一种ERG基因mRNA表达检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及一种ERG基因表达检测试剂盒及其检测方法；包括检测ERG基因表达的引物、探针，该引物、探针能够检测ERG基因表达水平，灵敏度高，特异性强；包括ERG基因表达检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测ERG基因表达水平；本发明还提供了使用上述试剂盒检测ERG基因表达的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性强，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及到一种ERG基因表达检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生、分化受阻、凋亡受抑制并造成正常血细胞减少为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。大约45％的急性髓系白血病患者在常规染色体核型分析时检测不到染色体畸变，为正常核型，但这种亚型的患者在分子遗传变异和治疗效果上存在异质性。亚显微上的遗传学损伤不仅与疾病的发病机制有关，还影响其治疗反应性和生存率。在正常核型急性髓系白血病(CN-AML)中常见的分子畸变有核磷蛋白(NPM)基因突变和fms样酪氨酸激酶3(FLT3)基因内部串联重复(ITDs)。在低比例的CN-AML患者中也发现其他分子异常，包括预示良好预后的CEBPA(CCAAT/增强子结合蛋白α)基因突变以及MLL基因部分串联重复(MLL-PTDs)。近来，利用实时定量PCR技术测定出一些基因(ERG，BAALC等)表达水平定量上的差别，为CN-AML的预后提供了重要的信息。然而，这些危险因素间的相互关系和相对重要性研究还较为少见。

ETS相关基因ERG(ETS related gene，ERG)是定位于染色体21q22上的原癌基因，是ETS基因家族成员之一，多数为信号转导通路下游靶基因，调节和促进细胞分化、增殖和组织转移。ERG基因参与多种染色体重排，在AML中发现t(16；21)(p11；q22)易位形成的FUS/TLS—ERG融合基因和t(X；21)(q25-26；q22)易位形成的ELF4/ERG融合基因。在一例伴有复杂核型异常的AML中也发现ERG基因的过度表达，此例患者预后不良，预示ERG基因的表达异常可能与AML的恶性表型有关。Marcucci等应用实时定量RT-PCR的方法检测了患者ERG的基因表达情况，研究表明高表达ERG基因的患者累积复发率和总体生存率均低于ERG低表达者。可能预示ERG基因高表达复发率高、完全缓解率低、生存期短。

我们利用荧光定量PCR技术联合检测一组具有典型特征的AML患者ERG基因的转录水平，从而探讨ERG基因表达水平与AML预后的关系，为这部分患者进一步精细分型进而分层治疗提供新的理论依据。

发明内容

本发明提供了检测ERG基因表达的mRNA的引物及其相对应的探针。该引物、探针能够检测ERG基因表达水平，灵敏度高，特异性强。

本发明还提供了一种ERG基因表达检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测ERG基因表达水平。

本发明还提供了使用上述试剂盒检测ERG基因表达的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

本发明包括如下内容：

所述的检测试剂盒包括针对ERG基因mRNA的引物及其相对应的探针，所述的引物如下：

ERG-F：CGTCCCTCAGCAGGATTGG

ERG-R：CCCACCATCTTCCCGCCTT

所述的检测探针如下：

ERG-P：FAM-CCCAGCCAGGGTCACCATCAAAA–TAMRA。

优选地，所述的检测试剂盒包括针对ERG基因mRNA和内参ABL基因mRNA检测的引物以及探针，所述的检测引物如下：

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA

所述的探针如下：

ABL-P:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

优选地，所述的ERG基因表达检测试剂盒包括ERG基因探针引物混合液、酶混合液、阴性对照品、阳性对照品；

所述的ERG引物探针混合液中0.25-0.8uM引物、0.25-0.8uM探针；

所述的酶混合液包括逆转录酶、DNA聚合酶、0.25mMdNTP、3mM MgCl2、PCR buffer；

所述的阴性对照品为灭菌超纯水；

所述的阳性对照品为体外转录的ERG基因、ABL基因片段RNA混合液。

一种检测ERG基因表达的方法，所述的检测方法包括使用ERG基因表达的引物、探针或检测ERG基因表达的试剂盒检测ERG基因表达的步骤；

所述检测方法采用荧光定量PCR技术进行ERG基因表达的检测，具体步骤如下：

步骤一、提取待检的肿瘤样本RNA，作为检测模板；

步骤二、体系配制：根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联PCR反应管；

步骤三、分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中；

步骤四、进行荧光定量PCR检测，扩增程序为：95℃预变性1分钟；95℃变性25秒，58℃退火35秒收集荧光信号，40循环；

步骤五、检测结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数：

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：阳性判断标准：Ct<29，为阳性；29≤Ct≤37，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞37，为阴性。

本发明的具体组分见下表1：

表1

与现有技术相比，本发明有以下优点：

1、所需样本量少，使用荧光PCR技术进行检测，含有内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行检测，确保结果真实可信；

2、较IHC更加敏感可靠，可以连续定量检测RNA，实现自动化、人为误差较小，且操作简便、经济省时、可批量操作，结果判读简单客观，便于分析，比IHC方法更具优越性。

附图说明

图1为本发明实施例3中正常样本检测表达曲线演示图。

图2为本发明实施例3中白血病样本检测表达曲线演示图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1一种检测ERG基因表达的试剂盒

根据目标基因ERG基因序列设计特异性引物，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。具体引物如下所示：

ERG-F：CGTCCCTCAGCAGGATTGG

ERG-R：CCCACCATCTTCCCGCCTT

ERG-P：FAM-CCCAGCCAGGGTCACCATCAAAA–TAMRA

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA

ABL-P:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

本发明提供的一种ERG基因表达检测试剂盒包含以下四组分，分别为：

ERG引物和探针混合液：包含用于检测ERG和ABL基因表达的特异性引物和探针。引物和探针为如上所述ERG-F、ERG-R、ERG-P、ABL-F、ABL-R和ABL-P序列。

酶混合液：包括逆转录酶、DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl2和dNTPs。

阳性对照品：为体外转录的ERG基因和ABL基因片段RNA混合液；阴性对照品为灭菌超纯水。

实施例2ERG基因表达检测方法

采用本发明实施例1的试剂盒检测ERG基因表达，包括以下步骤：

(1)待测样本处理和模板提取；

取石蜡包埋肿瘤组织按照提取试剂盒说明书提取RNA。提取的RNA稀释到20ng/μL后作为PCR扩增模板。

(2)体系配制将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制PCR反应混合液(见表2)。

表2PCR反应液配制公式

将PCR反应工作液按20μL/孔加入到PCR反应管，将待检样本RNA、阳性对照品和阴性对照品分别以5μL/孔加入到对应PCR反应管中，进行PCR扩增。

(3)PCR扩增

PCR扩增程序见表3

表3PCR扩增程序

(4)结果判定

将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：Ct<29，为阳性；29≤Ct≤37，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞37，为阴性。

实施例3采用本发明所述检测方法检测临床标本

取待检的白血病临床样品和正常对照各40例，按实施例2所述方法提取总RNA、配制试剂并检测。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照，检测时间仅为100分钟。

表4 40例正常和白血病样本ERG和ABL mRNA Ct值比较

通过分析，发现白血病样本和正常样本在内参Ct值基本相同情况下(目前ABL Ct在26左右)，白血病样本的Ct明显低于正常样本P<0.01。说明白血病样本与正常样本比较，ERG mRNA表达明显升高。

序列表

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgtccctcag caggattgg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cccaccatct tcccgcctt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cccagccagg gtcaccatca aaa 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gatacgaagg gagggtgtac ca 22

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ctcggccagg gtgttgaa 18

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<212> DNA

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gcttctgatg gcaagctcta cgtctcct 28