一种前列腺癌患者的预后评估系统及其应用

摘要

本发明提供一种前列腺癌患者的预后评估系统及其应用，涉及生物医学技术领域。所述评估系统包括检测aDC、Angiogenesis、CSF1 Response、GRANS、HCK、Lymphocyte‑Specific Attractor、Neutrophils、NK CD56 bright cells、NK CD56 dim cells、Macrophages、Pro‑inflammatory、Proliferation、Stromal cell和ZMYND10 Metagene 14个免疫相关特征基因集合的系统和PCIPI。本发明克服了现有技术的不足，通过建立PCIPI，确定PCIPI与患者无复发生存期(RFS)、肿瘤浸润的免疫细胞和突变负荷之间的关联，有助于解释免疫疗法耐药性产生的潜在机制，便于对前列腺癌患者的临床治疗进行指导。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种前列腺癌患者的预后评估系统及其应用。

背景技术

前列腺癌是全球男性群体中第二常见的癌症，也是男性第五大主要死因。但是，目前可用的癌症分类系统无法对前列腺癌患者的预后进行准确预测，且无法指导临床医师对患者的治疗。因此，我们旨在建立一种基于免疫细胞/免疫应答行为特征的评估系统，使其能够用于预测患者的预后及对免疫疗法的应答情况。

前列腺癌免疫预后指数(PCIPI)是用于评估前列腺癌无复发生存率的有前景的生物学分型系统。高PCIPI的患者可能会受益于抗PD-1/PD-L1免疫疗法。近来，越来越多的研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)与多种癌症的预后和进展相关。了解前列腺癌中TILs的浸润和活性情况，有助于泌尿科医生/肿瘤科医生了解患者的预后和制定针对性的免疫治疗方案，所以确定PCIPI对前列腺癌患者的临床治疗至关重要。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种前列腺癌患者的预后评估系统及其应用，通过建立PCIPI，确定PCIPI与患者无复发生存期(RFS)、肿瘤浸润的免疫细胞和突变负荷之间的关联，有助于解释免疫疗法耐药性产生的潜在机制，便于对前列腺癌患者的临床治疗进行指导。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种前列腺癌患者的预后评估系统，所述评估系统包括检测aDC、Angiogenesis、CSF1 Response、GRANS、HCK、Lymphocyte-Specific Attractor、Neutrophils、NK CD56bright cells、NK CD56 dim cells、Macrophages、Pro-inflammatory、Proliferation、Stromal cell和ZMYND10 Metagene 14个免疫相关特征基因集合的系统。

优选的，所述评估系统包括确定前列腺癌免疫预后指数PCIPI，所述PCIPI为将14个免疫相关基因集合aDC、Angiogenesis、CSF1Response、GRANS、HCK、Lymphocyte-SpecificAttractor、Neutrophils、NK CD56 bright cells、NK CD56 dim cells、Macrophages、Pro-inflammatory、Proliferation、Stromal cell、ZMYND10 Metagene的NES得分相加，即PCIPI的获取公式为

其中NES

一种前列腺癌患者的预后评估系统在预测PD-1/PD-L1治疗疗效中的应用。

优选的，所述应用方式为通过权利要求2中所得的PCIPI对一组前列腺癌患者分组为PCIPI-HIGH组和PCIPI-LOW组，确定其中PCIPI-HIGH组相较于PCIPI-LOW的患者更受益于抗PD-1/PD-L1免疫疗法。

一种前列腺癌患者的预后评估系统在对前列腺癌患者治疗后无复发生存期预测的应用。

优选的，所述应用方式为通过联合权利要求2中所得的PCIPI和临床病理特征对前列腺癌患者分为高危和低危，确定其中高危前列腺癌患者无复发生存率差。

本发明提供一种前列腺癌患者的预后评估系统及其应用，与现有技术相比优点在于：

(1)本发明揭示了PCIPI与前列腺癌患者RFS、肿瘤浸润的免疫细胞和突变负荷之间的关联，有助于解释免疫疗法耐药性产生的潜在机制；

(2)本发明PCIPI可作为评估前列腺癌患者RFS的可靠分型系统，对前列腺癌患者的预后临床治疗进行指导；

(3)本发明PCIPI分型系统可有效预测患者的RFS结局，此外，PCIPI-HIGH亚组的患者可能更易受益于抗PD-1/PD-L1免疫治疗，联合PCIPI分型系统与临床病理特征，可提高RFS的预测效能，有助于推动前列腺癌患者的个体化治疗。

说明书附图：

图1-14为本发明中Meta分析发现8个队列中存在14个与患者无复发生存率相关的免疫指标(P≤0.01)示意图；

图15为本发明中14种免疫相关标记构建的PCIPI系统可预测前列腺癌患者的无复发生存率关系图，其中：(A)流程图显示了当前研究的总体设计；生存分析显示，TCGA-PRAD；(B)AHMU-PC、(C)GSE116918(D)和GSE46602(E)队列中高PCIPI和低PCIPI亚组患者的生存差异；(F)荟萃分析显示PCIPI在8个队列中的总体预后价值；(G)热图显示了TCGA-PRAD和AHMU-PC队列中14种与无复发生存率相关的免疫特征标准化富集得分(NES)；TCGA-PRAD队列(H)和AHMU-PC队列(I)中PCIPI和ImmuneScore的相关性；TCGA-PRAD研究组(J)和AHMU-PC研究组(K)中PCIPI与TumourPurity的相关性；(L)PCIKPI与MSKCC、GSE70770、GSE46602和GSE116918队列中的免疫指标之间的相关性；(M)TCGA-PRAD队列中PCIPI与TILs(肿瘤浸润免疫细胞)浸润之间的相关性；(N-O)PCIPI-HIGH亚组中的显著富集的信号通路；

图16为本发明TCGA-PRAD和AHMU-PC队列中14个免疫指标的标准化富集得分(NES)柱形图；

图17为本发明PCIPI显示免疫细胞的浸润差异示意图：(A)28个免疫细胞在7个队列的PCIPI-HIGH和PCIPI-LOW亚组中浸润差异；(B)AHMU-PC队列中7个特殊免疫细胞的浸润差异；(C)免疫组化染色验证了AHMU-PC队列中免疫细胞的浸润差异；

图18为本发明PCIPI和免疫检查点表达以及免疫疗法疗效显著相关示意图：(A)PCIPI和66个免疫检查点表达之间的相关性；(B)PCIPI-HIGH组中观察到PD-L1的表达量增加；(C)PD-1/PD-L1疗法对PCIPI-HIGH组患者疗效更佳；

图19为本发明基因拷贝数变异(Copy number variation,CNV)在PCIPI-HIGH、PCIPI-LOW亚组间的分布差异示意图：在臂端(A)和交点(B)均发现CNV的扩增和缺失增加；观察到PCIPI-HIGH(C)和PCIPI-LOW(D)组的基因突变；(E)TP53野生型和突变亚组中PCIPI的差异；(F)PCIPI-High和PCIPI-LOW组突变位点分布。PCIPI，前列腺癌的免疫预后指数；

图20为本发明PCIPI能区分分子亚型并完成精确预后预测示意图：(A)PCIPI亚型与不同免疫亚型的冲积图；(B)四种免疫亚型无复发生存的Kaplan-Meier曲线；(C)PCIPI将C3免疫型患者区分为高风险和低风险亚组；(D)在PCIPI-HIGH组中观察到Th1和Th17细胞的浸润显著增加；(E)PCIPI亚型、LumA、LumB和基础分子亚型的冲积图；(F)LumB-PCIPI-HIGH亚组的无复发生存率最低；

图21为本发明PCIPI与集成IPICPS的限制性平均生存曲线(RMS)：图中各点表示相应PCIPI与IPICPS的RMS时间；RMS曲线在所有IPICPS队列中均显示出较大斜率，这表明使用IPICPS可以更好地预测患者生存率；PCIPI和IPICPS的C指数也在图中得以显示；P值表示两个模型间在C指数方面的差异。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

PCIPI的确立：

(1)患者及其临床特征的收集：

收集69名在安徽医科大学第一附属医院泌尿外科(AHMU-PC队列)接受前列腺癌根治术的患者的福尔马林固定后的石蜡包埋组织，并从电子病案中获取了每位患者的病理信息，定期随访，随访终点为生化复发(BCR)，其定义为前列腺癌根治术后6-13周，患者前列腺特异性抗原(PSA)水平升高并大于0.2ng/mL，且在之后的随访检查中维持在较高的水平；且所有涉及和测试程序均按照赫尔辛基宣言II进行并经过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批准号：PJ2019-09-11)，并从公共数据库中获取了1,307名前列腺癌患者的临床及随访信息以及其基因表达谱，其中包括前列腺癌癌症基因组图集(TCGA-PRAD)队列中的495名患者，斯隆-凯特琳纪念癌症中心(MSKCC)的140名患者，GSE116918中的248名患者，GSE70770中的203名患者，GSE25136中的79名患者，GSE46602中的36名患者以及GSE54460中的106名患者，不同数据集的人口统计学和临床特征见下表1：

表1：不同队列数据的测序平台和来源

HTSeq-Count:high-throughput sequencing

(2)RNA提取和测序：

RNA提取所用Neasy FFPE试剂盒由德国QiagenR生产，依据其说明书中的实验方法从FFPE样品中提取总RNA；所提取RNA的质量通过Nanodrop(OD260/280，Thermo FisherScientific，MA，美国)评估，并通过Agilent 2100生物分析仪(Agilent，CA，USA)进一步分析；获取总RNA后，首先去除其中的核糖体RNA，然后将其裂解为250-300bp的短片段；并使用这些短片段RNA作为模板，随机寡核苷酸作为引物合成cDNA的第一条链；随后，在DNA聚合酶I的作用下，以dNTPs(dUTP，dATP，dGTP和dCTP)为原料合成cDNA的第二条链；纯化后，将双链cDNA末端修复并与Poly-A尾连接进行测序。使用AMPure XP磁珠分选出200bp的cDNA片段；使用USER酶降解含U的cDNA的第二条链，并进行PCR扩增以获得基因文库。获取基因文库后，使用Qubit 2.0进行初步定量，将基因文库稀释至1.5ng/uL，然后使用Agilent 2100生物分析仪检测文库的插入片段大小；文库通过检查后，根据基因文库的有效浓度和数据输出要求，在合并后进行Illumina PE150测序；随之通过原始数据的预处理，读取比对，质量控制，转录组重建和表达定量等过程，获得最终表达矩阵。

(3)基因表达谱的数据预处理：

对上述纳入的8项队列研究的数据进行了去批次和标准化处理。所有基因的表达谱都将以每千碱基每百万片段的转录本(Transcripts Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads，TPM)值形式展示。同时，对于TPM值小于1的基因都将被剔除。

(4)收集免疫细胞特征和基因集富集分析(GSEA)：

为进行前列腺癌患者免疫相关因素分析，通过文献检索，选取至少出现过一次的相关基因，并对其中重复出现的基因进行合并，最终获得了65个免疫相关的特征基因。使用R包“clusterProfiler”执行基因集富集分析(GSEA)，使用“GSVA”R包实现单样本基因集富集分析(ssGSEA)。计算出了来自八个队列的每个样本中65个免疫相关特征的标准化富集得分(NES)。

(5)PCIPI的确立：

搜索并整理上述65种与肿瘤相关的免疫浸润/免疫反应特征基因集合。通过单变量Cox回归分析和荟萃分析方法发现了14个显著性的免疫相关特征集合(所有P<0.01的特征集合，如图1-图14所示)，且免疫相关特征集合分别为aDC、Angiogenesis、CSF1Response、GRANS、HCK、Lymphocyte-Specific Attractor、Neutrophils、NK CD56 brightcells、NK CD56 dim cells、Macrophages、Pro-inflammatory、Proliferation、Stromalcell和ZMYND10 Metagene。通过将上述14个重要的免疫相关信号的归一化富集得分(normalized enrichment score，NES)相加，得到PCIPI，其PCIPI的计算公式为：

其中，NES

通过公式计算获得了8个研究队列(共1,376例)中每位患者的PCIPI如表1-2和图15A所示：

表2：纳入数据的临床和病理特征

其中：*Lack of Gleason score：3 in AHMU-PC，4 in GSE70770，2in MSKCC，2inGSE25136，8in GSE46602，1in GSE54460；

#Lack of PSA value：57in TCGA-PRAD，1in AHMU-PC，3in GSE70770,2in MSKCC，3in GSE54460；

荟萃分析表明，高PCIPI是前列腺癌RFS的危险因素[风险比(HR)＝1.86，95％CI：1.52-2.29，P<0.05，如图15B-F]。

实施例2：

PCIPI系统在调整主要临床病理特征方面的预测性检测：

(1)筛选上述HR值大于1.5的队列，进行了多元Cox回归分析；发现，在TCGA-PRAD、AHMU-PC、GSE116918和GSE70770这四个队列中，PCIPI是前列腺癌患者的独立预后因素(如下表3所示)；

(2)采用限制性平均生存时间(restricted mean survival time，RMS)比率来比较不同PCIPI亚组患者的RFS结局，四个数据集的比率均在0.63至0.89之间(如下表4所示)，即预测结果较为稳定；

(3)在TCGA-PRAD和AHMU-PC队列中，PCIPI-HIGH(高评分)亚组中aDC、血管生成、巨噬细胞、NK细胞和促炎信号的NES增加(P<0.05，图15G和图16所示)。

表3：PCIPI在4项队列中可作为无复发生存率预测的独立预测因子

其中：*P<0.05；PCIPI:prostate cancer immune prognostic index；HR：hazardratio；95％CI：95％confidential interva；PSA：prostate-specific antigen。

表4：PCIPI亚群在不同队列中的限制平均生存(RMS)时间差异

由上结果表明，新定义的PCIPI分型系统能够预测前列腺癌患者的RFS，且可反映前列腺肿瘤局部的免疫浸润状态。

实施例3：

进一步评估PCIPI是否指示前列腺癌患者的免疫浸润状：

(1)评估上述确定的PCIPI与Yoshihara等人定义的免疫评分和肿瘤纯度的相关性，在TCGA-PRAD和AHMU-PC组中，PCIPI与Immune Score呈显著正相关(所有P<0.001，如图15H-I)，且与肿瘤纯度呈负相关(所有P<0.001，图15J-K)；在MSKCC、GSE70770、GSE46602和GSE116918队列中，得到了相似的结果(如图15L)；

(2)通过HE染色证实TILs浸润丰度，证实这些细胞浸润程度与TCGA-PRAD队列中的PCIPI评分呈正相关(P<0.001，如图15M)；

(3)还进行了GSEA分析，比较TCGA-PRAD队列中PCIPI-HIGH和PCIPI-LOW(低评分)两组，发现PCIPI-HIGH亚组中趋化因子信号通路(图15N)、B细胞受体信号通路(图15O)、T细胞受体信号通路等显著富集；

(4)比较PCIPI-HIGH组和PCIPI-LOW组28个免疫细胞的浸润情况；如图17A所示，PCIPI-HIGH组7个队列中大多数免疫细胞的浸润丰度较高；

(5)比较AHMU-PC队列中PCIPI-HIGH和PCIPI-LOW亚组之间免疫细胞的浸润，观察到PCIPI-HIGH组CD8+T细胞、巨噬细胞、Th1细胞和Th17细胞的浸润显著增加(所有P<0.05，图17B)；

(6)为了验证不同免疫细胞的浸润，使用福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixedparaffin-embedded，FFPE)组织切片对来自AHMU-PC队列的组织中的特定标记物进行了评估，这些组织来自于10个PCIPI-HIGH患者和10个PCIPI-LOW患者(如图17C)；PCIPI-HIGH组CD8阳性细胞(P＝0.0271)和CD163阳性(巨噬细胞特异性标志物)免疫细胞(P＝0.0208)高度丰富。

此外，与PCIPI低组相比，PCIPI高组IFN-γ(P＝0.1635)和IL-17A(P＝0.7113)染色呈增加趋势。

实施例4：

验证PCIPI分型系统能够作为评估患者是否受益于抗PD-1/PD-L1免疫治疗的预测指标：

(1)免疫检查点阻断疗法已被美国食品和药品管理局(Food and DrugAdministration,FDA)批准用于多种肿瘤的治疗。本发明中，评估了PCIPI和66个免疫检查点表达之间的关联，如图18A所示，PCIPI与7个队列中大多数免疫检查点的表达呈正相关，特别是PD-L1(CD274)；

(2)上述评估中7个队列中有5个队列观察到PD-L1与PCIPI呈正相关，在这5个队列中，PCIPI-HIGH亚组PD-L1的mRNA表达高于PCIPI-LOW亚组(TCGA-PRAD：P<0.001；GSE116918：P＝0.004；GSE70770：P<0.001；MSKCC：P<0.001；AHMU-PC：P＝0.066，图18B)；

(3)预测上述五个队列中PCIPI分组与抗PD-1/PD-L1和抗CTAL-4免疫治疗的反应，结果表明，PCIPI-HIGH亚组患者更佳受益于抗PD-1/PD-L1免疫治疗相较于PCIPI-LOW亚组患者(所有五个队列，Bonferroni校正P<0.05，图18C)。

上述结果表明，PCIPI分型系统能够作为评估患者是否受益于抗PD-1/PD-L1免疫治疗的预测指标。

实施例5：

肿瘤组织的拷贝数变异(copy number variation，CNV)和体细胞突变(Somaticmutation)影响免疫激活/抑制和患者对免疫治疗的反应：

(1)PCIPI-HIGH亚组患者在Arm-level(图19A)和Focal-level(如图19B)中CNV的变异水平均较高；在频繁突变的基因中，TP53(16％)、SPOP(11％)、TTN(10％)、KMT2D(7％)和FOXA1(6％)是PCIPI-HIGH组中最常见的5个突变基因(如图19C)，而SPOP(11％)、TTN(11％)、TP53(7％)、FOXA1(7％)和SPTA1(5％)是PCIPI-LOW组中突变最多的5个基因(如图19D)。

(2)上述两组间TP53基因的突变差异显著(16％vs.7％，费舍尔精确检验P＝0.0017)；此外，具有TP53突变患者的PCIPI值高于无TP53突变的患者(P＝0.034，图19E)；且大多数突变位于TP53的DNA结合区(图19F)。

上述结果表明，TP53突变与前列腺癌激活的免疫微环境密切相关，突显了TP53在调节免疫治疗反应中的潜在作用。

实施例6：

一：对前列腺癌患者RFS的预测效果

(1)在比较了4种免疫亚型患者的RFS结果后，发现C3亚型患者的生存率最高(P＝0.0026，图20A-B)。

(2)在对C3亚型进一步的比较发现，相较于PCIPI-LOW的患者，PCIPI-HIGH患者预后显著变差(P＝0.062，图20C)。

(3)研究发现Th1和Th17细胞的高浸润是C3亚型的标志，而在本研究的C3亚型中，PCIPI-HIGH亚组中Th1和Th17细胞浸润显著高于PCIPI-LOW亚组(均P<0.05，图20D)。

(4)比较PCIPI亚组与三个PAM50亚组的相关性，结果表明Basal亚型与高PCIPI亚型相关联，而LumB亚型与低PCIPI亚型相关联(图20E)；Kaplan-Meier生存分析显示PCIPI-HIGH和LumB亚型的患者预后最差(P<0.001，图20F)。

综上所述，基于6种泛癌免疫亚型的PCIPI与PAM50系统结合的预后方法提高了对前列腺癌患者RFS的预测效果。

二：进一步提高预后预测的准确性

(1)基于多元Cox回归分析所得系数将PCIPI与纳入研究的临床病理变量相结合；发现与PCIPI相关的免疫预后指数临床病理学特征(Immune Prognostic Index-clinicopathological Signature，IPICPS)的连续形式可显著提升RFS的预测能力(C指数：TCGA-PRAD组：0.731vs.0.598，P<0.001；AHMU-PC组群：0.712vs.0.534，P<0.001；MSKCC队列：0.850vs.0.605，P<0.001；GSE46602队列：0.770vs.0.631，P＝0.002；图21)。

(2)在GSE25136和GSE70770队列中也观察到预测效能的改善，然而在GSE116918队列中无显著差异。

综上所述，结合PCIPI系统与临床病理特征，可显著提高前列腺癌患者RFS的预测准确率。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。