一种清热、解毒、利咽、抗炎的用于上呼吸道感染的中药组合物及其口腔喷雾剂的制备方法

摘要

本发明提供一种清热、解毒、利咽的用于上呼吸道感染的中药组合物及其口腔喷雾剂的制备方法。所述中药组合物由以下重量份数比例的原料药制备而成：金银花1~3份、甘草1~3份、贯众1~3份、板蓝根1~3份和黄芪1~3份。本发明还提供上述中药组合物在制备具有清热、解毒、利咽、消炎功效的药物，制备治疗流感所致咽喉肿痛，口咽干燥，腮部肿胀症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症见上述证候者药物的应用。本发明建立了中药组合物制备成口腔喷雾剂的制备工艺及其质控标准体系，并明确了其在抑菌抗炎方面的药效作用。

说明书

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种清热、解毒、利咽、抗炎的用于治疗流感等上呼吸道感染疾病所致咽喉肿痛，口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物及其口腔喷雾剂的制备方法。

背景技术

本发明所用处方是在兰州大学第一医院在已获得备案文号的由金银花、菊花和板蓝根三味中药制成的成熟品种院内制剂“金菊板蓝根颗粒”（甘药制备字Z20190370000）的基础上，经由具多年临床经验的中医药专家优化为金银花，甘草，贯众，板蓝根和黄芪五味中药组成的院内协定处方，具有清热、解毒、利咽的良好功效并具有一定抗炎的作用，经临床验证，在治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等方面效果明显。然而，本处方作为院内协定处方，主要以中药水煎液的形式使用，患者用药不便、口感不佳等因素使得服药依从性差，临床难以推广，因此需要将该处方进行制剂研发并将其开发为适于患者使用、疗效更为显著的中药制剂。

流感等传染性疾病具有主要是经口腔等上呼吸道侵入机体的传播特点，以及流感所引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等与急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎等疾病的病灶主要在口咽部的特点。基于此，对于具有此类特点适应症的治疗，口腔喷雾剂这种给药途径的制剂类型具有一定优势且使用方便。因此，将本发明处方开发为口腔喷雾剂并对其制备工艺进行研究和优化，以获得一种在治疗相关适应症上效果显著、毒性小、口感佳且患者依存性高的中药制剂。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种具有清热、解毒、利咽、抗炎等功效，可用于流感等上呼吸道感染疾病所致咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎等的中药组合物及其口腔喷雾剂的制备方法。

本发明提供一种清热、解毒、利咽、抗炎的用于上呼吸道感染的中药组合物，所述中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成：金银花 1~3 份、甘草1~3份、贯众 1~3份、板蓝根1~3份和黄芪1~3份。

作为优选，所述中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成：金银花 1~2 份、甘草1~2份、贯众 1~2份、板蓝根1~2份和黄芪1~2份。

作为优选，所述中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成：金银花 1 份、甘草1份、贯众 1份、板蓝根1份和黄芪1份。

本发明还提供上述中药组合物的普通型口腔喷雾剂的制备方法，将各味中药混合后，煎煮，水提醇沉，浓缩，加入医学上可接受的辅料，制备成普通口腔喷雾剂。

具体地，将各味中药混合后，加15倍量的水高压煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.06-1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量约70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入医学上可接受的辅料，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，制备成口腔喷雾剂。

本发明所述中药组合物普通型口腔喷雾剂制备方法中，所述辅料为95%乙醇、甘油、羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯甲酸、聚山梨酯（吐温80）、聚乙二醇、木糖醇、食用香精中一种或几种以上的组合。

本发明还提供上述缓释口腔喷雾剂的制备方法，将各味中药混合后，煎煮，水提醇沉，冷冻干燥，获得提取物粉末，加入医学上可接受的辅料，制备成缓释口腔喷雾剂。

具体地，将各味中药混合后，加15倍量的水高压煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.06-1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量约70%搅匀，静置24小时，取上清液真空冷冻干燥，获冷冻干燥粉末，依次加入医学上可接受的辅料，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，制备成缓释口腔喷雾剂。

作为优选，所述辅料为泊洛沙姆407，羧甲基纤维素钠、甘油、稀盐酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯甲酸、木糖醇、橙味香精中一种或几种以上的组合。

本发明还提供上述中药组合物在制备具有清热、解毒、利咽、消炎功效的药物中的应用。

具体地，所述中药组合物在制备治疗流感所致咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎的药物中的应用。

方义：

（1） 金银花

【性味与归经】性寒，味甘，归肺、心、胃经。

【功能与主治】具有清热解毒，疏散风热，凉血止痢，降血降火，消咽利膈之功效。用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症。

（2）甘草

【性味与归经】味甘，性平，归心、肺、脾、胃经。

【功能与主治】具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。

（3） 贯众

【性味与归经】性苦、涩，寒，归肝、脾经。

【功能与主治】具有杀虫，清热，解毒，凉血止血之功效。常用于风热感冒，温热癍疹，吐血，咳血，衄血，便血，崩漏，血痢，带下及钩、蛔、绦虫等肠寄生虫病。

（4） 板蓝根

【性味与归经】性苦、寒，归心、胃经。

【功能与主治】具有清热解毒，凉血利咽之功效。常用于温疫时毒，发热咽痛，温毒发斑，痄腮，烂喉丹痧，大头瘟疫，丹毒，痈肿。

（5） 黄芪

【性味与归经】味甘，性微温；归脾、肺经。

【功能与主治】具有补气固表，托毒排脓，利尿，生肌。用于气虚乏力、久泻脱肛、自汗、水肿、子宫脱垂、慢性肾炎蛋白尿、糖尿病、疮口久不愈合。

在本处方中，各个中药饮片均具有清热、解毒、凉血、利咽之功效，五味药协同使用在治疗流感引起的因肺胃热盛所致的咽喉肿痛，口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等见上述证候时具有良好疗效。

本发明首先通过制剂工艺研究和优化制备获得本发明中药组合的口腔喷雾剂；其次并通过质量标准研究，建立用于制剂质量监管的质量标准操作规范；通过抑菌药效学实验，考察并筛选最优的出最优的中药组合方，最后，通过小鼠抗炎实验进一步明确本发明的中药组合物所得口腔喷雾剂在抑菌抗炎方面的药效。本发明阐明并验证了该中药组合物口腔喷雾剂为一药效明显的中药制剂，为临床进一步使用和推广提供了实验数据支持。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1至2 为薄层色谱分析图。

图3至5为高效液相色谱分析图。

图6为R,S-告依春线性回归方程。

图7至图9为抗炎药效结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本发明的用于流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量份的原料药制备而成：金银花 1~3 份、甘草1~3份、贯众 1~3份、板蓝根1~3份和黄芪1~3份。

上述用于流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物的普通型口腔喷雾剂的制备方法为：

将上述各味中药混合后，加15倍量（mL）的水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.06-1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量60%-70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入医学上可接受的辅料，加纯化水定容至1000mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，制备成普通型口腔喷雾剂。

上述用于流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物的缓释口腔喷雾剂的制备方法为：

将上述各味中药混合后，加15倍量（mL）的水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.06-1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量60%-70%搅匀，静置24小时，取上清液真空冷冻干燥，获冷冻干燥粉末，依次加入医学上可接受的辅料，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，制备成缓释口腔喷雾剂。

实施例1

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为1：1：1：1：1。

将35.7 g金银花、35.7 g甘草、35.7 g贯众、35.7g板蓝根、35.7 g黄芪混合后，加2670 ml水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入95%乙醇200 mL、甘油200 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16 mL以及橙味香精5 mL，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，即得普通型口腔喷雾剂。

实施例2

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为1：1：1：1：2。

将35.7 g金银花、35.7 g甘草、35.7 g贯众、35.7 g板蓝根、71.4g黄芪混合后，加3210mL水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入95%乙醇200 mL、甘油200 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16 mL以及橙味香精5 mL，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，即得普通型口腔喷雾剂。

实施例3

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为1：1：1：1：3。

将35.7 g金银花、35.7 g甘草、35.7 g贯众、35.7 g板蓝根、107.1 g黄芪混合后，加3740 mL水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入95%乙醇200 mL、甘油200 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16mL以及橙味香精5 mL，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，即得普通型口腔喷雾剂。

实施例4

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为2：2：2：3：3。

将71.4 g金银花、71.4 g甘草、71.4 g贯众、107.1 g板蓝根、107.1 g黄芪混合后，加6420 mL水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入95%乙醇200 mL、甘油200 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16mL以及橙味香精5 mL，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，即得普通型口腔喷雾剂。

实施例5

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为2：2：3：3：3。

将71.4 g金银花、71.4 g甘草、107.1 g贯众、107.1 g板蓝根、107.1 g黄芪混合后，加6960 mL水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入95%乙醇200 mL、甘油200 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16 mL以及橙味香精5 mL，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，即得普通型口腔喷雾剂。

实施例6

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为2：3：3：2：3。

将71.4 g金银花、107.1 g甘草、107.1 g贯众、71.4 g板蓝根、107.1 g黄芪混合后，加6960 mL水高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时。取上清液回收乙醇至无明显醇味，依次加入95%乙醇200 mL、甘油200 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16 mL以及橙味香精5 mL，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，即得普通型口腔喷雾剂。

实施例7

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：甘草：贯众：板蓝根：黄芪为3：3：2：2：3。

本发明还提供上述口腔喷雾剂的制备方法，将107.1 g金银花、107.1 g甘草、71.4g贯众、71.4 g板蓝根、107.1 g黄芪混合后，加6960 mL高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时，取上清液真空冷冻干燥，获冷冻干燥粉末，依次加入泊洛沙姆407 10 g，羧甲基纤维素钠 2g，甘油100 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16 mL，木糖醇20g以及橙味香精6 mL，用稀盐酸调pH值至6.8～7.0后，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，制备成缓释口腔喷雾剂。

实施例8对比实验

用于治疗流感等引起的咽喉肿痛、口咽干燥，腮部肿胀等症以及急性扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎症等的中药组合物由以下重量比例份的原料药制备而成：

金银花：贯众：板蓝根为1：1：1。

上述口腔喷雾剂的制备方法，将35.7 g金银花、35.7 g贯众、35.7 g板蓝根混合后，加1600 mL高压（0.2 MPa）煎煮1小时，煎液滤过，滤液浓缩成相对密度1.06-1.15清膏（50℃），放冷，加乙醇至醇含量70%搅匀，静置24小时，取上清液真空冷冻干燥，获冷冻干燥粉末，依次加入泊洛沙姆407 10 g，羧甲基纤维素钠 2 g，甘油100 mL、由2.5%羟苯甲酯、羟苯乙酯和苯甲酸组成的防腐剂混合液16 mL，木糖醇20 g以及橙味香精6 mL，用稀盐酸调pH值至6.8～7.0后，加纯化水定容至1000 mL，搅匀，滤过，分装入口腔喷雾装置，制备成缓释口腔喷雾剂。

实施例9 本发明的中药组合物口腔喷雾剂的质量标准建立

1.1 药品试剂

中药组合物按照实施例3的方法制备的3批普通口腔喷雾剂（批号20200215-1，20200215-2，20200215-3，20200220-1，20200220-2，20200220-3，20200224-1，20200224-2，20200224-3）。甲醇是色谱纯，水为重蒸馏水，其他为分析纯。绿原酸对照品（批号110753-201817）和（R,S）-告依春对照品（批号111753-201706）由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪HITACHI chromaster、WATERS arc； KQ-600E超声清洗器（ 昆山）、 MS205DU 电子分析天平、DZF-6050真空干燥箱（ 上海精宏）、Qnintix224-1cn 电子分析天平（塞多利斯 ）、青岛海洋化工厂生产的硅胶G板。

1.3 实验方法与结果

1.3.1 绿原酸薄层色谱鉴别

· 供试品溶液制备：量取本品5ml作为供试品溶液。

· 对照品溶液制备：绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

· 阴性对照溶液：按处方量折算另取缺金银花的药材，同法操作。

· 方法：照薄层色谱法（中国药典2015年版通则0502）试验，吸取两种溶液各10μl，点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（乙酸乙酯：甲酸：水的体积比为：7:2.5:2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（如图1）。

图1为各组溶液的薄层色谱分析图。其中，1.喷雾剂 (20200215-1）；2. 喷雾剂(20200215-2）；3. 喷雾剂 (20200215-3）；绿原酸对照品和阴性对照。

图2为薄层色谱分析图。分别代表使用绿原酸对照品溶液2 μl，4 μl，6 μl，7 μl，10 μl，12 μl。

1.3.2 喷雾剂中有效成分（R,S）-告依春的高效液相色谱测定及标准建立

·色谱条件

色谱条件和系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02%磷酸（甲醇-0.02%磷酸的体积比为：7：93）为流动相；检测波长245nm。理论板数按（R,S）-告依春峰计算应不低于5000。

· 溶液制备

对照品溶液的制备：精密称取（R,S）-告依春对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40µg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液：按处方量折算另取缺板蓝根的药材，同法操作。测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得。

· 理论板数

在上述条件下，将对照品溶液10μl注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，以对照品溶液R,S-告依春峰的保留时间tR (以分钟或长度计算)和半峰高宽 (Wh/2 )计算，按n =5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。理论板数按R,S-告依春峰计算不低于5000，结果见表1，理论塔板数符合要求。

·分离度

依据高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）的规定，待测峰与其它峰的分离度应不小于1.5，按分离度的计算公式计算供试品色谱中R,S-告依春的峰与其它峰的分离度，三批样品每批三份的分离度均符合规定。

·重复性

精密吸取对照品溶液10μL，按上述色谱条件测定注入液相色谱仪，连续进样6次。测定峰面积，以R,S-告依春的峰面积的自然对数值计算，RSD为0.4%，表明仪器精密度良好，结果见表2。

·专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液（供试品溶液批号为：20200215-1）与阴性对照溶液，分别按上述色谱条件进行测定，供试品溶液与对照品溶液在同一保留时间有相同的波峰出现，而阴性对照溶液则无相应的峰。对照品、供试品、阴性高效液相色谱图见图3至图5。

图3为对照品溶液高效液相色谱图。

图4为供试品溶液高效液相色谱图（图4中提及的复方金贯蓝即为供试品溶液）。

图5为阴性对照溶液高效液相色谱图。

· 线性关系

精密吸取上述对照品溶液（40.12µg/mL）2、4、6、8、10、15μl，按上述色谱条件分别注入液相色谱仪，以R,S-告依春的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：y = 60114x - 103726， r=0.9999，表明R,S-告依春进样量在8.823609～61.145789μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，结果见表3及图6。

图6为R,S-告依春线性回归方程。

·耐用性

取同一供试品溶液（批号为20200215-1），分别在0、6、11、17、22、24小时，按上述色谱条件各进样一次，每次10μl， R,S-告依春在24小时内稳定。RSD为1.4%，见表4。

·加样回收率实验

精密量取已知含量(11.74ug/ml)的供试品（20200215-2）6份，每份5ml，置于20ml容量瓶中，精密加入R,S-告依春对照品（浓度55.82ug/ml）1ml，用水定容至刻度，精密吸取溶液10 μL，按上述色谱条件测定注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定含量，按公式回收率%=（测得量-样品含量）/加入量×100%计算，结果见表5。

·样品含量测定

不同批号的样品，按上述供试品溶液制备和色谱条件测定含量，对照品浓度40.12ug/ml结果见表6。

其中，“20200215-1-1”和“20200215-1-2”代表同一批号“20200215-1”的两次重复试验，其余批号的表述方法与之相同。

九份样品的平均含量为14.22µg/ml，现仅参考对实际样品测定的结果，并考虑不同原料中R,S-告依春含量的差异、大生产过程的损失、制剂中提取转移的因素及实际操作过程的误差，提取率按照90%，将其三批样品的平均含量再下浮至70%，14.22mg×90%×70%≈8.96µg。限度暂定为：本品每1ml含板蓝根以R,S-告依春（C

1.4 结论

中药组合物按照实施例3的方法制备的普通口腔喷雾剂应符合：棕色澄明液体；气芳香，味苦，微甜；薄层鉴别根据实验结果应在置于紫外光灯（365 nm）下检视时应与绿原酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。在通过实验所建立的高效液相色谱条件分析后，每mL普通喷雾剂中含板蓝根以（R,S）-告依春（C5H7NOS）计，不得少于8.90µg。

实施例10 本发明的中药组合物口腔喷雾剂的抑菌药效作用

1.1 药品试剂

中药组合物按照实施例3和实施例8的方法制备分别获得的口腔喷雾剂样品1号和样品2号。胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基，均购于北京三药科技开发公司。

1.2 实验菌种

大肠埃希菌CMCC（B）44102、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）44104〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 501〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003)〕、乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50 094〕、白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕和黑曲霉〔CMCC(F) 98 003〕购于中国食品药品检验研究院。

1.3 仪器设备

超净工作台、生物安全柜、生化培养箱、恒温水浴锅、电冰箱、显微镜、电热恒温干燥箱、压力消毒器、天平、集菌仪、一次性全封闭集菌器等。

1.4 菌悬液制备

接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，培养18～24小时，用pH 7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液稀释制成每1 mL含5000～10000 cfu、500～1000 cfu、50～100 cfu的菌悬液；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，培养24～48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含5000～10000 cfu、500～1000 cfu、50～100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，培养5～7天，加入3-5 mL的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能通过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含孢子数5000～10000 cfu、500～1000 cfu、50～100 cfu的孢子悬液。所有菌种为第3代，菌悬液为第4代。

菌悬液数量测定：取大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的菌悬液，每种菌3个稀释级，每个稀释级1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入20ml温度不超过45℃的溶化的胰酪大豆胨琼脂培养基，每个菌液浓度注2个平皿，混匀，凝固，倒置培养。测定试验菌数。取白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种菌3个稀释级，每个稀释级1ml，置直径90mm的无菌平皿中，每个菌液浓度注2个平皿，注入20ml温度不超过45℃的溶化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。测定菌悬液数量。

枯草芽孢杆菌菌悬液的制备：用灭菌蒸馏水洗下在胰酪大豆胨琼脂培养基培养7天的枯草芽孢杆菌菌种斜面，在65℃水浴中放置30分钟，在显微镜下，观察，芽孢数量大于85%。备用。

1.5. 实验方法与结果

1.5.1 液体定量悬浮试验法考察本发明的中药组合物口腔喷雾剂的抑菌药效

1.5.1.1 实验分组：

样品1号；

样品2号；

样品1空白对照：样品1用胰酪大豆胨液体培养基稀释成20%的浓度；

样品2空白对照：样品2用胰酪大豆胨液体培养基稀释成20%的浓度；

阳性对照：不同菌、不同浓度的阳性对照；

阴性对照：胰酪大豆胨液体培养基作为阴性对照。

1.5.1.2 取样体积：1 mL。

1.5.1.3 培养基：胰酪大豆胨液体培养基

1.5.1.4 菌悬液：大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液，测定每种菌悬液的菌落数。

1.5.1.5 试验方法：

·样品稀释：样品用胰酪大豆胨液体培养基稀释成20%的浓度。

·菌悬液浓度确定：取前1日已测定的菌悬液，选用4个合理稀释级，10

1.5.1.6 实验步骤

分别在样品1号、样品2号、空白对照、阳性对照、阴性对照组中加入不同浓度菌悬液0.1 mL，于35℃培养培养24 h和48 h，观察试管中菌生长状况。

1.5.1.7 实验结果

液体定量悬浮实验结果表7至表12，结果表明：样品1即本发明所述五种中药组合物口腔喷雾剂对所选择得5种指示菌抑菌作用强于三种中药组合物的喷雾剂和空白对照组。

注：1. - 液体澄清，表示无菌生长；2.+ 液体浑浊，有菌生长；3.±表示肉眼无法判断是否有菌生长。

注：1. - 液体澄清，表示无菌生长；2.+ 液体浑浊，有菌生长；3.±表示肉眼无法判断是否有菌生长。

注：1. - 液体澄清，表示无菌生长；2.+ 液体浑浊，有菌生长；3.±表示肉眼无法判断是否有菌生长。

注：1. - 液体澄清，表示无菌生长；2.+ 液体浑浊，有菌生长；3.±表示肉眼无法判断是否有菌生长。

注：1. - 液体澄清，表示无菌生长；2.+ 液体浑浊，有菌生长；3.±表示肉眼无法判断是否有菌生长。

1.5.2 暴露时间对口腔喷雾剂抑菌作用的影响

1.5.2.1 实验样品：样品1号、样品2号、空白对照组、阴性对照和阳性对照。

其中，样品1号、样品2号的制备方法与“1.5.1.1”相同。

样品1空白对照：样品1用胰酪大豆胨液体培养基稀释成20%的浓度；

样品2空白对照：样品2用胰酪大豆胨液体培养基稀释成20%的浓度；

阳性对照：不同菌、不同浓度的阳性对照；

阴性对照：胰酪大豆胨液体培养基作为阴性对照。

1.5.2.2 取样体积：1 mL

1.5.2.3 培养基：胰酪大豆胨液体培养基

1.5.2.4 菌悬液：大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液，测定每种菌悬液的菌落数。

1.5.2.5 实验方法

·样品溶液：2个样品的原液。

·菌悬液浓度确定：取前1日已测定的菌悬液，选用10

·步骤：分别取2个样品和空白对照液溶液10 mL，加入选定浓度菌悬液0.1 mL，分别在暴露时间5 min、30 min以及24 h取样0.2 mL注皿，注入20 ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养；测定菌数。加入同时进行阴性对照和阳性对照实验。于35℃培养24 h、48 h和72 h，观察平皿中菌落数变化。

1.5.2.6 实验结果

加入菌悬液浓度在10

实验结论

本实验通过定量悬液抑菌实验以及在不同暴露时间条件下，分别考察了本发明按实施例3和实施例8所制备的普通口腔喷雾剂对5种指示菌-大肠埃希菌（革兰氏阴性，杆菌）、枯草芽孢杆菌（芽孢杆菌）、 金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性，球菌）、白色念珠菌（真菌，酵母）和黑曲霉（真菌，霉菌）的抑菌药效，发现按五种中药组合1：1：1：1：3处方量制备的普通口腔喷雾剂具有明显的抑菌作用，且抑菌作用明显优于三种中药组合处方量制备的普通口腔喷雾剂，按五种中药组合物制备口腔抑菌消炎喷雾剂药效显著。

实施例11 本发明的中药组合物口腔喷雾剂初步药效学考察

1.1 仪器

LT-224S 电子天平（Sartorios 公司，BS 400S）。Varioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo公司）；高速离心机（3K15型，德国Sgima离心机公司）。

药品与试剂

金银花，板蓝根，贯众，甘草，黄芪均购自甘肃陇脉药材有限公司，药品生产许可证号：甘20160020，药品GMP证书：GS20170229；均符合《中国药典》2020年版规定；地塞米松片（阳性对照，广东华南药业集团有限公司，批号：20190911，规格：0.75 mg）；二甲苯（上海瀚思化工有限公司，批号：20200313）；细胞介素1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒（武汉基因美 生物科技有限公司，批号：2401142416）；其余试剂均为分析纯或实验室自制，水为蒸馏水。

实验动物

昆明雄性小鼠，购买自兰州生物制品研究所有限责任公司。体重18-22g小鼠60只，饲养于甘肃省药检院实验动物中心，清洁级，温度20±2℃，湿度40-60％，饲料为颗粒饲料喂养。所有实验操作均遵循兰州大学实验伦理委员会的规定。

方法

2.1 中药组合物口腔喷雾剂制备

按实施例3制备

2.2 小鼠耳肿胀炎症模型的建立与给药

取昆明小鼠60只，按空白组：灌胃给予溶媒；模型组：灌胃给予溶媒；实验组：灌胃给予中药组合物口腔喷雾剂，分低、中、高剂量组，低剂量为：0.10mL/kg/天、中剂量为：0.20mL/kg/天、高剂量为：0.4 g/kg/日，给药6天；阳性对照组（地塞米松）：5mg/kg/日，给药6天，每组 10 只。于末次给药0.5 h后，于小鼠右耳内、外侧各均匀涂抹的二甲苯溶液致炎（20μl/耳），以左耳作为对照（涂抹生理盐水）。

耳肿胀情况及组织病理学的观察

涂抹致炎药物1 h后，剪下小鼠左右耳廓，用8 mm打孔器在两耳相同部位处取下耳片并称定其质量，计算耳肿胀度和肿胀抑制率：耳肿胀度（mg）＝致炎后右耳片质量－未致炎左耳片质量；肿胀抑制率（％）＝（[模型对照组平均肿胀度－给药组平均肿胀度）/模型对照组平均肿胀度]×100％，部分耳组织用4％中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋，切成10 μm薄片，进行苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察各组小鼠耳组织病理学变化；部分耳组织用于-80冻存，用于炎症因子试剂盒测定（匀浆液）。

耳组织中 IL-1β含量的影响考察

取“2.2”项下小鼠耳组织标本上清液，室温解冻后，采用ELISA检测试剂盒，均严格按照相应试剂盒说明书操作并以酶标仪测定。

统计学方法

采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资料以

结果

3.1耳厚度和耳肿胀度测定结果

与模型对照组比较，阳性对照组和中药组合物口腔喷雾剂高、低剂量组小鼠耳廓肿胀度均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），中剂量组耳廓肿胀度降低但未见显著性差异，阳性对照组、中药组合物口腔喷雾剂高、中、低剂量组的耳肿胀抑制率分别为 54.7％、50.9％、33.9％、78.3％。其中，地塞米松组和中药组合物口腔喷雾剂低剂量组小鼠右耳皮肤均无红肿充血现象；中药组合物口腔喷雾剂低剂量药效最好。各组小鼠耳肿胀度及耳肿胀抑制率的测定结果见图7。

图7为各组小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率的测定结果（

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

耳组织病理学观察结果

与空白组比较，模型组可见耳部明显增厚，鳞状上皮过度角化，细胞间及细胞内水肿，炎性细胞浸润明显，伴有毛细血管扩张充血；与模型组比较，各给药组小鼠耳部鳞状上皮轻度角化，细胞间及细胞内水肿不明显，炎性细胞浸润减少，毛细血管轻度扩张充血。各组小鼠耳组织病理学观察结果见图8。

图8为各组小鼠耳组织病理学观察结果（HE，×200）；A:空白对照组；B:模型组；C：中药组合物口腔喷雾剂低剂量组；D:中药组合物口腔喷雾剂中剂量组；E:中药组合物口腔喷雾剂高剂量组；F:阳性对照组。

耳组织中IL-1β水平测定结果

耳组织中IL-1β水平测定结果与空白组比较，模型组小鼠耳组织中IL-1β水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组合物口腔喷雾剂高剂量组和低剂量组小鼠耳组织中IL-1β水平均显著降低（P＜0.05）。各组小鼠耳组织中IL-1β水平测定结果见图9。

图9各组小鼠耳组织中IL-1β水平比较。

注：与模型组比较，***P＜0.001。

讨论

二甲苯诱导小鼠耳肿胀炎症模型是化学接触性皮肤炎症的经典动物模型，表现为小鼠耳组织角质形成细胞增生，产生炎性细胞因子，炎性细胞浸润增多，耳组织增厚和耳质量增加等。本研究采用二甲苯诱导小鼠耳肿胀炎症小鼠模型，并以一种抗炎效果较好的地塞米松为阳性对照，来验证中药组合物口腔喷雾剂的抗炎作用。结果显示，涂抹二甲苯后，小鼠耳厚度和耳肿胀度明显增加，而中药组合物口腔喷雾剂和地塞米松涂抹给药后均可显著降低小鼠耳肿胀度。进一步的组织病理学检查结果显示，与空白组比较，模型组小鼠耳组织中炎性细胞浸润增加，耳组织肿胀；而中药组合物口腔喷雾剂和地塞米松组小鼠耳组织炎性细胞浸润减少，耳组织肿胀减轻。炎症和免疫刺激均可诱导角质细胞中 IL-1β产生和分泌。本研究检测了小鼠耳组织中炎性细胞因子的分泌水平。结果显示，与空白组比较，模型组IL1β的含量显著升高；而中药组合物口腔喷雾剂和地塞米松处理后降低了IL-1β的分泌水平，证实了中药组合物口腔喷雾剂的抗炎作用。

实验结论

综上所述，中药组合物口腔喷雾剂对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀具有抗炎作用，其作用机制可能与抑制炎症因子IL-1β的分泌水平有关。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。