APEX2具有较强的稳定性，可长时间保持催化活力。

3、过氧化氢酶活性的测定

(1)愈创木酚比色法的反应体系：

取100μl置于96孔板，在470nm下每分钟测一次OD值。

(2)采用双倒数法做图，得到Km和Vmax值，并根据公式kcat＝Vmax/[E]total计算转换数。结果由图6A、6B可知，在相同浓度的底物(愈创木酚)和相同摩尔数的酶条件下，与Rab-HRP和mou-HRP相比，本发明的ZZ-APEX2催化产生更多的有色底物。此外，由图6C、6D可知，与Rab-HRP和mou-HRP相比，本发明的ZZ-APEX2具有更大的Kcat(S

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。