一种髁突软骨干细胞的原代分离培养方法

摘要

本发明提供了一种人髁突软骨干细胞的原代分离培养方法，它包括如下步骤：a、取人髁突软骨表层，剪碎清洗，用I型胶原酶消化；b、消化终止后，离心弃上清，清洗，加入细胞培养基重悬，贴壁培养；c、换液，消化传代，培养，通过流式分选的方法，分离筛选髁突软骨干细胞，培养，即可。本发明方法，操作简便，可有效分离骨软骨瘤髁突软骨干细胞和正常人髁突软骨干细胞，应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种髁突软骨干细胞的原代分离培养方法。

背景技术

骨软骨瘤(osteochondroma,OC)又名外生骨疣(osteocartilaginous exotosis)，是一种常见的良性骨肿瘤，严格讲是属于生长方面的异常，瘤体有软骨帽和一个从骨侧面突出的骨组织。髁突是颌面部骨软骨瘤易受累的部位，髁突骨软骨瘤主要表现为关节区肿块、关节功能异常，常继发不对称性牙颌面畸形。

髁突骨软骨瘤的病因尚未明确。从组织学分析，髁突表面被覆纤维软骨，该软骨从表层到深层可分为关节表面带、增殖带、肥大带以及钙化软骨带。其中增殖带的细胞可分化出成软骨细胞和软骨细胞，是髁突软骨的生长和形成中心。而关节表面软骨的增生和骨化使髁突及髁突颈部增大，在关节面的改建和修复中起重要作用。

髁突软骨中存在软骨干细胞，这些软骨干细胞在髁突生长发育和适应性改建过程中起着储能细胞的作用，从而维持髁突软骨结构和功能的完整性，与髁突软骨的生理病理密切相关。深入了解髁突软骨干细胞的生物学特性，有助于探讨其在骨软骨瘤发生中的作用，进而有助于研究骨软骨瘤的发生机制。但由于髁突软骨干细胞的含量较少，必需在体外进行分离培养和扩增才能用于研究，同时髁突软骨干细胞作为一类具有多向分化潜能的成体干细胞，其分离培养也能为软骨修复组织工程提供种子细胞储备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便的髁突软骨干细胞的原代分离培养方法。

本发明提供了一种人髁突软骨干细胞的原代分离培养方法，它包括如下步骤：

a、取人髁突软骨表层，剪碎清洗，用I型胶原酶消化；

b、消化终止后，离心弃上清，清洗，加入细胞培养基重悬，贴壁培养；

c、换液，消化传代，培养，通过流式分选的方法，分离筛选髁突软骨干细胞，培养，即可。

其中，步骤a中，所述髁突软骨表层为髁突骨软骨瘤组织的软骨表层，或正常髁突的髁突表层。

其中，步骤a中，所述消化的方法为：加入I型胶原酶2～2.5mg/ml，37℃消化2小时。

其中，所述I型胶原酶用DMEM高糖培养基稀释；和/或，胶原酶消化时进行摇动。

其中，步骤b中，所述贴壁培养时，将重悬液中的纯细胞重悬液和未完全消化的组织块分别培养。

其中，未完全消化的组织块的培养方法为：将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面，翻转瓶底后加入细胞培养基，勿接触组织块，第二天翻转培养瓶，使培养基浸没组织块，继续培养。

其中，步骤c中，所述消化传代在细胞融合度达80％时进行。

其中，步骤c中，所述流式分选是分选出CD34-CD73+CD90+CD105+的细胞。

其中，所述流式分选的方法为：

(1)将步骤c中的第二代细胞培养至融合度90％时，胰酶消化，离心收集细胞，封闭、洗涤细胞并重悬；

(2)加入已结合荧光素的一抗(CD34、CD73、CD90、CD105)孵育，用染色洗涤液清洗，离心；

(3)加入流式缓冲液(DPBS+1％牛血清白蛋白+25mM PH＝7Hepes缓冲液+5MmEDTA)重悬，以CD34-、CD73+、CD90+、CD105+作为分选条件上机，分选；

进一步地，所述封闭的封闭液为含40％胎牛血清的DPBS；所述染色洗涤液为含1％牛血清白蛋白的DPBS；所述流式缓冲液为(DPBS+1％牛血清白蛋白+25mM PH＝7Hepes缓冲液+5Mm EDTA)。

其中，步骤b或c中，所述培养的培养基为(DMEM高糖培养基+20％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)；所述培养是在温度为37℃、体积分数为5％的CO2的培养箱中进行。

本发明方法，通过特定酶消化和组织块培养法相结合，获得大量原代混合细胞。并且本发明人通过研究发现，人髁突软骨干细胞表现出CD44、CD73、CD90、CD105阳性，CD29、CD34和CD45阴性(即CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD29-/CD34-/CD45-)的细胞表面标记物特性，通过流式分选，原代混合细胞中，约有(1.51±0.97)％的干细胞可被分选出来。

本发明提供的人髁突软骨干细胞分离培养方法，可应用于骨软骨瘤软骨干细胞分离培养，也可应用于正常髁突中软骨干细胞的分离培养，而且本发明方法操作简便，分离培养效率高，适用于大规模细胞制备，不仅有利于探索髁突骨软骨瘤的病因病理，而且为干细胞的基础研究和临床转化提供了新的选择途径。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1人髁突骨软骨瘤髁突干细胞对取材，取材部位为髁突软骨最表层部分(纤维层)。

图2不同来源髁突软骨干细胞的形态学及成软骨、成脂、成骨多向分化能力情况。

图3人髁突骨软骨瘤髁突干细胞的培养方法筛选。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂与仪器及厂家信息如下：

DPBS:Hyclone SH30256.01

DMEM(high glucose):Hyclone SH30243.01

Penisilin/Streptomycin:Gibco 15070063

FBS:ZETA Z7010FBS-500

超净台:Thermo Scientific

Collagenase I:Sigma C0130

胰酶:Gibco 25200056

牛血清白蛋白:BioFroxx

CD73-FITC抗体:biolegend 344003

CD105-PE/Cy7抗体:eBioscience 25-1057-42

CD34-PerCP/Cy5.5抗体:Biolegend 343611

CD90-PE抗体:Biolegend 328109

EDTA:Solarbio E8084

实施例1本发明人髁突软骨干细胞的原代细胞提取

一、原代分离培养方法

针对人髁突骨软骨瘤髁突软骨干细胞的分离提取：

1.新鲜人髁突骨软骨瘤组织(含髁突软骨层)置于含1％青霉素/链霉素的DPBS

中，冰上储存运输。

2.在超净台中，使用手术刀、显微组织剪、眼科镊于体式显微镜下小心剥离髁突软骨的软骨表层(见图1)，操作过程中，需保持组织的湿润状态，将剥离下的软骨表层置于装有新鲜预冷DPBS的培养皿中，使用组织剪将其剪碎成约1*1mm的小块，使用移液枪吸取含组织碎块的DPBS并转移至15ml离心管中。

3.以1200rpm转速低速离心5min，弃去上清，尽量吸净残留的DPBS，加入以DMEM高糖培养基稀释的I型胶原酶(2.5mg/ml)，置于37℃水浴槽中进行酶消，每隔10min摇动离心管使组织与胶原酶充分接触。

4.酶消2小时后加入完全培养基(DMEM高糖培养基+20％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)终止消化【胎牛血清、青链霉素均为体积分数】，1000rpm离心5min，弃上清，DPBS重悬、离心，清洗酶消后组织*2次，洗净残余胶原酶。

5.最后一次清洗结束后，弃上清，用完全培养基重悬消化物。

6.重悬液中含部分未完全消化的组织，吸取纯细胞重悬液于T25培养瓶中，置于5％CO

7.将消化不完全的组织用1ml移液枪枪尖转移至T25培养瓶的底面，使其黏附于细胞生长面，将培养瓶竖立，小心加入4ml完全培养基(勿接触组织块，以免组织块被冲刷脱落)，将含培养基的培养瓶倒放于5％CO

8.纯细胞重悬液培养瓶应于培养24h后更换新培养基，此后每2-3天更换新鲜培养基一次，直至原代细胞融合度达80％时，使用胰蛋白酶消化后按10

9.组织块培养瓶待可观察到细胞爬行或组织块黏附较紧后更换新培养基，飘起的组织块随换液弃去，此后每2-3天更换新鲜培养基一次，直至原代细胞融合度达80％时，使用胰蛋白酶消化后按10

10.将第二代细胞培养至融合度90％时，使用胰酶消化细胞，1000rpm离心5min，弃上清后加入封闭液(40％胎牛血清+DPBS)室温封闭15min。

11.加入等体积染色洗涤液(DPBS+1％牛血清白蛋白，滤器过滤后使用)，1000rpm离心5min后弃上清，重复染色洗涤液清洗细胞步骤*2次。

12.加入染色洗涤液重悬，使细胞密度为2.5*10

13.加入染色洗涤液清洗，离心，弃上清，重复3次。

14.加入800μl流式缓冲液(DPBS+1％牛血清白蛋白+25mM PH＝7Hepes缓冲液+5MmEDTA)重悬，以CD34-、CD73+、CD90+、CD105+作为分选条件上机(Beckman，Moflo XDP)分选(收集管中为完全培养基，收集管需置于冰上保持低温状态)。

15.分选后收集的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清后根据分选所得细胞数选择相应的培养瓶或培养皿，加入适量完全培养基重悬后置于5％CO

针对人正常髁突软骨干细胞的分离提取：

与人髁突骨软骨瘤髁突软骨干细胞的分离提取相比，二者区别仅在于取材部位略有区别，其中，人正常髁突只需在髁突表层直接取材，但来源稀少；而人髁突骨软骨瘤的取材部位为骨软骨瘤软骨表层。

二、髁突干细胞的鉴定

人髁突骨软骨瘤髁突软骨干细胞与正常髁突软骨干细胞的形态学、细胞基因表达及成软骨、成脂、成骨多向分化能力比较见图2。

可见，两种髁突软骨干细胞的形态及三向分化能力均有差异。通过细胞爬片及免疫荧光观察，正常人髁突软骨干细胞形态呈椭圆、多角形等多种细胞形态，而骨软骨瘤干细胞形态偏长梭形。髁突骨软骨瘤软骨干细胞细胞与正常软骨干细胞在基因组学上具有数百个表达差异基因，例如髁突骨软骨瘤干细胞的细胞核中的SOX9表达显著低于正常髁突软骨干细胞。

分别用番红O染色法、茜素红染色法、油红O染色法检测两种来源髁突软骨干细胞的成软骨、成骨、成脂能力，结果显示，二者均具有成软骨能力、成骨能力、成脂能力，符合干细胞特性。其中，正常髁突软骨干细胞的成软骨、成脂能力更强，成骨能力二者相当。

可见，本发明获得了髁突软骨干细胞。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明髁突干细胞培养方法的筛选

1.不同培养方法

按照实施例1方法进行髁突骨软骨瘤表层组织分离后，分别采用如下不同方法培养：

A.单纯化学消化法(I型胶原酶2.5mg/ml反应2小时)；

B.化学消化法(I型胶原酶2.5mg/ml反应2小时)联合组织培养法；

C.化学消化法(先使用0.25％含EDTA含酚红的胰酶消化组织30分钟后弃去胰酶继续使用I型胶原酶2.5mg/ml消化组织2小时)联合组织培养法；

D.单纯组织块培养法进行原代细胞培养。

2.结果：见图3。

其中，D组经72小时观察后仍无细胞爬出，说明单纯组织块法无法培养出原代细胞。A组中人体组织难以在短时间内被充分消化，分离效率低，若延长消化时间直至组织中细胞被完全分离，则原代细胞因过长时间接触胶原酶，细胞状态严重受损。

经24小时培养后，A、B、C三组均有原代细胞贴壁生长，选取这三组细胞，分别进行成骨、成脂、成软骨三向分化诱导，结果如下：

B、C组的三向分化能力相近，均强于A组；而C组由于使用胰酶进行组织消化步骤，增加了原代细胞提取过程的复杂度及时间消耗；B组操作简单，耗时短，分化能力强，为最优选培养方法。

综上，本发明方法可用于高效分离培养人髁突软骨干细胞，而且操作简单，分离培养效率高，适用于大规模细胞制备，应用前景良好。