一种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法

摘要

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法，包括如下步骤：1）取复合微生态产品，加入无菌生理盐水制成菌悬液；取菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；2）分别取三个稀释度的菌液进行高温处理，之后迅速冷却至室温备用；3）取经步骤2）处理后的菌液0.50 mL接种在梭菌增殖培养基试管中，接种于液体石蜡面以下，不吹打，每支试管需更换接种枪头；将接种后的试管垂直放于试管架上，使接种后的试管冷却至室温；将试管置入30℃恒温培养箱中，培养12‑15h后对丁酸梭菌芽孢计数。本发明可以实现对复合微生态产品中单一丁酸梭菌芽孢的计数，操作简单，快捷，不需要额外添加抗生素，计数准确。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法。

背景技术

微生态产品作为一种重要的动物肠道菌群调节剂被广泛添加在饲料中。国内使用比较常见的有芽孢杆菌类的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌，乳酸菌类的屎肠球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸肠球菌，酵母菌类的酿酒酵母和产朊假丝酵母。各类产品在动物体内发挥着不同的作用，在市场上的复合微生态产品应用的更为广泛。但由于各种微生物生长特性存在差异，相互之间存在检测干扰。现行的单一丁酸梭菌的检测有标准可遵循，但是，对于复合产品中单一菌的检测，目前无相关标准。

目前，虽然可用抗生素抑制其他菌的生长，但是在培养中添加抗生素需要先使用无菌滤膜过滤再使用，然后待溶解过后的固体培养基冷却至适宜温度后再加入，使得操作繁琐且增加染菌的几率。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法，能够实现对复合微生态产品中的单一丁酸梭菌芽孢进行计数。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法，包括如下步骤：

1）样品稀释：取复合微生态产品，加入无菌生理盐水后置于室温下振荡混匀，制成菌悬液；取菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；

2）高温处理：分别取三个稀释度的菌液进行高温处理，去除乳酸菌类、酵母菌类、曲霉菌类的干扰，之后迅速冷却至室温备用；

3）培养及计数：取经步骤2）处理后的菌液0.50 mL接种在梭菌增殖培养基试管中，接种于液体石蜡面以下，不吹打，每支试管需更换接种枪头；将接种后的试管垂直放于试管架上，使接种后的试管冷却至室温；将试管置入30℃恒温培养箱中，培养12-15h后对丁酸梭菌芽孢计数。

进一步地，步骤3）中，所述梭菌增殖培养基试管是在每根试管中分装15 mL梭菌增殖培养基，之后覆2 cm液体石蜡，用硅胶塞塞住试管口，并于115℃灭菌20 min后得到。

更进一步地，所述梭菌增殖培养基的制备方法为：将酵母浸粉3.0 g、牛肉浸粉10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖5.0 g、可溶性淀粉1.0 g、氯化钠5.0 g、三水合乙酸钠3.0g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、琼脂粉7.0 g加入到水中，加热煮沸10 min，然后补足水至1000mL，调pH至7.0±0.1。

更进一步地，所述液体石蜡是将固体石蜡加热熔化成液体，然后放置在50℃恒温水浴锅中备用得到。

进一步地，步骤3）中，观察长出的单菌落，选取观察到的菌落数在30-100个之间的试管，且同一梯度平行测定值相对偏差不超过10.0 %，对丁酸梭菌芽孢计数。

进一步地，步骤2）中高温处理是在80℃水浴处理10min。

进一步地，步骤1）中，所述无菌生理盐水是将8.5g氯化钠溶于1L水中，并于121℃灭菌30min后得到。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的这种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法利用芽孢杆菌类耐高温的特性，经过高温处理排除了乳酸菌类、酵母菌类、曲霉菌类的干扰；再经过分析几种芽孢类杆菌的生长特性，筛选不同的培养条件区分芽孢杆菌类产品，且不额外添加抗生素，从而实现对复合微生态产品中单一丁酸梭菌芽孢的计数，操作简单快速且计数准确。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种复合微生态产品中丁酸梭菌芽孢的计数方法，包括如下步骤：

1）样品稀释：取复合微生态产品，加入无菌生理盐水后置于室温下振荡混匀，制成菌悬液；取菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；

其中，采用的无菌生理盐水是将8.5g氯化钠溶于1L水中，并于121℃灭菌30min后得到；

2）高温处理：分别取三个稀释度的菌液于80℃水浴处理10min，去除乳酸菌类、酵母菌类、曲霉菌类的干扰，之后迅速冷却至室温备用；

3）培养及计数：取经步骤2）处理后的菌液0.50 mL接种在梭菌增殖培养基试管中，接种于液体石蜡面以下，不吹打，每支试管需更换接种枪头；将接种后的试管垂直放于试管架上，使接种后的试管冷却至室温；将试管置入30℃恒温培养箱中，厌氧培养12-15h；观察长出的单菌落，选取观察到的菌落数在30-100个之间的试管，且同一梯度平行测定值相对偏差不超过10.0 %，对丁酸梭菌芽孢计数；

其中，采用的梭菌增殖培养基试管是在每根试管中分装15 mL梭菌增殖培养基，之后覆2 cm液体石蜡，用硅胶塞塞住试管口，并于115℃灭菌20 min后得到；液体石蜡是将固体石蜡加热熔化成液体，然后放置在50℃恒温水浴锅中备用得到；

采用的梭菌增殖培养基的制备方法为：将酵母浸粉3.0 g、牛肉浸粉10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖5.0 g、可溶性淀粉1.0 g、氯化钠5.0 g、三水合乙酸钠3.0 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、琼脂粉7.0 g加入到水中，加热煮沸10 min，然后补足水至1000 mL，调pH至7.0±0.1。

本实施例中复合微生态产品经过80℃水浴处理10min后乳酸菌类、酵母类、曲霉菌类、丙酸杆菌类、红假单胞菌类已失活，故步骤2）理后只需要对余下的几种芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、丁酸梭菌）进行检测；之后通过梭菌增殖培养基试管在30℃恒温培养箱中培养12-15h，将丁酸梭菌与其他芽孢杆菌区分开，从而实现对单一丁酸梭菌芽孢计数。

实施例2

本实施例考察不同培养条件对几种芽孢杆菌生长的影响。选用市场上标识1000亿枯草芽孢杆菌、1000亿地衣芽孢杆菌、200亿凝结芽孢杆菌、100亿侧孢芽孢杆菌、100亿短小芽孢杆菌、50亿迟缓芽孢杆菌和100亿丁酸梭菌，分别在实施例1中提供的梭菌增殖培养基上于30℃培养不同时间，其结果如表1所示。

由表1可以看出，6种芽孢杆菌在30℃培养箱中培养12h均未生长，继续培养至24h后，培养基与石蜡油交接处有少量菌落，但丁酸梭菌在30℃培养箱中培养12h生长良好，均匀分布于试管内，便于计数，且继续培养后产气严重但菌数未见增多；由此可见，6种芽孢杆菌和丁酸梭菌在本发明提供的梭菌增殖培养基上，30℃培养12h时生长差异显著，故经过实施例1的步骤3）培养后的试管中仅有丁酸梭菌芽孢生长。

实施例3

选取实施例2中的几种芽孢杆菌产品（1000亿枯草芽孢杆菌、1000亿地衣芽孢杆菌、200亿凝结芽孢杆菌、100亿侧孢芽孢杆菌、100亿短小芽孢杆菌、50亿迟缓芽孢杆菌、100亿丁酸梭菌）按照不同比例进行复配，且丁酸梭菌的添加量远大于其他几种芽孢杆菌的添加量；其中，丁酸梭菌9.4g，地衣芽孢杆菌0.1g，枯草芽孢杆菌0.1g，凝结芽孢杆菌0.1g，侧孢芽孢杆菌0.1g，短小芽孢杆菌0.1g，迟缓芽孢杆菌0.1g，总质量10.00g；采用本发明提供的梭菌增殖培养基，在30℃培养12h，测得该复合产品中的丁酸梭菌的检测结果为101亿CFU/g。

实施例4

选取实施例2中的几种芽孢杆菌产品（1000亿枯草芽孢杆菌、1000亿地衣芽孢杆菌、200亿凝结芽孢杆菌、100亿侧孢芽孢杆菌、100亿短小芽孢杆菌、50亿迟缓芽孢杆菌、100亿丁酸梭菌）按照不同比例进行复配，且丁酸梭菌的添加量远低于其他几种芽孢杆菌的添加量；其中，丁酸梭菌0.1g，地衣芽孢杆菌1.65g，枯草芽孢杆菌1.65g，凝结芽孢杆菌1.65g，侧孢芽孢杆菌1.65g，短小芽孢杆菌1.65g，迟缓芽孢杆菌1.65g，总质量10.00g；采用本发明提供的梭菌增殖培养基，在30℃培养12h，测得该复合产品中的丁酸梭菌的检测结果为95亿CFU/g。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。