一种白介素6冻干校准品及其制备方法与冻干保护液

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，具体公开了一种白介素6冻干校准品及其制备方法与冻干保护液。本发明的冻干保护液包括以下组分：缓冲液、海藻糖、γ‑环糊精、甘露醇、胶原蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂，所述冻干保护液的pH为7.2‑7.6；本发明的冻干保护液能稳定维持白介素6校准品的性状，韧性佳，复溶性好，还可以最大程度地保护白介素6校准品的活性，延长了白介素6校准品保存时间。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种白介素6冻干校准品及其制备方法与冻干保护液。

背景技术

白介素6(IL-6)是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种，能刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并合成提高其功能，激活的淋巴细胞、单核巨噬细胞、骨髓细胞和部分肿瘤细胞分泌IL-6，IL-6作为一种机体在免疫应答中产生的重要介质，具有多种生物学活性。

目前国内白介素6(IL-6)检测试剂盒中的校准品多为液体，IL-6抗原在液态下容易发生变性，因此可以通过加入一些保护剂(如一些蛋白、糖类及抗氧化剂等)来延长IL-6抗原在液态下的保存时间，例如中国专利文献CN110988367A公开了一种贮存剂、用于检测LH的校准品及检测试剂盒，贮存剂包括缓冲液、8-苯胺-1-萘磺酸和/或其盐、保护剂和表明活性剂，该贮存剂能稳定贮存多种抗原，延长溶液保存期限，但是液体IL-6校准品在保护剂存在的情况下放置2-8℃保质期一般为1-2周，保存时间相对较短，限制了IL-6检测试剂盒的有效期。

此外，液体IL-6校准品一般为2-8℃保存，运输过程需要使用冰袋或冷链运输，增加了运输过程的成本，同时液体状态在运输过程中有泄漏风险；并且液体IL-6抗原仅在较高浓度下稳定，当保存温度为-80℃时高浓度IL-6抗原保质期为6个月，当保存温度为-20℃时它的保质期为3个月，保质期较短。

因此，亟需一种冻干保存液及利用该冻干保存液制备白介素6冻干校准品的方法。

发明内容

本发明的第一目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种冻干保护液，本发明制备的冻干保护液最大程度地保护了白介素6校准品的活性，延长了白介素6校准品的保存时间，并且能维持白介素6校准品冻干后性状，不粘瓶、不塌陷，韧性佳，复溶性好。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种冻干保护液，其包括以下组分：缓冲液、海藻糖、γ-环糊精、甘露醇、胶原蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂，所述冻干保护液的pH为7.2-7.6。

本发明人经过大量研究及试验发现，通过海藻糖、胶原蛋白保护剂、甘露醇和γ-环糊精多种组分的复配，可以有效保持白介素6校准品的活性，冻干前后活性基本保持不变，显著提高了白介素6校准品的稳定性，有利于冻干白介素6抗原的运输，延长白介素6校准品的保存时间，延长白介素6检测试剂盒的保存时间；并且利用本发明冻干保护液制备的白介素6校准品冻干后不缩水，外观性状均一、稳定，还具有较佳的复溶性。

其中，缓冲液为冻干保护液提供一个稳定的pH环境，避免缓冲能力弱导致pH不稳定，影响蛋白质分子的活性；海藻糖具有在高温、高寒、高渗透压及干燥失水情况下在细胞表面能形成独特的保护膜，可以有效保护白介素6蛋白质分子不变性失活；甘露醇含有多个羟基作为填充剂，可以替代水与IL-6抗原的亲水基团形成氢键，更好的保护IL-6抗原的空间结构且具有保湿作用，提高了冻干后白介素6校准品的韧性，有利于维持白介素6校准品的冻干形态；胶原蛋白保护剂是一种高纯度的猪真皮胶原蛋白多肽组分，具有很好的稳定蛋白质的特性，对蛋白类的抗原具有良好的保护作用，且易溶于水；表面活性剂可以防止蛋白聚集，也可以达到增溶的效果；防腐剂对细菌和霉菌均有抑制生长作用，能够提高冻干抗原复溶后的稳定性。

作为本发明所述冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护液包括以下重量百分比计的组分：0.5％～3％海藻糖、0.5％～5％γ-环糊精、0.5％～5％甘露醇、0.2％～1％胶原蛋白保护剂、0.05％～0.1％表面活性剂和0.05％～0.1％防腐剂，余量为Tris-HCl缓冲液或HEPES-Na缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液或HEPES-Na缓冲液的浓度为10mM-50mM。。

作为本发明所述冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护液包括以下重量百分比计的组分：0.5％海藻糖、1％γ-环糊精、1％甘露醇、0.5％胶原蛋白保护剂、0.1％表面活性剂和0.1％防腐剂，余量为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM。经过活性评价和稳定性评价发现本发明冻干保护液处理的白介素6校准品冻干前后活性基本保持不变，与冻干前活性差异在5％以内，白介素6冻干校准品在37℃放置30天和开瓶4℃放置30天检测结果偏差在5％以内，因此，冻干保护液可以提高白介素6校准品的稳定性，延长白介素6校准品和白介素6检测试剂盒的保存时间；冻干后白介素6校准品的外形不缩水，不粘瓶，韧性良好，并且剩余水分较低，有利于长期保存；加入纯化水后静止10s，白介素6冻干校准品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生。

作为本发明所述冻干保护液的优选实施方式，所述胶原蛋白保护剂的制备方法如下：

S1.酶解法提取胶原蛋白：取动物皮洗净，加入纯化水加热，取出切碎，脱脂，过滤取滤渣，加入醋酸、胃蛋白酶和复合蛋白酶搅拌浸泡，酶解离心取上层清液，加入聚乙二醇6000进行胶原蛋白盐析，离心取沉淀即为胶原蛋白；

S2.纯化胶原蛋白：取步骤S1制备的胶原蛋白沸水浴加热灭酶，离心取上清液，对上清液进行纯化，截留分子量小于5kd的短肽，即为胶原蛋白保护剂。

作为本发明所述冻干保护液的优选实施方式，所述胃蛋白酶和复合蛋白酶的酶活力为2000U/mL。

作为本发明所述冻干保护液的优选实施方式，所述甘露醇，可以较好的提高冻干后的白介素6校准品的韧性，有利于维持白介素6校准品的冻干形态。

作为本发明所述冻干保护液的优选实施方式，所述表面活性剂为吐温80，所述防腐剂为KY100。

本发明的第二目的是提供了一种白介素6冻干校准品，该白介素6冻干校准品是将白介素6校准品与上述冻干保护液混合而得。

本发明的第三目的是提供了利用上述冻干保护液制备白介素6冻干校准品的方法，包括以下步骤：

A.混合：将白介素6校准品与如上述的冻干保护液混合得混合物；

B.预冻阶段：将步骤A制备的混合物置于温度为-35～-25℃的条件下冷冻2～3h；

C.升华干燥阶段：温度由-35～-25℃升温至-20～-10℃，升温时间为0.5～1h，将经过预冻阶段后的混合物置于温度为-20～-10℃条件下干燥10～12h；

D.解吸干燥阶段：温度由-20～-10℃升温至20～30℃，升温时间为2～3h，将经过升华干燥阶段的混合物置于温度为20～30℃条件下干燥3～4h；

E.将经过解吸干燥阶段后的混合物充入惰性气体，得白介素6冻干校准品。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤C中真空度小于30Pa；所述步骤D中真空度小于15Pa。

在本发明的技术方案中，制备白介素6冻干校准品的方法包含了预冻、升华干燥和解吸干燥阶段，提高了白介素6抗原的热稳定性，最大程度地保护白介素6抗原的活性，有利于冻干白介素6抗原的运输，延长了白介素6校准品和白介素6检测试剂盒的存储时间。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种冻干保护液，可以维持白介素6冻干校准品冻干后形状，不粘瓶，不塌陷，韧性较好，复溶性佳；

(2)本发明提供了一种冻干保护液，使得冻干前后的白介素6校准品活性基本保持不变，可以显著提高白介素6校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长白介素6校准品的保存时间，延长白介素6检测试剂盒的保存时间；

(3)本发明提供了一种制备白介素6冻干校准品的方法，通过真空冷冻干燥后提高白介素6抗原的热稳定性，最大程度地保护IL-6抗原的活性，延长了存储时间。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1、一种冻干保护液

一种冻干保护液，包括以下重量百分比计的组分：

0.5％海藻糖、1％γ-环糊精、1％甘露醇、0.5％胶原蛋白保护剂、0.1％吐温-80和0.1％KY100，余量为Tris-HCL缓冲液，Tris-HCL缓冲液的浓度为20mM；其中冻干保护液的pH值为7.4。

其中胶原蛋白保护剂的制备方法如下：

S1.酶解法提取胶原蛋白：取新鲜猪皮洗净，去掉猪毛，用手术刀去皮下脂肪后切成大约1cm×1cm小块，用pH7.5的磷酸盐清洗干净，再用纯化水浸泡冲洗5次，加入100mL的纯化水在水浴锅60℃加热2小时，取出切碎，称取5g至烧杯中，加入10％的NaCl浸泡搅拌1h，进行脱脂，过滤取滤渣，加入质量浓度为0.5mol/L的醋酸、胃蛋白酶(酶活力单位为2000U/mL)和复合蛋白酶(酶活力单位为2000U/mL)搅拌浸泡12小时，控制pH在2～3范围内，酶解离心，离心10min，离心速度为5000r/min，分离取上层清液，在上层清液中加入质量浓度为50％的聚乙二醇6000进行胶原蛋白盐析，离心15min(离心速度为8000r/min)取沉淀即为胶原蛋白；

S2.纯化胶原蛋白：取步骤S1制备的胶原蛋白加入10mL蒸馏水溶于锥形瓶中，放置37℃的水浴锅中开始反应，反应结束后在沸水浴中加热5min灭酶，离心取上清液，离心15min，离心速度为10000r/min，用交联葡聚糖G25脱盐柱对上清液进行纯化，截留分子量小于5kd的短肽，即为胶原蛋白保护剂。

一种冻干保护液的制备方法，将上述质量浓度的Tris缓冲液、海藻糖、γ-环糊精、甘露醇、胶原蛋白保护剂、吐温-80和KY100混合制得冻干保护液。

一种白介素6冻干校准品，将白介素6校准品与本实施例中冻干保护液混合而得。

实施例2、一种冻干保护液

一种冻干保护液，包括以下重量百分比计的组分：

0.5％海藻糖、0.5％γ-环糊精、0.5％甘露醇、0.2％胶原蛋白保护剂、0.05％吐温-80和0.1％KY100；余量为Tris-HCL缓冲液，Tris-HCL缓冲液的浓度为20mM；其中冻干保护液的pH值为7.4。

在本实施例中，胶原蛋白保护剂的制备方法与实施例1相同。

一种白介素6冻干校准品，将白介素6校准品与本实施例中冻干保护液混合而得。

实施例3、一种冻干保护液

一种冻干保护液，包括以下重量百分比计的组分：

0.5％海藻糖、0.5％γ-环糊精、0.5％甘露醇、0.2％胶原蛋白保护剂、0.05％吐温-80和0.1％KY100；余量为HEPES-Na缓冲液，HEPES-Na缓冲液的浓度为10mM；其中冻干保护液的pH值为7.4。

在本实施例中，胶原蛋白保护剂的制备方法与实施例1相同。

一种白介素6冻干校准品，将白介素6校准品与本实施例中冻干保护液混合而得。

实施例4、一种冻干保护液

一种冻干保护液，包括以下重量百分比计的组分：

1％海藻糖、2％γ-环糊精、2％甘露醇、0.5％胶原蛋白保护剂、0.1％吐温-80和0.1％KY100；余量为Tris-HCL缓冲液，Tris-HCL缓冲液的浓度为20mM；其中冻干保护液的pH值为7.2。

在本实施例中，胶原蛋白保护剂的制备方法与实施例1相同。

一种白介素6冻干校准品，将白介素6校准品与本实施例中冻干保护液混合而得。

实施例5、一种冻干保护液

一种冻干保护液，包括以下重量百分比计的组分：

50mM Tris-HCL缓冲液、3％海藻糖、5％γ-环糊精、5％甘露醇、1％胶原蛋白保护剂、0.1％吐温-80和0.1％KY100；余量为Tris-HCL缓冲液，Tris-HCL缓冲液的浓度为50mM；其中冻干保护液的pH值为7.6。

在本实施例中，胶原蛋白保护剂的制备方法与实施例1相同。

一种白介素6冻干校准品，将白介素6校准品与本实施例中冻干保护液混合而得。

实施例6、一种利用冻干保护液制备白介素6冻干校准品的方法

一种利用上述冻干保护液制备白介素6冻干校准品的方法，包括以下步骤：

A.混合：将白介素6校准品与上述的冻干保护液混合得混合物；

B.预冻阶段：将步骤A制备的混合物置于真空冷冻干燥机中温度为-30℃的条件下冷冻2h；

C.升华干燥阶段：温度由-30℃升温至-15℃，升温时间为1h，将经过预冻阶段后的混合物置于温度为-15℃条件下干燥12h，真空度小于30Pa；

D.解吸干燥阶段：温度由-15℃升温至25℃，升温时间为2h，将经过升华干燥阶段的混合物置于温度为25℃条件下干燥4h，真空度小于15Pa；

E.将经过解吸干燥阶段后的混合物充入氮气，得白介素6冻干校准品。

实施例7、一种利用冻干保护液制备白介素6冻干校准品的方法

一种利用上述冻干保护液制备白介素6冻干校准品的方法，包括以下步骤：

A.混合：将白介素6校准品与上述的冻干保护液混合得混合物；

B.预冻阶段：将步骤A制备的混合物置于真空冷冻干燥机中温度为-30℃的条件下冷冻3h；

C.升华干燥阶段：温度由-30℃升温至-15℃，升温时间为1h，将经过预冻阶段后的混合物置于温度为-15℃条件下干燥10h，真空度小于30Pa；

D.解吸干燥阶段：温度由-15℃升温至25℃，升温时间为2h，将经过升华干燥阶段的混合物置于温度为25℃条件下干燥4h，真空度小于15Pa；

E.将经过解吸干燥阶段后的混合物充入氮气，得白介素6冻干校准品。

对比例1、一种冻干保护液

与实施例1相似，区别在于，不含有胶原蛋白保护剂，其余原料与实施例1相同。

对比例2、一种冻干保护液

与实施例1相似，区别在于，不含有海藻糖，其余原料与实施例1相同。

对比例3、一种冻干保护液

与实施例1相似，区别在于，不含有甘露醇，其余原料与实施例1相同。

对比例4、一种冻干保护液

与实施例1相似，区别在于，不含有γ-环糊精，其余原料与实施例1相同。

试验例一、物理性能评价

将白介素6校准品分别与实施例1-5及对比例1-4制备的冻干保护液混合采用实施例7的制备方法制得白介素6冻干校准品，然后将分别得到的白介素6冻干校准品分别放置于2～8℃和25℃环境下保存，设置对照组采用20mM Tris-HCl缓冲液与白介素6校准品混合制得对照组白介素6校准品，按照相同冻干工艺进行冻干。其中实施例1-5及对比例1-4制备的冻干保护液同时分别采用0.5ng/mL和0.05ng/mL不同浓度进行测试，定期观察白介素6冻干校准品和对照组白介素6校准品的性状、剩余水分，见表1和表2。

表1

结论：从表1的结果可知，对照组制备的白介素6校准品冻干后易聚团，分别放置2～8℃和25℃环境下白介素6校准品聚团粘在瓶壁上；与对照组相比，本发明实施例1-5制备的白介素6校准品冻干后不缩水，冻干后性状均一，不粘瓶壁，韧性较好，瓶塞不粘样品，且在2-8℃下保存12个月或在25℃下保存8个月白介素6校准品仍然不聚团，不粘瓶，韧性较好，瓶塞不粘样品，物理性状稳定，其中以实施例1物理性状最佳。

与实施例相比，对比例1-4缺少胶原蛋白保护剂、海藻糖、甘露醇和γ-环糊精其中的一种时，物理性状稍差于实施例1-5的物理性状，对照组无外形，粘附在冻干瓶内壁。

表2

结论：实施例1-5制备的白介素6冻干校准品的剩余水分较低，且长期保存后剩余水分量变化不大，有利于长期保存。

试验例二、复溶性评价

将采用实施例1-5及对比例1-4的冻干保护液得到的白介素6冻干校准品作为实验组，采用20mM Tris-HCl缓冲液与白介素6校准品混合作为对照组，在实验组和对照组分别加入纯化水后静止10s，观察白介素6冻干校准品溶解情况，结果发现实验组的白介素6冻干校准品能够完全溶解，溶液澄清，无明显块状及泡沫产生；对比例组的白介素6冻干校准品部分出现难溶解且浑浊的现象，复溶性较差；对照组的白介素6冻干校准品溶解速度慢，且在静置10min仍可见部分絮状物产生，复溶性较差。

试验例三、活性评价

将采用实施例1-5及对比例1-4的冻干保护液得到的白介素6冻干校准品作为实验组，采用20mM Tris-HCl缓冲液与白介素6校准品混合作为对照组，检测各组冻干前后的活性，结果见表3。

表3

从表3的数据可知，对照组的白介素6冻干校准品活性明显下降，与对照组相比，本发明实施例1-5制备的白介素6校准品冻干前后活性基本保持不变，与冻干前活性差异在5％以内，而对比例1-4制备的白介素6校准品冻干后与冻干前活性差异超10％，说明本发明可以通过胶原蛋白保护剂、海藻糖、甘露醇、和γ-环糊精多种组分复配，可以有效保持白介素6校准品冻干前后的活性。

试验例四、稳定性评价

将采用实施例1-5及对比例1-4的冻干保护液得到的白介素6冻干校准品作为实验组，采用20mM Tris-HCl缓冲液与白介素6校准品混合作为对照组，将实验组和对照组的白介素6校准品在37℃放置10天和开瓶4℃放置30天检测活性。结果见表4。

表4

由表4结果可知，实施例1～5的白介素6冻干校准品与对照组相比，对照组的白介素6冻干校准品稳定性差；而本发明的白介素6校准品在不同实验组下均能保持良好的活性，具有良好的稳定性。本发明的冻干保护液显著提高白介素6校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长白介素6校准品的保存时间，延长白介素6检测试剂盒的保存时间。

综上，采用本发明的冻干保护液制备的白介素6冻干校准品不缩水、不塌陷；冻干形状均一、稳定；不粘瓶；韧性较好；瓶塞不粘白介素6冻干校准品；且加入纯化水后静止10s，白介素6冻干校准品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生；白介素6校准品冻干前后活性基本保持不变；可以显著提高白介素6校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长白介素6校准品的保存时间，延长白介素6检测试剂盒的保存时间。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。