一种通过酶解化学键提高碱提叶属生物质蛋白质的乳化性的方法及其作为乳化剂的应用

摘要

本发明提供了一种通过酶解化学键提高碱提叶属生物质蛋白质的乳化性及其作为乳化剂的应用，本发明是将叶属生物质细胞壁中提取的蛋白质产物，经胃蛋白或碱性蛋白酶降解后，乳化性大幅度增强，可以作为乳化剂应用在食品加工中，其乳化效果高于蛋清蛋白质乳化剂。将经酶解后的碱提叶属生物质蛋白质加入至乳化香肠中，具有提高其乳化能力的效果，且具有良好的风味，火腿肠的质构特性得到很好的改善；将经酶解后的碱提叶属生物质蛋白质乳化剂应用于蛋糕加工过程中代替蛋清蛋白质，可提高产品质量，降低生产成本，节约烘烤时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质乳化剂，更涉及一种碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质作为乳化剂在食品加工中的应用。

背景技术

蛋白质类乳化剂在食品工业中应用广泛，如蛋糕制作、乳化香肠加工和奶酪生产工业对蛋白质类乳化剂的消耗量较大，故扩展蛋白质的来源有益于食品工业发展。自然界的叶生物质中均含有蛋白质，仅茶工业的副产物茶渣中，就含有20%~30%的蛋白质。研究茶渣蛋白质的提取技术并提高蛋白质乳化性，有利于提高叶属生物质蛋白质的价值、扩大蛋白质类乳化剂的来源范围、促进现代食品工业绿色可持续发展。

叶蛋白广泛存在于叶生物质的细胞壁及细胞内。细胞内的蛋白被细胞壁所保护，而温和的提取条件无法高效地破坏细胞壁结构，细胞中释放出来的蛋白有限。故当前叶类生物的蛋白质提取主要采用碱法。碱法提取的叶属生物质蛋白产率最大，得到的蛋白产物是以蛋白质、多酚和多糖为主的复合物。但碱提得到的蛋白乳化性较差，猜测复合物中蛋白质、多酚和多糖的分布状态影响了蛋白质的乳化性，为提升叶属生物质蛋白作为乳化剂的价值，需要改变这一状态。

将复合物中大分子降解为小分子可以改变三者提取后的结合状态，而酶解是一种可以专一、精准降解底物的方法。也有研究表明，水解大豆分离蛋白有利于提高大豆分离蛋白的乳化性。为使降解后蛋白产物的乳化性提高，需使用降解后提高蛋白质溶解性或降解得到大量具有乳化活性的多肽，故能够降解蛋白肽键和蛋白质疏水基团的蛋白酶可以大幅提升蛋白质的乳化性。使用酶法降解碱提的叶属生物质蛋白质，可使叶属生物质蛋白质的乳化性更接近商业用蛋白质乳化剂。

以叶类为原料生产蛋白质不受季节限制，数量丰富，是一种绿色资源，尤其碱法提取得到的叶属生物质蛋白质产率最高。而且少有人以叶类为原料生产蛋白质，未见碱法提取结合酶法降解得到叶属蛋白质乳化剂的方法，更未将从叶属生物质中提取的蛋白质作为乳化剂剂实际应用在食品工业中。

发明内容

针对上述不足，本发明旨在提供一种通过酶解的化学键提高碱提叶属生物质蛋白质的乳化性及其作为乳化剂的应用，这一乳化剂来源不受季节性限制，提取方法简单。

本发明的目的包括提供通过对碱提叶属生物质蛋白质进行酶解后可明显提高其乳化能力，使其作为乳化剂应用在食品工业中。

本发明的目的包括提供通过在乳化香肠中加入碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质作为乳化剂的应用，代替部分原料肉，火腿肠的质构特性得到很好的改善。

本发明的目的还包括提供通过在蛋糕制作中加入碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质作为乳化剂代替蛋清的应用，可提高产品质量，降低生产成本，节约烘烤时间。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种通过酶解化学键提高碱提叶属生物质蛋白质乳化性的方法，具体为利用蛋白酶水解经碱法提取的叶属生物质蛋白质，提高叶属生物质蛋白质的乳化能力；所述蛋白酶包括用于水解酸性氨基酸或疏水氨基酸肽键的蛋白酶；所述疏水氨基酸包括芳香族氨基酸。

所述蛋白酶包括胃蛋白酶、碱性蛋白酶。

所述叶属生物质包括原生生物界的微藻，植物界被子植物门的双子叶植物和单子叶植物，植物界裸子植物门；所述被子植物门的双子叶植物和单子叶植物包括茶叶、桃树叶、桑树叶、荷叶中的任意一种，所述裸子植物门包括银杏和红豆杉中的任意一种。

所述经碱法提取的叶属生物质蛋白质是粗提物，其包括三种蛋白质：Ribulose-1,5-bisphosphate、多酚氧化酶和糖蛋白。

所述酶解方法包括以下步骤：

(a). 在1-100mL浓度为1-100mg/mL的经碱法提取的叶属生物质蛋白质中，加入10-2000U胃蛋白酶，使用HCl将溶液pH调至2-4；样品在恒温混匀仪中保温，30-100℃下 反应5-30h；或

(b). 在1-100mL浓度为1-100mg/mL的经碱法提取的叶属生物质蛋白质中，加入10-2000U碱性蛋白酶，使用NaOH将溶液pH调至7-9，反应5-30h；

反应结束后，将水解后的样品置于80-100℃中水浴加热1-60min灭活；反应后将样品冷却至室温，使用0.1-5M NaOH或0.1-5M HCl将pH调至6.5-7.5后加水稀释至浓度为5-50mg/mL。

进一步地，将上述方法制备的得到的叶属生物质蛋白质作为乳化剂应用于乳化肠或蛋糕中，所述乳化肠中叶属生物质蛋白质的添加量为质量分数0.1-20%，所述蛋糕中叶属生物质蛋白质的添加量为总蛋白添加量的1-50%。

将提取得到的叶类蛋白按质量分数1-50%的量添加到乳化肠中，具体包括以下步骤：

(a)：原料肉修整：将新鲜的猪后腿瘦肉修整；将肉切成长条，温开水洗去血水、污物后沥干1-10kg；

(b)：腌制：将食盐3%直接加入肉中进行腌制，在0〜4℃腌制24-48小时，腌制结束的标志是痩猪肉呈现均匀的鲜红色，结实而富有弹性，绞碎；

(c)：斩拌：将痩肉均匀铺开，开动斩拌机，加入冰水，缓慢添加辅料及添加剂，乳化香肠中茶渣蛋白的添加量为0.1-20%，其余组分不变，最后加入脂肪类肉或油；整个斩拌时间为4-30分钟；所述辅料及添加剂包括以下组分中的一种或多种：白糖0.34-1%，味精0.44-1%，乳酸钠4.0-6.0%，复配防腐剂0.6-2%，亚硝酸盐0.004-0.01%，异坏血钠0.03-0.5%，玉米淀粉8.0-10%，玉米变性淀粉8.0-10%，猪肉香精0.6-1%，胭脂虫红0.008-0.02%，三聚磷酸钠0.6-2%，卡拉胶1.0-3%，白胡椒粉0.24-1%，胭脂树橙0.004-0.01%，红曲红0.006-0.01%，诱惑红0.002-0.01%；所述脂肪类肉包括猪皮或鸭皮中的任意一种；

(d)：灌肠：将步骤配置好的肉馅倒入灌肠机的进料口；

(e)：干燥：初始温度60-90℃，至肠子不焦枯不出油，光滑发色；

(f)：煮熟：95-100℃下锅，持续降温，温度降温至60-70℃，肠身发硬出锅；

(g)：复烘烤：蒸汽烘烤初始温度为80-100℃，逐步下降，5小时后为50-70℃，后自然冷却。

所述叶属生物质蛋白质应用于蛋糕中具体包括以下步骤：

(a)：蛋清蛋白、茶渣蛋白、塔塔粉、盐混合，其中茶渣蛋白的添加量为总蛋白添加量的1-50%，添加浓度为0.1-20%,用中速档位搅打至出现大的蛋白泡沫；

(b)：加入材料中一半的糖一打发至泡沫变细致一加入剩余糖继续搅打至湿性发泡；

(c)：加入过筛2-5次的面粉、调糊、入模、140-180℃烘烤10-90min、冷却、脱模、成品。

所述茶渣蛋白为粗蛋白，其含有三种主要蛋白质：Rubisco、多酚氧化酶和糖蛋白，本发明使用胃蛋白酶的作用为切割芳香族氨基酸或酸性氨基酸组成的肽键，碱性蛋白酶的作用为在碱性条件下优先水解疏水基团中蛋白质的肽键。

其中Rubisco（植物代谢酶）的结构为分子量(Mw)为540 kDa的异十六聚体，由八个大亚基(Mw为50-55 kDa/链)组成，通过二硫键连接在一起形成二聚体，八个小亚基各分子量为12-18 kDa，植物中的Rubisco的二级结构高度保留（一致）。除了有催化作用外，还有几种主要的生物活性肽存在于它的序列中。切割位点（图2）：以大亚基中的某一段序列为例，图中的虚线切割端为pepsin(胃蛋白酶）切割端，故胃蛋白酶酶解会产生Rubiscolin-5活性肽。

多酚氧化酶的基因都52–62 kDa的成熟蛋白质，带有8-12 kDa转运肽。详细的植物蛋白的结构和功能仍未被发现。但已知多酚氧化酶中含有丰富的组氨酸，组氨酸是芳香族氨基酸，其芳香族氨基酸的肽键可被胃蛋白酶切割。

糖蛋白由多糖链和蛋白质残基组成，分子量从104到105g/mol不等。其中蛋白质残基由16个或更多氨基酸组成，其中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸是主要。其中，甘氨酸、缬氨酸是疏水性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸，属于两种蛋白酶的切割条件。

本发明的显著优点在于：

本发明提出了一种通过酶解化学键提高碱提叶属生物质蛋白质的乳化性及其作为乳化剂的应用，于来源广泛的叶属生物质中提取，制备方法为碱法提取与酶法水解的结合，大幅度提高了叶属生物质蛋白质的乳化性，使其乳化性更接近普通商业蛋白质乳化剂，可代替部分原料肉，降低成本，火腿肠的质构特性得到很好的改善；将经酶解后的碱提叶属生物质蛋白质乳化剂应用于蛋糕加工过程中代替蛋清蛋白，可提高产品质量，降低生产成本。

附图说明

图1 碱法提取结合酶法降解对茶渣蛋白乳化能力的影响。

图2为胃蛋白酶切割Rubisco位点示意图。

具体实施方式：

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 实施例1

先使用碱法提取蛋白产物：

(a)：茶叶预处理：剔除不良的叶类，清洗干净后将干叶粉碎；

(b)：提取：将步骤（a)得到的叶粉和碱溶液的质量体积比按照1:8的比例混合，在95℃下，搅拌4h后获得一种混合物；所述碱溶液为pH值7的NaOH溶液；(c)：分离：将步骤（b）得到的混合物离心分离得到含有蛋白复合物的提取液；

(d)：纯化：将步骤（c）得到的提取液与1M 的HCL混合，pH调整为3.5，进行沉淀，混匀后离心分离，获得蛋白复合物的沉淀并用0.1M的NaOH复溶，使用0.1M的HCL将复溶后的蛋白质溶液pH调至7；

(e)：干燥：将步骤（d）所得复溶物冷冻干燥12h,得到一种碱法提取的茶渣蛋白质成品。

进一步地，将上述制备得到的一种碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质进行酶解：

(a)：在1-100mL浓度为0.1-2000U/mg的茶渣蛋白质中，加入10-2000U胃蛋白酶或碱性蛋白酶，使用HCl将溶液pH调至3.5。样品在恒温混匀仪中保温，30-100℃下反应5-30h。

(b)：在1-100mL浓度为0.1-2000U/mg的茶渣蛋白质中，加入10-2000U碱性蛋白酶，使用NaOH将溶液pH调至8.5，反应5-30h。

反应结束后，将水解后的样品置于80-100℃中水浴(金属浴)加热1-60min灭活。反应后将样品冷却至室温，使用0.1-5M NaOH或0.1-5M HCl将pH调至7后加水稀释至浓度为5-50mg/mL。

图1为碱法提取结合酶法降解对茶渣蛋白乳化能力的影响，由图1可知，本发明制备得到的碱法提取结合酶法水解能提高叶属生物质蛋白质乳化性和稳定性。可添加量在0.1-20(g/100mL)，且胃蛋白酶水解产物的乳化能力更强，碱性蛋白酶水解产物其次，透析出去未处理的蛋白产物中的小分子反而降低了蛋白的乳化性能力。

实施例2：制备乳化香肠

（a）：原料肉修整：将新鲜的猪后腿瘦肉、白膘，将皮剥掉，去掉碎骨、污物。将肉切成长条，温开水洗去血水、污物等后沥干，100g。

（b）：腌制：将食盐3g直接加入步骤（a）得到的肉中进行腌制，腌制要在0〜4℃的冷库中进行，腌制24小时左右，腌制结束的标志是痩猪肉呈现均匀的鲜红色，结实而富有弹性，绞碎。

（c）：斩拌：将步骤（b）得到的痩肉均匀地铺开，开动斩拌机，加入冰水71 kg，缓慢添加味精0.44 kg，白糖3.4 kg，红曲红0.006 kg，胭脂虫红0.008 kg，胭脂树橙0.004 kg，诱惑红0.002 kg，玉米淀粉8.0 kg，玉米变性淀粉8.0 kg，三聚磷酸钠0.6 kg，亚硝酸盐0.004 kg，卡拉胶1.0 kg，白胡椒粉0.24 kg，复配防腐剂0.6 kg，异坏血钠0.03 kg，乳酸钠4.0 kg，猪肉香精0.6 kg。乳化香肠中（碱提）茶渣蛋白、（碱提+酶解）茶渣蛋白的添加量为7%，以豌豆蛋白、大豆分离蛋白添加量7%作为对照组，其余组分不变，最后加入油10%。整个斩拌时间为6〜8分钟。

（d）：灌肠：将猪的小肠衣的一端封口后套在出口处，打卡后进行灌肠，将步骤（c）配置好的肉馅倒入灌肠机的进料口，灌肠时要掌握好速度，每灌到一定长度时即可打卡。

（e）：干燥：初始温度以80℃为宜，至肠子不焦枯不出油，光滑发色即可。

（f）：煮熟：95℃下锅，持续降温1小时后温度需降温至65℃，肠身发硬出锅。

（g）：复烘烤：蒸汽烘烤初始温度为85℃，逐步下降，5小时后为60℃，后自然冷却，使用质构仪测定其质构特性。

表1为碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质作为添加对乳化香肠质构的影响。由表1的数据可知，利用本发明制备得到的碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质乳化剂可增高香肠的硬度和弹性，仅碱提后的茶渣蛋白作用的香肠硬度低、弹性小，但结合酶解后，茶渣蛋白与大豆分离蛋白作用的乳化香肠品质接近，较豌豆蛋白作用明显，可得到不易断裂、弹性好、口感好的乳化香肠产品。可作为蛋白质类食品乳化剂。

表1 碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白的添加对乳化香肠质构的影响

实施例3：制备蛋糕

蛋糕的主要成分是蛋清蛋白、低筋粉和糖，基本配方如下表。

蛋糕配方表

其他蛋白为：大豆分离蛋白、（碱提）茶渣蛋白和（碱提+酶解）茶渣蛋白。

（a）:鸡蛋清／(蛋清蛋白+其他蛋白)+塔塔粉+盐混合，其他蛋白浓度为10%，用中速档位搅打至出现大的蛋白泡沫。

（b）:加入材料中一半的糖一打发至泡沫变细致一加入剩余糖继续搅打至湿性发泡。(蛋糕的制作步骤中搅打是关键，必须将蛋白打发至湿性发泡，即以橡皮刮刀拉起泡沫时，尖端蛋白下垂但不滴落。)

（c）:加入面粉(过筛2次)一调糊一入模一烘烤(160℃，18min)一冷却一脱模一成品。后测定蛋糕比容=蛋糕体积（mL）/蛋糕质量(g)，用质构仪测定其质构性质。

表2 碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白作为添加对蛋糕比容的影响

（蛋清蛋白+其他蛋白=246g)

表3 碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白作为添加对蛋糕质构的影响

表2为碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白作为添加对蛋糕比容的影响。由表2的数据可知，利用本发明制备得到的叶属生物质蛋白质乳化剂对增大蛋糕的比容有利，仅碱提后的叶属生物质蛋白作用的蛋糕比容小，但结合酶解后，叶属生物质蛋白比大豆分离蛋白的作用后的比容微高，这是酶解后蛋白质的乳化能力增大引起的，故使用碱提结合酶解的叶属生物质蛋白可得到比容大，膨胀度高的蛋糕。

由表3的数据明显看出，使用本发明制备得到的碱法提取结合酶法水解的叶属生物质蛋白质乳化剂制备蛋糕，所得的质构性质趋势与香肠一致，仅碱提后的叶属生物质蛋白作用的蛋糕和香肠作用都是最差，但结合酶解后，叶属生物质蛋白比大豆分离蛋白的作用后的硬度也有些许增高，弹性相近，这是酶解后蛋白质的乳化能力增大引起的，故使用碱提结合酶解的叶属生物质蛋白可得到膨胀度高、弹性好的蛋糕。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。