一种镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器的构建及应用

摘要

本发明公开了一种镉离子微生物全细胞生物传感‑吸附器的构建及应用。本发明公开的镉离子微生物全细胞生物传感‑吸附器含有CadR基因、lpp‑ompA‑CdBD基因、荧光蛋白编码基因与驱动这三种基因表达的启动子，启动子的活性由CadR蛋白质与镉的复合物激活；CadR基因编码氨基酸序列是序列表中序列2的CadR蛋白质lpp‑ompA‑CdBD基因编码氨基酸序列是序列表中序列4的lpp‑ompA‑CdBD蛋白质。实验证明，本发明的镉离子微生物全细胞生物传感‑吸附器可以指示镉离子的存在，并可同时实现对镉离子的吸附，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器的构建及应用。

背景技术

自然界中镉的原始分布并不广泛，多以硫化镉的形态存在于非铁金属矿和岩层中。镉元素主要通过地壳活动、化学风化等方式进行自然播散。镉是人体非必需元素并可对人体健康造成严重危害，镉是具有致癌、致畸、致突变作用的剧毒重金属元素。伴随人类活动如采矿、冶炼，特别是工农业的迅猛发展，镉广泛应用于电镀、镍-镉充电电池、半导体元件、合金、塑料稳定剂、杀虫剂、防腐剂等制造行业。工业化进程伴随着镉元素的“重新分布”，镉元素目前普遍存在于大气、土壤、水体中。值得注意的是，镉作为不可自然降解的重金属，其毒性具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，环境中低浓度的镉可通过土壤-植物、水体-浮游生物-鱼贝类迁移转化，经食物链积累和放大，进而对人类产生更大的毒害。消除环境镉残留却是耗时耗资的大工程。环境中含镉污染物的检测、吸附和回收是化学工作者关注的焦点。

目前环境重金属残留的检测方法主要为物理化学方法，如原子光谱法、电感耦合等离子体质谱法。这类方法需要昂贵的专业设备，根据样品性质需要摸索不同的前处理方法，检测时效性差，并对操作人员的专业技术要求高。20世纪70年代以来，微生物传感器的开发为环境中重金属的检测提供更多选择和诸多便利，微生物传感器重点检测可生物利用的重金属毒物，检测快速，成本低廉，但灵敏度不高是其主要缺点。

围绕运用生物学手段处理环境重金属污染，避免物理化学方法可能对环境造成的二次污染，研究者们结合基因工程、蛋白质工程和微生物细胞表面展示技术，尝试将一些可吸附有毒重金属的靶分子展示在模式微生物大肠杆菌、酵母等细胞表面，开发出了一系列微生物金属吸附器。然而由于微生物展示系统的局限性，研究主要集中在金属结合寡肽、金属硫蛋白的菌体细胞表面展示。

目前，已有多个镉离子微生物全细胞生物传感器成功开发，用于镉离子的高特异性生物指示。镉离子微生物全细胞吸附器也有研究报道，可实现镉离子的高选择性吸附，但关于一体化的镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器，尚未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何同时实现环境中镉的指示与富集。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有镉生物传感-吸附器功能的微生物，记为微生物1，该微生物含有CadR基因、lpp-ompA-CdBD基因、荧光蛋白编码基因与驱动所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因与所述荧光蛋白编码基因表达的启动子，所述启动子的活性由CadR蛋白质与镉的复合物激活；

所述CadR基因编码如下A1)、A2)或A3)的CadR蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；

所述lpp-ompA-CdBD基因编码如下B1)、B2)或B3)的lpp-ompA-CdBD蛋白质：

B1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；

B2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

所述微生物表达CadR蛋白质、lpp-ompA-CdBD蛋白质与所述荧光蛋白。

所述蛋白质标签可如下表所示。

表：标签的序列

上述A2)中的蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。上述B2)中的蛋白质，为与序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述CadR基因可通过将序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。

上述lpp-ompA-CdBD基因可通过将序列1的第577-1266位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1的第577-1266位所示的DNA分子编码序列4所示的蛋白质。

上述微生物1中，所述CadR基因可为如下a1)或a2)或a3)：

a1)序列表中序列3所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CadR蛋白质的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述CadR蛋白质的DNA分子。

a3)所述DNA分子可为序列1的第7-450位。

所述lpp-ompA-CdBD基因可为如下b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列1的第577-1266位所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述lpp-ompA-CdBD蛋白质的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述lpp-ompA-CdBD蛋白质的DNA分子。

所述微生物1存在由非所述复合物激活的CadR蛋白质的本底表达。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码CadR蛋白质或lpp-ompA-CdBD蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的CadR蛋白质或lpp-ompA-CdBD蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CadR蛋白质且具有CadR蛋白质功能、编码lpp-ompA-CdBD蛋白质且具有lpp-ompA-CdBD蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述微生物1中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述微生物1中，所述启动子可为双向启动子。

进一步，所述启动子可含有序列1的第506-534位。所述启动子的序列可为序列1的第506-534位。

在本发明的一个实施例中，所述荧光蛋白为mCherry。mCherry的氨基酸序列为序列表中序列5，其编码序列为序列1的第1281-1991位。

本发明还提供了另一种具有镉生物传感-吸附器功能的微生物，记为微生物2，该微生物含有由所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因、所述荧光蛋白编码基因与所述启动子连接得到的DNA分子，所述启动子驱动所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因、所述荧光蛋白编码基因的表达。

上述微生物2中，所述DNA分子还可含有核糖体结合位点和/或终止子。

所述终止子可为T7终止子。所述T7终止子的序列可为序列1的第2097-2144位。

上述微生物2中，所述DNA分子可为如下c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

其中，序列1的第1-6位为BglII的识别序列，第7-450位为CadR基因编码序列的反向互补序列，第506-534位为cad双向启动子区(cad bidirectional promoter region)，第535-540位为XbaI的识别序列，第563-568位为rbs序列，第574-579位为NdeI的识别序列，第577-1266位为lpp-ompA-CdBD基因序列，第1268-1273位为rbs序列，第1281-1991位为mCherry报告基因序列，第1992-1997位为HindIII的识别序列，第2097-2144位为T7终止子序列。

所述微生物2存在由非所述复合物激活的CadR蛋白质的本底表达。

上述微生物2中，所述DNA分子可通过含有所述DNA分子的重组载体处于所述微生物中。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-21a(+)。

所述重组载体可通过将所述DNA分子插入至所述载体中得到。所述重组载体具体可为pET-cad-LOC-mCherry，所述pET-cad-LOC-mCherry为将pET-21a(+)的BglII与HindIII间的DNA片段替换为序列表中序列1的第7-1991位所示的DNA片段得到的重组载体，所述pET-cad-LOC-mCherry含有序列1所示的DNA片段。

所述pET-cad-LOC-mCherry能表达序列表中序列2所示的CadR蛋白质，序列4所示的lpp-ompA-CdBD蛋白质与序列5所示的mCherry蛋白质。

上文中，所述微生物可为细菌、酵母、藻或真菌。所述细菌可为大肠杆菌(如大肠杆菌Top10)。

本发明还提供了下述任一产品：

X1、由所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因、所述荧光蛋白编码基因与所述启动子组成的成套产品；

X2、所述DNA分子；

X3、所述重组载体。

本发明还提供了下述任一应用：

Y1、所述微生物1或所述微生物2在指示和/或富集镉中的应用；

Y2、所述微生物1或所述微生物2在制备指示和/或富集镉产品中的应用；

Y3、所述产品在指示和/或富集镉中的应用；

Y4、所述产品在制备指示和/或富集镉产品中的应用。

本发明中，镉可为镉离子Cd(II)。

实验证明，本发明的镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器可以指示镉离子的存在，并可同时实现对镉离子的吸附，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为基于人工cad操纵子的镉生物传感-吸附器示意图。

图2为重组载体构建流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、镉生物传感-吸附器的构建与检测

本实施例发明人构建了一个基于人工cad操纵子的镉生物传感-吸附器，如图1所示，其可以实现镉生物传感与生物吸附的双功能。

1、基于人工cad操纵子的镉生物传感-吸附器的构建

第一步，以pET-21a(+)(Novagen)为出发载体，全基因合成序列表序列1的第1-540位所示的DNA片段，而后利用BglII与XbaI进行双酶切，将所得DNA大片段与pET-21a(+)经BglII与XbaI双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pET-cad；第二步，全基因合成序列表序列1的第574-1997位所示的DNA片段，而后利用NdeI与HindIII进行双酶切，将所得DNA大片段与pET-cad经NdeI与HindIII双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pET-cad-LOC-mCherry。载体构建如图2所示。

pET-cad-LOC-mCherry为将pET-21a(+)的BglII与HindIII间的DNA片段替换为序列表中序列1的第7-1991位所示的DNA片段得到的重组载体，pET-cad-LOC-mCherry含有序列1所示的DNA片段。

其中，序列1的第1-6位为BglII的识别序列，第7-450位为CadR基因编码序列的反向互补序列，第506-534位为cad双向启动子区(cad bidirectional promoter region)，第535-540位为XbaI的识别序列，第563-568位为rbs序列，第574-579位为NdeI的识别序列，第577-1266位为lpp-ompA-CdBD基因序列，第1268-1273位为rbs序列，第1281-1991位为mCherry报告基因序列，第1992-1997位为HindIII的识别序列，第2097-2144位为T7终止子序列。

pET-cad-LOC-mCherry能表达序列表中序列2所示的CadR蛋白质，其编码序列为序列表中序列3，还能表达序列表序列4所示的lpp-ompA-CdBD蛋白质与序列5所示的mCherry蛋白质。

将pET-cad-LOC-mCherry导入大肠杆菌Top10(ThermoFisher Catalog NumberC4040-10)中，得到重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry，将pET-21a(+)导入大肠杆菌Top10中，得到对照菌。

2、镉生物传感-吸附器对不同浓度镉离子的响应和镉吸附

2.1对不同浓度镉离子的响应

将步骤1所得重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry接种至含50mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37℃，250rpm，振荡培养至OD

按照上述方法，将氯化镉的浓度由“1.6μmol/L”分别替换为0、0.1、0.2、0.4和0.8μmol/L，其他步骤均不变，得到不同浓度氯化镉处理的菌液。

检测各菌液在600nm下的吸光值(即OD600值)；而后在587nm激发光下，检测各菌液在610nm处的荧光(mCherry)强度，计算荧光度与OD600值的比值，结果如表1所示。

表1、重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry的检测结果

可见随着氯化镉浓度的升高，菌液mCherry荧光逐渐升高，达到了镉的生物指示目的。

2.2对不同浓度镉离子的吸附

1)取步骤2.1得到的各组菌液，3500rpm离心5min，收集菌体，用无菌水清洗3次，然后在80℃烘箱烘至恒重，称重后即得到菌体干重；

2)取1mg步骤1)得到的烘干至恒重的菌体，加入5ml 68％硝酸水溶液，然后进行微波消化(500W，140℃，2小时)，消化后用双蒸水定容至50ml，得到待测溶液。采用原子吸收法检测待测溶液中的镉浓度。计算每克干重的菌体的镉含量。结果如表2所示。

表2、重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry的检测结果

结果表明，随着镉离子暴露浓度的升高，重组菌吸附镉离子的量逐渐升高。

3、镉生物传感-吸附器对不同金属离子的响应和吸附

3.1对不同金属离子的响应

将步骤1所得重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry接种至含50mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37℃，250rpm，振荡培养至OD

按照上述方法，将氯化镉分别替换为硝酸铅、氯化锌、氯化钙、硫酸铜、硫酸镍、氯化镁、硫酸亚铁，其他步骤均不变，得到不同重金属处理的菌液。

检测各菌液在600nm下的吸光值(即OD600值)；而后在587nm激发光下，检测各菌液在610nm处的荧光(mCherry)强度，计算荧光度与OD600值的比值，结果如表3所示。

表3、重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry的检测结果

结果表明，只有氯化镉暴露，报告基因mCherry得到了高表达，该重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry只特异性响应氯化镉。

3.2对不同金属离子的吸附

1)取步骤3.1得到的各组菌液，3500rpm离心5min，收集菌体，用无菌水清洗3次；

2)取步骤1)得到的各组菌体，然后在80℃烘箱烘至恒重，称重后即得到菌体干重；

3)取1mg步骤2)得到的烘干至恒重的菌体，加入5ml 68％硝酸水溶液，然后进行微波消化(500W，140℃，2小时)，消化后用双蒸水定容至50ml，得到待测溶液。采用原子吸收法检测待测溶液中的各种金属(镉、铅、锌、钙、铜、镍、镁、铁)浓度。计算每克干重的菌体的各种金属含量。结果如表4所示。

表4、重组菌Top10/pET-cad-LOC-mCherry的检测结果

结果表明，只有氯化镉处理组的重组菌表现出了吸附镉的能力，其他金属盐处理的重组菌均无其他金属吸附能力。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 深圳市职业病防治院

<120> 一种镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器的构建及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2144

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

agatctttaa tgcccgtggc ttcgccctac atgcgaatgc tcggtttccg gcaccgatac 60

cgccccgttc gtctccagtt gctgcaagat cgcacactcc gccccttgtg cattgcagcg 120

ccgccgcagc tccaccagct gttcctgcaa cgccaccaga ccatcgatcc gtgcctgcac 180

atgctcgata tgctcgtcga tcagcgcatt gacgctgccg cacgaatcat cggggctgtc 240

gcgcaggcgt agcaggctgc ggatttcatc cagggtcatg tccagggtgc ggcagttgcg 300

gatgaaggta agccgctcga cgtgggcctg ggtgtacagc cggtagttgc cgtcgctgcg 360

tgccggctcc ggcagcagct gttcacgctc gtagtagcgg atggtttcca cggcgcagtc 420

ggtggctttg gccagttctc cgatcttcat cacgaaattc tccagcaagt ggcttgaccc 480

tatagtggct acagggtgtt cacttggcaa caggctcaaa ttaaggatga cccctctaga 540

aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatga aagcaaccaa actggttctg 600

ggtgcagtaa tcctgggctc taccctgtta gcgggttgct cctctaacgc taaaatcgat 660

caaggtatca acccgtatgt tggcttcgaa atgggctatg attggttagg tcgtatgcca 720

tataaaggtt ctgttgagaa tggtgcgtat aaagctcagg gcgttcagct gaccgctaaa 780

ctgggctacc cgatcaccga cgatctggat atctacaccc gtctgggcgg catggtttgg 840

cgtgcggata ccaaatctaa cgtttacggt aaaaaccacg ataccggcgt tagcccggtg 900

ttcgcgggcg gcgttgaata cgcgatcacc ccggaaatcg cgacccgtct ggaataccag 960

tggaccaaca acatcggtga tgcgcacacc atcggcaccc gtccggataa cggcggcggc 1020

ggcggcacct tcatccgtaa ctgccgtacc ctggatatga ccctggatga aatccgtagc 1080

ctgctgcgtc tgcgtgatag cccggatgat agctgcggta gcgttaacgc gctgatcgat 1140

gaacacatcg aacacgttca ggctcgtatc gatggtctgg ttgcgctgca ggaacagctg 1200

gttgaactgc gtcgtcgttg caacgcgcag ggcgcggaat gcgcgatcct gcagcagctg 1260

gaataagaag gagatatacc atggtctcta aaggcgagga agacaacatg gcaatcatca 1320

aagagttcat gcgtttcaaa gtgcacatgg agggtagcgt caacggtcac gaatttgaaa 1380

tcgaaggtga gggtgaaggt cgcccgtacg aaggtaccca aaccgctaaa ctgaaagtga 1440

cgaaaggtgg tccgctgcca ttcgcatggg atatcctgtc tccacagttc atgtacggtt 1500

ctaaagcgta cgtgaaacac ccggctgaca ttcctgacta cctgaaactg tccttcccgg 1560

aaggtttcaa atgggaacgt gtgatgaact tcgaggacgg tggcgtagtt actgttaccc 1620

aggactcttc cctgcaggat ggtgagttta tctacaaggt taaactgcgt ggcactaact 1680

ttccgtccga cggcccggtt atgcagaaga agactatggg ctgggaagca tctagcgaac 1740

gtatgtatcc ggaagatggt gctctgaaag gcgaaatcaa acagcgtctg aaactgaaag 1800

acggcggcca ttatgatgcg gaagttaaga cgacctacaa agccaagaaa ccggttcagc 1860

tgccgggcgc ctataatgta aacatcaaac tggatattac ctcccacaac gaagattaca 1920

ccattgtaga acaatatgaa cgcgcggaag gccgccatag caccggcggc atggacgaac 1980

tgtacaaata aaagcttgcg gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg 2040

ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 2100

cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttg 2144

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Lys Ile Gly Glu Leu Ala Lys Ala Thr Asp Cys Ala Val Glu Thr

1 5 10 15

Ile Arg Tyr Tyr Glu Arg Glu Gln Leu Leu Pro Glu Pro Ala Arg Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Tyr Arg Leu Tyr Thr Gln Ala His Val Glu Arg Leu Thr

35 40 45

Phe Ile Arg Asn Cys Arg Thr Leu Asp Met Thr Leu Asp Glu Ile Arg

50 55 60

Ser Leu Leu Arg Leu Arg Asp Ser Pro Asp Asp Ser Cys Gly Ser Val

65 70 75 80

Asn Ala Leu Ile Asp Glu His Ile Glu His Val Gln Ala Arg Ile Asp

85 90 95

Gly Leu Val Ala Leu Gln Glu Gln Leu Val Glu Leu Arg Arg Arg Cys

100 105 110

Asn Ala Gln Gly Ala Glu Cys Ala Ile Leu Gln Gln Leu Glu Thr Asn

115 120 125

Gly Ala Val Ser Val Pro Glu Thr Glu His Ser His Val Gly Arg Ser

130 135 140

His Gly His

145

<210> 3

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atgaagatcg gagaactggc caaagccacc gactgcgccg tggaaaccat ccgctactac 60

gagcgtgaac agctgctgcc ggagccggca cgcagcgacg gcaactaccg gctgtacacc 120

caggcccacg tcgagcggct taccttcatc cgcaactgcc gcaccctgga catgaccctg 180

gatgaaatcc gcagcctgct acgcctgcgc gacagccccg atgattcgtg cggcagcgtc 240

aatgcgctga tcgacgagca tatcgagcat gtgcaggcac ggatcgatgg tctggtggcg 300

ttgcaggaac agctggtgga gctgcggcgg cgctgcaatg cacaaggggc ggagtgtgcg 360

atcttgcagc aactggagac gaacggggcg gtatcggtgc cggaaaccga gcattcgcat 420

gtagggcgaa gccacgggca ttaa 444

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Gly Ile Asn

20 25 30

Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro

35 40 45

Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln

50 55 60

Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr

65 70 75 80

Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val

85 90 95

Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly

100 105 110

Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln

115 120 125

Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr Arg Pro Asp

130 135 140

Asn Gly Gly Gly Gly Gly Thr Phe Ile Arg Asn Cys Arg Thr Leu Asp

145 150 155 160

Met Thr Leu Asp Glu Ile Arg Ser Leu Leu Arg Leu Arg Asp Ser Pro

165 170 175

Asp Asp Ser Cys Gly Ser Val Asn Ala Leu Ile Asp Glu His Ile Glu

180 185 190

His Val Gln Ala Arg Ile Asp Gly Leu Val Ala Leu Gln Glu Gln Leu

195 200 205

Val Glu Leu Arg Arg Arg Cys Asn Ala Gln Gly Ala Glu Cys Ala Ile

210 215 220

Leu Gln Gln Leu Glu

225

<210> 5

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235