一种兔病毒性出血症病毒VP10-VP60重组蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种RHDV VP10‑VP60重组蛋白，属于动物病毒抗体检测领域。所述重组蛋白包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。本发明还进一步公开了所述重组蛋白的基因，包含所述基因的载体和宿主细胞，以及所述重组蛋白的其制备方法和在检测RHDV的抗体中应用。利用本发明的重组蛋白检测RHDV抗体，方便快捷，灵敏度高，与其他病原体无交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种兔病毒性出血症病毒VP10-VP60重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

兔病毒性出血症(Rabbit haemorrhagic disease，RHD)又名兔出血性肺炎、兔出血症和兔瘟。是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)所致的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病，家兔感染后会出现呼吸系统症状，甚至快速死亡。

兔病毒性出血症发病快、传播猛烈，发病和死亡率高，兔群一旦互感染发病率和死亡率均可高达100％，是严重影响养兔业健康发展的重要兔病之一。本病多发春季、夏季少见，该病发生无特效药治疗。因此能够快速简单的诊断兔是否受到RHDV的感染是减少其他正常兔受到感染并死亡的一种重要的手段。

目前诊断兔病毒性出血症的方法有以下几种：1.在病兔肝病料中收集病毒后用负染色后电镜检查为手段的病毒检查；2.动物实验法；3.血凝与血凝抑制试验法；4.酶联免疫吸附试验(ELISA)法等。上述的方法不仅耗时时间久，同时也需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种RHDV VP10-VP60重组蛋白及其制备方法和应用，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

在本发明中，重组蛋白也叫融合蛋白或重组融合蛋白，是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。

衣壳蛋白VP10和VP60蛋白是RHDV主要的免疫原蛋白，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答。将VP10与VP60蛋白主要抗原表位融合在一起表达，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。

在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组蛋白的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。

本发明的第三方面提供一种表达载体，其包括本发明第二方面所述的基因。

在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为pET30a，其具有卡那霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸(His)标签。

本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的表达载体。

进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为BL21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。

本发明的第五方面提供一种制备本发明第一方面所述重组蛋白的方法，包括诱导本发明第四方面所述宿主细胞进行蛋白表达的步骤。

进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为BL21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、成本低、表达量大等优点。

在本发明的一些具体实施方案中，诱导大肠杆菌进行蛋白表达的步骤为：

S1，用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃培养所述大肠杆菌，

S2，当大肠杆菌培养液OD600至0.5-0.7时，用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h；利用该诱导条件，能够使得重组蛋白更加缓慢地表达，有充分的时间进行空间构象的形成，这对重组蛋白发挥功能具有非常重要的作用。

S3，将培养液于4℃，7000rpm离心10min，收集菌体；

S4，用缓冲液Binding Buffer破碎菌体；

S5，超声破碎菌体，条件为：500w，超声2s，间隔5s，共80-120次；

S6，4℃，12000rpm离心30min收集上清，所述重组蛋白在上清中。

优选地，步骤S2中在大肠杆菌培养液OD600至0.6时进行诱导。

优选地，步骤S5中，超声破碎100次。采用本发明的破碎方法，避免了破碎过于剧烈，造成重组蛋白损失的情况。

在本发明的一些实施方案中，进一步包括对重组蛋白进行纯化的步骤。重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。在本发明的一些实施方案中，选择亲和层析的方法，由于重组蛋白中加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度。

在本发明的一些具体实施方案中，将包含重组蛋白的上清过Ni柱，然后用洗脱缓冲液Elution Buffer洗脱得到目的蛋白。

优选地，所述洗脱缓冲液Elution Buffer的配方为：50mM Tris，0.2M Nacl，0.3MImidazole，pH8.0。

本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测RHDV抗体的试剂盒中的应用。

本发明的第七方面提供一种用于检测RHDV抗体的试剂盒，包括本发明第一方面所述的重组蛋白。

进一步地，所述试剂盒还包括鼠IgG和羊抗鼠IgG。

在本发明的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测RHDV抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：

S1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；

S2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；

S3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；

S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线(T线)，质控区有质控线(C线)，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。

在使用时，滴加生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：

①两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

②仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。

在本发明的一些实施方案中，RHDV抗体检测结果呈阳性，代表兔生物样本中含有RHDV抗体，意味着兔具有RHDV感染或曾被RHDV感染。

在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

VP10和VP60蛋白可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答，因此以VP10和VP60融合蛋白进行抗体检测，不仅能够提高检测的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。

本发明采用的胶体金标记免疫分析法是一种新型分析技术，具有快捷简便、成本低、无污染且无需培训的特点，与传统方法相比更为适合现场检测,具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，有广阔的市场前景和应用价值。

附图说明

图1示出了RHDV VP10-VP60融合蛋白纯化的凝胶电泳结果。1：细胞破碎后上样；2：流穿；3：50mM Imidazole洗脱；4：0.3M Imidazole洗脱。

图2示出了本发明一个实施例的检测试纸条的试剂图。1：样本垫；2：金标垫；3：NC膜；31：检测线(T线)；32：质控线(C线)；4：滤纸；5：底板。

图3示出了本发明的一个实施例利用试纸条进行检测的结果示意图。T：检测线，C：质控线。

图4示出了利用本发明的试纸条对临床兔血清样本进行检测的总体结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1 RHDV VP10-VP60融合蛋白基因表达载体的构建

RHDV VP60基因根据NCBI Gene bank:DQ205345的蛋白序列设计。VP10基因根据NCBI Gene bank:AJR27975.1的蛋白序列设计。

VP10-VP60重组蛋融合白的氨基酸序列序列如下(SEQ ID NO.1)：

MAFLMSEFVGLGLAGASVLSSALLRRQELQLQKQALENGLVLKANQLSRLGFNPNEVKSMIVGSNFSGNVKLSNMHNDASVVSAYSMYNPASNGIRKKIKSFNDSVKVYNTTGESSAMEGKTRTAPQGEAAGTATTASVPGTTTDGMDPGVVAATSVVTAENSSASVATAGIGGPPQQVDQQETWRTNFYYNDVFTWSVADAPGSILYTVQHSPQNNPFTAVLSQMYAGWAGGMQFRFIVAGSGVFGGRLVAAVIPPGIEIGPGLEVRQFPHVVIDARSLEPVTITMPDLRPNMYHPTGDPGLVPTLVLSVYNNLINPFGGSTNAIQVTVETRPSDDFEFVMIRAPSSKTVDSISPAGLLTTPVLTGVGNDNRWNGQIVGLQPVPGGFSTCNRHWNLNGSTYGWSSPRFADIDHRRGSASYSGNSSTNVLQFWYANAGSAIDNPISQVAPDGFPDMSFVPFNSPNIPTAGWVGFGGIWNSNNGAPAATTVQAYELGFATGAPNNLQPTTNTSGAQTVAKSIYAVVTGTNQNPTGLFVMASGVISTPNASAVTYTPQPDRIVTTPGTPAAAPVGKNTPIMFASVVRRTGDVNAAAGSTNGTQYGTGSQPLPVTIGLSLNNYSSALMPGQFFVWQLTFASGFMEIGLSVDGYFYAGTGASTTLIDLTELIDVRPVGPRPSKSTLVFNLGGTTNGFSYV

由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。

本发明利用大肠杆菌作为表达系统，为了获得更高的表达效率和更高的表达量，在进行外源蛋白表达时进行了密码子优化，反翻译成核苷酸序列，得到的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

ATGGCGTTTCTGATGAGCGAATTTGTGGGCCTGGGCCTGGCGGGCGCGAGCGTGCTGAGCAGCGCGCTGCTGCGCCGCCAGGAACTGCAGCTGCAGAAACAGGCGCTGGAAAACGGCCTGGTGCTGAAAGCGAACCAGCTGAGCCGCCTGGGCTTTAACCCGAACGAAGTGAAAAGCATGATTGTGGGCAGCAACTTTAGCGGCAACGTGAAACTGAGCAACATGCATAACGATGCGAGCGTGGTGAGCGCGTATAGCATGTATAACCCGGCGAGCAACGGCATTCGCAAAAAAATTAAAAGCTTTAACGATAGCGTGAAAGTGTATAACACCACCGGCGAAAGCAGCGCGATGGAAGGCAAAACCCGCACCGCGCCGCAGGGCGAAGCGGCGGGCACCGCGACCACCGCGAGCGTGCCGGGCACCACCACCGATGGCATGGATCCGGGCGTGGTGGCGGCGACCAGCGTGGTGACCGCGGAAAACAGCAGCGCGAGCGTGGCGACCGCGGGCATTGGCGGCCCGCCGCAGCAGGTGGATCAGCAGGAAACCTGGCGCACCAACTTTTATTATAACGATGTGTTTACCTGGAGCGTGGCGGATGCGCCGGGCAGCATTCTGTATACCGTGCAGCATAGCCCGCAGAACAACCCGTTTACCGCGGTGCTGAGCCAGATGTATGCGGGCTGGGCGGGCGGCATGCAGTTTCGCTTTATTGTGGCGGGCAGCGGCGTGTTTGGCGGCCGCCTGGTGGCGGCGGTGATTCCGCCGGGCATTGAAATTGGCCCGGGCCTGGAAGTGCGCCAGTTTCCGCATGTGGTGATTGATGCGCGCAGCCTGGAACCGGTGACCATTACCATGCCGGATCTGCGCCCGAACATGTATCATCCGACCGGCGATCCGGGCCTGGTGCCGACCCTGGTGCTGAGCGTGTATAACAACCTGATTAACCCGTTTGGCGGCAGCACCAACGCGATTCAGGTGACCGTGGAAACCCGCCCGAGCGATGATTTTGAATTTGTGATGATTCGCGCGCCGAGCAGCAAAACCGTGGATAGCATTAGCCCGGCGGGCCTGCTGACCACCCCGGTGCTGACCGGCGTGGGCAACGATAACCGCTGGAACGGCCAGATTGTGGGCCTGCAGCCGGTGCCGGGCGGCTTTAGCACCTGCAACCGCCATTGGAACCTGAACGGCAGCACCTATGGCTGGAGCAGCCCGCGCTTTGCGGATATTGATCATCGCCGCGGCAGCGCGAGCTATAGCGGCAACAGCAGCACCAACGTGCTGCAGTTTTGGTATGCGAACGCGGGCAGCGCGATTGATAACCCGATTAGCCAGGTGGCGCCGGATGGCTTTCCGGATATGAGCTTTGTGCCGTTTAACAGCCCGAACATTCCGACCGCGGGCTGGGTGGGCTTTGGCGGCATTTGGAACAGCAACAACGGCGCGCCGGCGGCGACCACCGTGCAGGCGTATGAACTGGGCTTTGCGACCGGCGCGCCGAACAACCTGCAGCCGACCACCAACACCAGCGGCGCGCAGACCGTGGCGAAAAGCATTTATGCGGTGGTGACCGGCACCAACCAGAACCCGACCGGCCTGTTTGTGATGGCGAGCGGCGTGATTAGCACCCCGAACGCGAGCGCGGTGACCTATACCCCGCAGCCGGATCGCATTGTGACCACCCCGGGCACCCCGGCGGCGGCGCCGGTGGGCAAAAACACCCCGATTATGTTTGCGAGCGTGGTGCGCCGCACCGGCGATGTGAACGCGGCGGCGGGCAGCACCAACGGCACCCAGTATGGCACCGGCAGCCAGCCGCTGCCGGTGACCATTGGCCTGAGCCTGAACAACTATAGCAGCGCGCTGATGCCGGGCCAGTTTTTTGTGTGGCAGCTGACCTTTGCGAGCGGCTTTATGGAAATTGGCCTGAGCGTGGATGGCTATTTTTATGCGGGCACCGGCGCGAGCACCACCCTGATTGATCTGACCGAACTGATTGATGTGCGCCCGGTGGGCCCGCGCCCGAGCAAAAGCACCCTGGTGTTTAACCTGGGCGGCACCACCAACGGCTTTAGCTATGTG

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组基因序列，并与pET30a质粒连接，形成重组表达载体。

实施例2 RHDV VP10-VP60融合蛋白的表达

将RHDV VP10-VP60融合基因质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50μg/mL卡那霉素(上海生工，货号：K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300mL LB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为1mM的IPTG(上海生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h。诱导之后，将培养液4℃，转速7000rpm，离心10min，收集菌体。

实施例3 RHDV VP10-VP60融合蛋白的纯化及复性

用50mL上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)50mL破碎菌体；然后超声破碎，条件为500w，超声2s，间隔5s，共100次；最后12000rpm，30min，4℃离心收集上清，目的蛋白在上清中。接着过Ni柱一步纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mMTris，0.2M Nacl，0.3M Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。利用PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图1所示。

由图1可知，纯化后的融合蛋白纯度很高，将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22μm滤器过滤后，用BCA法测定浓度后，于-20℃保存备用。

实施例4 双抗原夹心金标法检测RHDV抗体

1双抗原夹心金标法检测条的制备

1.1胶体金的烧制

在三角烧瓶中加入1000mL超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10％氯金酸(sigma)4mL，再加入10％柠檬酸三钠溶液6mL，继续加热沸腾5min，然后冷却至室温后用0.22μm过滤器过滤胶体金后放置4℃备用。

1.2重组RHDV VP10-VP60融合蛋白的标记

取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K

1.3鼠IgG标记

取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K

将上述金标复合物用金标稀释液稀释100倍后与1.2步骤中稀释后的RHDV VP10-VP60融合蛋白胶体金复合物混合后浸泡玻璃纤维，37℃烘干4h后即制成金标垫。

1.4重组RHDV VP10-VP60融合蛋白的点膜

用点膜稀释液(50mM Tris，2％蔗糖，pH8.5)稀释纯化后VP10-VP60融合蛋白至0.8mg/mL做为胶体金试纸条的检测线(Test-Line，T线)，用相同稀释液稀释羊抗鼠IgG(杭州隆基生物技术有限公司，货号：PS00901)至0.3mg/mL做为胶体金试纸条的质控线(Control-Line，C线)，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜。

1.5双抗原夹心金标法检测RHDV抗体试纸条的组装

将以上金标垫、包被好原料至硝酸纤维素膜(NC膜)的聚酯板及滤纸、样本垫等安装底板上，组装成RHDV抗体双抗原夹心法检测试纸条。具体安装方式如图2所示：分别将样本垫1、金标垫2、NC膜3和滤纸4安装在底板5上。其中样本垫1叠加一部分压在金标垫2上，金标垫2叠加一部分压在NC膜3上，滤纸4叠加一部分压在NC膜3上。其中NC膜3分为测试区和质控区，测试区设置检测线31(T线)，质控区设置质控线32(C线)，检测线31靠近金标垫2，质控线32靠近滤纸4。

进一步，将组装好的试纸条用切条机切割成3mm条子，然后装入特别制定的塑料卡中，即成为成熟的检测试剂卡。

2双抗原夹心金标法检测RHDV抗体试纸条/卡的检测

加入90μL待检测样本(兔血清、血浆)至样本加样处(S)，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下(如图3所示)：

④两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

⑤仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

⑥质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。

3双抗原夹心金标法检测RHDV抗体试纸条/卡的检测结果

一共检测30份RHDV感染阳性兔血清(样本编号1～30)，及47份正常未患病且未经免疫的兔血清(样本编号31～77)，其中T线和C线两条线的表示检测结果为阳性，只有C线一条线的表示检测结果为阴性。

检测结果如表1所示：30份阳性血清中检测出阳性28例，漏检2例(11号样本和23号样本)，在47份阴性血清中出现假阳1例(68号样本)。

表1 RHDV抗体检测结果

由此可知，样本检测的灵敏度和特异性分别为93.3％和97.9％，整体符合率为96.1％，如图4所示。

以上结果表明，利用本发明的重组RHDV VP10-VP60融合蛋白检测RHDV，具有非常高的的灵敏度和特异性，可以作为制作RHDV抗体检测试纸条的原料，并可以在临床检测中广泛应用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州爱谨生物科技有限公司

<120> 一种兔病毒性出血症病毒VP10-VP60重组蛋白及其制备方法和应用

<130> AJ2010246

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Phe Leu Met Ser Glu Phe Val Gly Leu Gly Leu Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Leu Ser Ser Ala Leu Leu Arg Arg Gln Glu Leu Gln Leu Gln

20 25 30

Lys Gln Ala Leu Glu Asn Gly Leu Val Leu Lys Ala Asn Gln Leu Ser

35 40 45

Arg Leu Gly Phe Asn Pro Asn Glu Val Lys Ser Met Ile Val Gly Ser

50 55 60

Asn Phe Ser Gly Asn Val Lys Leu Ser Asn Met His Asn Asp Ala Ser

65 70 75 80

Val Val Ser Ala Tyr Ser Met Tyr Asn Pro Ala Ser Asn Gly Ile Arg

85 90 95

Lys Lys Ile Lys Ser Phe Asn Asp Ser Val Lys Val Tyr Asn Thr Thr

100 105 110

Gly Glu Ser Ser Ala Met Glu Gly Lys Thr Arg Thr Ala Pro Gln Gly

115 120 125

Glu Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ser Val Pro Gly Thr Thr Thr

130 135 140

Asp Gly Met Asp Pro Gly Val Val Ala Ala Thr Ser Val Val Thr Ala

145 150 155 160

Glu Asn Ser Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Gly Ile Gly Gly Pro Pro

165 170 175

Gln Gln Val Asp Gln Gln Glu Thr Trp Arg Thr Asn Phe Tyr Tyr Asn

180 185 190

Asp Val Phe Thr Trp Ser Val Ala Asp Ala Pro Gly Ser Ile Leu Tyr

195 200 205

Thr Val Gln His Ser Pro Gln Asn Asn Pro Phe Thr Ala Val Leu Ser

210 215 220

Gln Met Tyr Ala Gly Trp Ala Gly Gly Met Gln Phe Arg Phe Ile Val

225 230 235 240

Ala Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Arg Leu Val Ala Ala Val Ile Pro

245 250 255

Pro Gly Ile Glu Ile Gly Pro Gly Leu Glu Val Arg Gln Phe Pro His

260 265 270

Val Val Ile Asp Ala Arg Ser Leu Glu Pro Val Thr Ile Thr Met Pro

275 280 285

Asp Leu Arg Pro Asn Met Tyr His Pro Thr Gly Asp Pro Gly Leu Val

290 295 300

Pro Thr Leu Val Leu Ser Val Tyr Asn Asn Leu Ile Asn Pro Phe Gly

305 310 315 320

Gly Ser Thr Asn Ala Ile Gln Val Thr Val Glu Thr Arg Pro Ser Asp

325 330 335

Asp Phe Glu Phe Val Met Ile Arg Ala Pro Ser Ser Lys Thr Val Asp

340 345 350

Ser Ile Ser Pro Ala Gly Leu Leu Thr Thr Pro Val Leu Thr Gly Val

355 360 365

Gly Asn Asp Asn Arg Trp Asn Gly Gln Ile Val Gly Leu Gln Pro Val

370 375 380

Pro Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Arg His Trp Asn Leu Asn Gly Ser

385 390 395 400

Thr Tyr Gly Trp Ser Ser Pro Arg Phe Ala Asp Ile Asp His Arg Arg

405 410 415

Gly Ser Ala Ser Tyr Ser Gly Asn Ser Ser Thr Asn Val Leu Gln Phe

420 425 430

Trp Tyr Ala Asn Ala Gly Ser Ala Ile Asp Asn Pro Ile Ser Gln Val

435 440 445

Ala Pro Asp Gly Phe Pro Asp Met Ser Phe Val Pro Phe Asn Ser Pro

450 455 460

Asn Ile Pro Thr Ala Gly Trp Val Gly Phe Gly Gly Ile Trp Asn Ser

465 470 475 480

Asn Asn Gly Ala Pro Ala Ala Thr Thr Val Gln Ala Tyr Glu Leu Gly

485 490 495

Phe Ala Thr Gly Ala Pro Asn Asn Leu Gln Pro Thr Thr Asn Thr Ser

500 505 510

Gly Ala Gln Thr Val Ala Lys Ser Ile Tyr Ala Val Val Thr Gly Thr

515 520 525

Asn Gln Asn Pro Thr Gly Leu Phe Val Met Ala Ser Gly Val Ile Ser

530 535 540

Thr Pro Asn Ala Ser Ala Val Thr Tyr Thr Pro Gln Pro Asp Arg Ile

545 550 555 560

Val Thr Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala Ala Pro Val Gly Lys Asn Thr

565 570 575

Pro Ile Met Phe Ala Ser Val Val Arg Arg Thr Gly Asp Val Asn Ala

580 585 590

Ala Ala Gly Ser Thr Asn Gly Thr Gln Tyr Gly Thr Gly Ser Gln Pro

595 600 605

Leu Pro Val Thr Ile Gly Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Ala Leu

610 615 620

Met Pro Gly Gln Phe Phe Val Trp Gln Leu Thr Phe Ala Ser Gly Phe

625 630 635 640

Met Glu Ile Gly Leu Ser Val Asp Gly Tyr Phe Tyr Ala Gly Thr Gly

645 650 655

Ala Ser Thr Thr Leu Ile Asp Leu Thr Glu Leu Ile Asp Val Arg Pro

660 665 670

Val Gly Pro Arg Pro Ser Lys Ser Thr Leu Val Phe Asn Leu Gly Gly

675 680 685

Thr Thr Asn Gly Phe Ser Tyr Val

690 695

<210> 2

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgtttc tgatgagcga atttgtgggc ctgggcctgg cgggcgcgag cgtgctgagc 60

agcgcgctgc tgcgccgcca ggaactgcag ctgcagaaac aggcgctgga aaacggcctg 120

gtgctgaaag cgaaccagct gagccgcctg ggctttaacc cgaacgaagt gaaaagcatg 180

attgtgggca gcaactttag cggcaacgtg aaactgagca acatgcataa cgatgcgagc 240

gtggtgagcg cgtatagcat gtataacccg gcgagcaacg gcattcgcaa aaaaattaaa 300

agctttaacg atagcgtgaa agtgtataac accaccggcg aaagcagcgc gatggaaggc 360

aaaacccgca ccgcgccgca gggcgaagcg gcgggcaccg cgaccaccgc gagcgtgccg 420

ggcaccacca ccgatggcat ggatccgggc gtggtggcgg cgaccagcgt ggtgaccgcg 480

gaaaacagca gcgcgagcgt ggcgaccgcg ggcattggcg gcccgccgca gcaggtggat 540

cagcaggaaa cctggcgcac caacttttat tataacgatg tgtttacctg gagcgtggcg 600

gatgcgccgg gcagcattct gtataccgtg cagcatagcc cgcagaacaa cccgtttacc 660

gcggtgctga gccagatgta tgcgggctgg gcgggcggca tgcagtttcg ctttattgtg 720

gcgggcagcg gcgtgtttgg cggccgcctg gtggcggcgg tgattccgcc gggcattgaa 780

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