NMI蛋白作为生物靶标在制备成人社区获得性肺炎严重程度及预后评估试剂盒的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物标志物的免疫诊断领域，尤其涉及一种分子标志物在社区获得性肺炎(CAP)严重程度及预后评估中的应用。本发明的生物标志物为NMI，通过ELISA检测发现其在CAP患者外周血血清中有明显的表达差异，且其表达量与CAP患者的严重程度和预后有关。通过ROC曲线分析发现NMI评估CAP严重程度及其预后的效能高，较目前已有常用指标表现好。在临床应用中只需要抽取患者外周血后，即可对患者进行严重程度和预后评估，创伤性小，易于操作，更可能成为CAP患者严重程度和预后评估的有效手段。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及NMI蛋白作为生物标志物在社区获得性肺炎严重程度及预后评估中的应用。

背景技术

社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)是一种的常见的感染性疾病，因其发病率高、死亡率高而严重危害人类健康。当患者因为年龄或者其他疾病而存在免疫功能降低时，CAP可进一步发展为重症CAP，重症CAP病情进展快，并发症多，预后极差，常需入住重症监护室(ICU)治疗。即使医疗技术不断进步，应用有效的抗感染和生命支持治疗，死亡率仍高达40％。

重症CAP患者的遗漏常常导致对患者适当治疗的延迟，从而导致住院时间和死亡率的增加。对于CAP，肺炎严重程度指数(PSI)和英国胸科学会(BTS)CURB65评分是最常用的严重程度工具。但是这些评分系统需评估的条件太多不适用于临床的快速判断。生物标志物也可用于评估肺炎的严重程度。比如降钙素原(PCT)，C反应蛋白(CRP)和肾上腺髓质素(proADM)等。但是他们评估严重程度和预后的能力仍然是有限的，所以，目前急需新的生物标志物来预测CAP的严重程度和预后。

NMI是N-Myc和STAT交互蛋白，于1996年被首次发现，其基因位于染色体2q23 上，分子量为38kDa，结构可分Coiled-Coil、NID1和NID2 3个部分，通常定位于细胞质，是间接影响特定转录事件的蛋白质之一。在人类中，NMI蛋白在除大脑以外的所有胎儿组织中都检测到表达，并且其在成人脾脏、肝脏和肾脏中的表达最高。NMI 作为适配器分子广泛参与转录调控和信号转导，能在干扰素诱导后高表达，广泛参与转录调控和信号转导，发挥多种重要的生物学功能。

目前，关于NMI蛋白在多种疾病的诊断和预后评估中发挥重要作用的研究已有报道，例如：DOI为10.1111/jgh.14634的一篇由Xiong等人于2019年公开发表的文献报告与正常病人、慢性乙型肝炎病人相比，慢加急性肝衰竭病人外周血清的NMI明显表达升高，而在肝衰竭病人好转后NMI则显著下降，血清NMI水平可以作为预测肝衰竭病人生存率的生物标志物。DOI为10.1038/s41467-017-00930-9的一篇由Xiahou等人于2019年公开发表的文献报告NMI在脂多糖诱导的感染性休克中由激活的巨噬细胞释放，通过激活TLR4信号通路，促进炎症因子的释放，NMI基因的敲除可以降低脓毒血症小鼠模型的炎症反应和死亡率。同时，NMI水平在脓毒血症病人的血清中表达增高，且与患者死亡率呈正相关。但是，还没有关于NMI在判断CAP严重程度及预后的研究。

生物标志物可以用于早期辅助评估CAP患者严重程度以及评估患者的预后，指导临床医生治疗方案的制定，提高临床对CAP的治疗时效，提高患者的生存率，改善患者生活质量。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种NMI蛋白作为生物标志物在制备CAP 严重程度和预后评估试剂盒的应用。可以用于早期辅助评估成人CAP患者的严重程度和预后，指导临床医生治疗方案的制定，提高临床医师对重症CAP的识别能力，从而提高患者的生存率，改善患者预后。

NMI蛋白作为生物标志物在制备成人社区获得性肺炎严重程度及预后评估试剂盒的应用。NMI蛋白是N-Myc和STAT交互蛋白。

优选的，对评估的受试者采集的生物样品为外周静脉血血清。

更优选的，外周静脉血血清的采集时间为受试者入院24小时内。

更优选的，外周静脉血中NMI蛋白的浓度值≥55.48pg/ml时指示为死亡风险大，入住重症监护室风险大，预后不良

优选的，NMI蛋白的检测方法为酶联免疫吸附测定(ELISA)法。采用ELISA 法对外周静脉血血清中的NMI浓度进行检测，所得到的数据绘制接受者操作特性曲线(ROC)，并计算曲线下面积(AUC)，灵敏度，特异度，约登指数(灵敏度+特异度-1)，以评估其对评估CAP严重程度的效能。

优选的，评估的受试者为早期罹患社区获得性肺炎的患者。

优选的，评估的受试者为年龄>18岁的成人。

本发明特征为：

1.30天内死亡的CAP患者外周静脉血血清NMI中的表达量明显高于30天内幸存的CAP患者(p<0.001)。入住ICU的CAP患者外周静脉血血清NMI中的表达量明显高于未入住ICU的CAP患者(p<0.001)。

2.外周静脉血血清NMI评估30天内死亡的AUC值是0.91(0.86-0.96)，其灵敏度是87.10％，特异度是85.12％，约登指数是72.22％，分界值是55.48pg/ml。

3.外周静脉血血清NMI评估ICU入住率的AUC值是0.92(0.88-0.97)，其灵敏度是86.96％，特异度是88.22％，约登指数是75.18％，分界值是55.48pg/ml。

4.在外周静脉血血清NMI不同浓度分组(<25；10-50；50-100；>100pg/ml)的 CAP的患者中，其预测30天死亡率和ICU入住率的曲线有明显差异(p<0.001)。外周静脉血血清NMI浓度>100pg/ml的CAP患者死亡率高达37.5％；ICU入住率高达 62.5％。

5.在不同的PSI和CURB65评分等级中，低危组(Ⅰ≤PSI≤Ⅲ；0≤CURB65≤1)，中危组(PSI＝Ⅳ；CURB65＝2)，高危组(PSI＝Ⅴ；3≤CURB65≤5)的CAP患者外周静脉血血清NMI浓度逐渐升高且有显著差异(p<0.001)。

(三)有益效果：

本发明首次发现了外周静脉血血清NMI浓度与CAP的严重程度及预后有关，对于早期评估CAP患者的病情及判断预后提供重要的参考价值。

本发明提供了一种用于CAP严重程度和预后评估的分子标志物NMI，通过 ELISA对患者入院24小时内外周血血清中NMI的表达量进行检测，可实现对CAP严重程度和预后的早期评估。在临床应用中只需要抽取社区获得性患者外周静脉血，即可对患者的病情进行严重程度和预后评估，创伤性小，易于操作，更可能成为CAP患者严重程度和预后评估的有效手段，可以显著降低患者死亡率及医疗成本。

附图说明

图1：30天内死亡患者及未死亡患者外周静脉血血清NMI(A)含量与预测死亡 ROC(B)曲线对比。

图2：30天内入住ICU患者及未入住ICU患者外周静脉血血清NMI(A)含量与预测ICU入住率的ROC(B)曲线对比。

图3：不同浓度外周静脉血清NMI预测30天内死亡率Kaplan–Meier生存曲线 (A)及ICU入住率曲线(B)。

图4：不同PSI(A)和CURB65评分(B)等级CAP患者外周静脉血血清NMI 浓差异。

具体实施方式

下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

在以下实施例中，CAP患者的血清样本均来自于浙江大学医学院附属第二医院。

发明人收集了2019-2020年期间394例的CAP患者的血清标本。全部患者来自浙江大学医学院附属第二医院，并且获得浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会审批 (审批编号：2020-344)。随访截止为2020年10月15日。下面结合附图实施作进一步详细描述

实施例1：标本采集及基础信息采集

按照美国胸科协会/美国感染疾病协会ATS/IDSA(2007年)CAP诊断标准收集年龄>＝18岁的CAP的患者394例，且需排除罹患风湿免疫疾病、血液系统疾病及其他可能引起PCT，CRP升高的非感染性发热疾病。

收集患者入院24小时内外周静脉血血清5ml，室温放置2小时或4℃过夜后1000×g离心20分钟，抽取上清。

收集患者入院时基本信息：年龄，性别，医疗系统收集患者外周静脉血白细胞绝对值(WBC)、中性粒细胞绝对值、中性粒细胞占比(NCP)、降钙素原(PCT)、 C反应蛋白(CRP)，住院时长，是否入住ICU及30天内是否死亡等信息。

实施例2：CAP患者外周静脉血血清NMI的测定

主要仪器设备：

主要仪器设备包括酶标仪(Biotek ELX-808)、小型台式离心机(艾本德5418)、离心机(掌式SBC140-2)、旋涡振荡器(美国Vortex-2)、超纯水仪(Cascuda 1)、生化培养箱(MIR-162)。

ELISA法检测CAP患者外周静脉血血清NMI浓度：

(1)配制工作液：按照NMI ELISA kit说明书提前配制所需标准品工作液，洗涤液，生物素化抗体工作液，酶结合工作液。

(2)加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测血清加入到其他孔，每孔100μL。覆膜后37℃孵育100分钟。

(3)弃去液体，甩干，不洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀，覆膜后37℃温育1小时。

(4)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液200μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

(5)每孔加酶结合物工作液100μL，覆膜后37℃温育60分钟。

(6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。

(7)每孔加90μL底物溶液(TMB)，覆膜后37℃避光孵育15-30分钟左右。当标准孔出现明显梯度时，终止反应。

(8)采用与底物溶液的加入顺序相同的顺序加入终止液，每孔加终止液50μL，终止反应。

(9)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

(10)NMI测定：计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出标准曲线。将待测样本所测OD矫正值代入标准曲线中测得待测样本中NMI浓度。

实施例3：CAP患者基本临床特征

CAP患者基本信息统计分析：使用中位数和四分位区间描述394例CAP患者的年龄；并统计其中性别比，PSI和CURB65评分低，中，高危人数占比及30天内死亡率和ICU入住率。如表1所示，在本研究收集的394名成人CAP患者中，中位年龄是40岁，其中男性占59.64％。30天死亡率为7.8％，ICU入住率为11.7％。

表1：CAP患者临床特征统计表。

数据采用中位数(四分位区间)或个数(百分比)描述。

实施例4：NMI识别成人CAP患者严重程度及预后能力评估

30天内死亡患者及未死亡患者，入住ICU患者及未入住ICU患者外周静脉血血清NMI、PCT、CRP、WBC、中性粒细胞绝对值及NCP浓度差异统计分析：用秩和检验分析两组差异。绘制血清NMI、PCT、CRP、WBC、中性粒细胞绝对值及NCP等指标预测CAP患者30天死亡率和ICU入住率的ROC曲线，计算其最佳分界值与诊断效能指标：曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度和约登指数。

表2：外周静脉血血清NMI、PCT、CRP、WBC、中性粒细胞绝对值及NCP对CAP 患者30天死亡率及ICU入住率的评估效能统计表。

**：p<0.01，***：p<0.001，分别与血清NMI相比，使用z数据分析。

如图1所示，30天内死亡的CAP患者外周静脉血血清NMI中的表达量明显高于 30天内幸存的CAP患者(p<0.001)。如图2所示，入住ICU的CAP患者外周静脉血血清NMI中的表达量明显高于未入住ICU的CAP患者(p<0.001)。

如表2所示，通过对比外周静脉血清NMI、PCT、CRP、WBC、中性粒细胞绝对值及NCP对CAP患者30天死亡率的预测效能发现：外周静脉血血清NMI浓度评估 30天内死亡的AUC值是0.91(0.86-0.96)，其灵敏度是87.10％，特异度是85.12％，约登指数是72.22％。NMI综合预测30天死亡率的能力优于其他的指标。这说明NMI 可以有效预估CAP患者预后，可作为CAP严重度的预警指标。

如表2所示，通过对比外周静脉血清NMI、PCT、CRP、WBC、中性粒细胞绝对值及NCP对CAP患者入住ICU的预测效能发现：外周静脉血血清NMI评估ICU入住率的AUC值是0.92(0.88-0.97)，其灵敏度是86.96％，特异度是88.22％，约登指数是75.18％。NMI综合预测CAP患者入住ICU的能力优于其他的指标。这说明NMI 还可以早期判断患者治疗场所，实现及时的分层诊治。

实施例5：外周静脉血清NMI水平分层对CAP患者的30天内kaplan-meier生存曲线对比

CAP患者不同浓度外周静脉血清NMI的30天内kaplan-meier生存曲线对比统计分析：用log-rank检验来验证不同浓度生存曲线的差异。如图3所示，在外周静脉血血清NMI不同浓度分组(<25；10-50；50-100；>100pg/ml)的CAP的患者中，其预测30天死亡率和ICU入住率的曲线又明显差异(p<0.001)。外周静脉血血清NMI浓度>100pg/ml的CAP患者死亡率高达37.3％；ICU入住率高达62.5％。这也说明血清 NMI浓度越高，其30天死亡及入住ICU风险越高，从而说明血清NMI浓度可以评估 CAP患者的严重程度。

实施例6：不同PSI和CURB65评分等级的CAP患者外周静脉血血清NMI浓度对比

不同PSI和CURB65评分等级CAP患者外周静脉血血清NMI浓度统计差异分析：使用秩和检验中的Kruskal-Wallis H检验来比较多组差异，然后使用Nemenyi检验分析两组之间差异。如图4所示，在不同的PSI和CURB65评分等级中，低危组 (Ⅰ≤PSI≤Ⅲ；0≤CURB65≤1)，中危组(PSI＝Ⅳ；CURB65＝2)，高危组(PSI＝Ⅴ； 3≤CURB65≤5)的CAP患者外周静脉血血清NMI浓度逐渐升高且有显著差异(p<0.001)。这显示在目前公认的CAP严重程度评分系统里，血清NMI浓度与PSI和CURB65评分是相符的，PSI和CURB65评分严重程度越高，其血清NMI浓度也越高。这也说明 NMI可以作为CAP患者新的严重程度生物标志物。