一种诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法

摘要

本发明诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法选取添加半胱氨酸和甲硫氨酸可有效改善并控制纤细裸藻的细胞分裂的节律性，可提高纤细裸藻NAD激酶和NADP磷酸酶含量。该培养方式可维持NAD激酶和NADP磷酸酶的高活性，提高NADP磷酸酶和NAD激酶生产含量，故本发明能因此达到高效产出高质量NAD激酶和NADP磷酸酶。

说明书

技术领域

本发明涉及藻类技术领域，尤指一种诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法。

背景技术

纤细裸藻(Euglena gracilis)属于裸藻门、裸藻属，也称绿虫藻，是一类介于动物和植物之间的单细胞真核生物，主要分布在阳光充足、有机质丰富、静止无流水的小水体中，在营养充足、天然原生态的环境中得以繁殖。其营养方式为兼性营养，既可以通过光合作用制造营养，有效固定环境中的CO2，又可以通过渗透营养来摄取有机物，如牛肉膏、蛋白胨、醋酸盐、乙醇等，不同的营养方式对微藻代谢产物的种类与含量有较大的影响。纤细裸藻含有丰富的营养成分，包括氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、裸藻糖和抗氧化成分(如β胡萝卜素、维生素C、维生素E等)，富含59种人体必需的营养元素，氨基酸种类尤其丰富，含有人类所需的全部氨基酸。目前，纤细裸藻在生物饵料应用方面的重要性逐渐被认识，已被增补到《饲料原料目录》中。

NAD(P)依赖型的氧化还原酶(EC1.1.1)包括一大类催化生物氧化还原反应的酶，其催化反应需要辅酶-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) 或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的参与， 辅酶以可溶性组分存在于酶结构之中。化学及生物化学的很多转化过程都涉及氧化还原反应，开发有实际应用价值的氧化还原酶是生物技术领域一直以来的一项重要内容。在过去的几年中，以氧化还原酶为基础的临床诊断，生物感应器，再生辅酶系统，手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等技术都取得了令人瞩目的进展。氧化还原酶被用于不对称合成功能性类固醇、手性药物制剂、合成或修饰聚合物、氧化羟基及构建生物感应器等各个方面。其中NAD(P)依赖型氧化还原酶在手性合成中有着重要的作用。如脱氢酶催化醛、酮、羰基以及烯烃碳碳双键的还原，使许多潜手性物质转化为手性产品应用于医药、食品、精细化工等领域。

NAD(P) 依赖型的氧化还原酶来源十分广泛，在自然界中普遍存在，从动物、植物和微生物中已经分离出许多种不同的NAD(P) 依赖型的氧化还原酶。目前由于微生物种类众多，易于获得，生长周期短，产率高，所以市场上都是采用微生物来做为生产源。

NAD激酶和NADP磷酸酶从微生物提取的纯化过程中，辅酶的丢失常常是不可避免的，酶的活力也因此受到影响，另外空气氧化、金属离子抑制等因素也会影响氧化还原酶的稳定性。如何维持酶的稳定性，阻止或减缓酶的失活，是微生物源NAD激酶和NADP磷酸酶在分离纯化过程必须重点考虑的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法，其中方法步骤如下：

S1，将纤细裸藻在浓度33mM乳酸培养基中划线；

S2，在无菌、充气CO2的环境中磁力搅拌；

S3，选择在光照和缺氧条件下能在培养基中长出藻落的的裸藻细胞；

S4，挑取并接入改良CM培养基中进行培养；

S5，添加半胱氨酸和甲硫氨酸；

S6，培养72h后，将其转入连续黑暗光照条件中144h；

S7，在无菌，充气CO2的环境中磁力搅拌。

进一步地，在步骤S6中，在光照为3000lux，温度控制在16.5±0.5℃，光暗比12L:12D的环境下进行培养。

进一步地，在步骤S1中乳酸培养基PH为3.5，在步骤5中，半胱氨酸和甲硫氨酸的浓度为10

进一步地，在步骤S4中，所述改良CM培养基的配方如下：磷酸氢铵0.8-1.2g、磷酸二氢钾0.8-1.2g、七水硫酸镁0.1-0.3g、二水氯化钙0.01-0.03g、柠檬酸钠0.6-0.9g、七水硫酸铁2-4mg、四水氯化锰1.5-2.0mg、七水硫酸钴1.3-1.6mg、七水硫酸锌0.3-0.5mg、二水钼酸钠0.1-0.3mg、五水硫酸铜0.010.03mg、硼酸2.45-2.50mg、维生素B1为0.4-0.6mg、维生素B12为0.01-0.03mg、去离子水800-1100mL及碳源。

具体地，在步骤S4中，所述改良CM培养基的配方如下：磷酸氢铵1g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.2g、二水氯化钙0.02g、柠檬酸钠0.8g、七水硫酸铁3mg、四水氯化锰1.8mg、七水硫酸钴1.5mg、七水硫酸锌0.4mg、二水钼酸钠0.2mg、五水硫酸铜0.02mg、硼酸2.48mg、维生素B1为0.5mg、维生素B12为0.02mg、去离子水1000mL及碳源。

其中，所述碳源为乙醇、葡萄糖、琥珀酸、谷氨酸或乙酸钠其中之一。

其中，所述碳源含量及酸碱度如下：pH值为7.0的乙醇1g、pH值为3.4的葡萄糖10g、pH值为3.4的琥珀酸5g、pH值为3.4的谷氨酸5g、pH值为6.8的乙酸钠1.64g。

本发明的有益效果在于：本发明诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法选取添加半胱氨酸和甲硫氨酸可有效改善并控制纤细裸藻的细胞分裂的节律性，可提高纤细裸藻NAD激酶和NADP磷酸酶含量。该培养方式可维持NAD激酶和NADP磷酸酶的高活性，提高NADP磷酸酶和NAD激酶生产含量，故本发明能因此达到高效产出高质量NAD激酶和NADP磷酸酶。

附图说明

图1 是本实施例第3天到第9天加速细胞分裂速度的示意图。

图2 是本实施例在NADP磷酸酶饱和浓度为1.75mM时，为每小时和每纤细裸藻10

图3 是本实施例在NAD激酶饱和浓度为1.55mM时，为每小时和每纤细裸藻10

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本申请可以以多种不同的形式来实现，并不限于本实施案例所描述的实施方式。提供以下具体实施方式的目的是便于对本申请公开内容更清楚透彻的理解。

本发明关于一种诱导纤细裸藻高效高质量合成NAD激酶和NADP磷酸酶的方法，步骤如下：

S1，将纤细裸藻在浓度33mM乳酸培养基（pH 3.5）中划线；

S2，在无菌，充气CO2的环境中磁力搅拌;

S3，选择在光照和缺氧条件下能在培养基中长出藻落的的裸藻细胞；

S4，挑取并接入改良CM培养基中进行培养；

S5，添加半胱氨酸和甲硫氨酸（10

S6，光照为3000lux，温度控制在16.5±0.5℃，光暗比12L:12D培养72h后，将其转入连续黑暗光照条件（DD）中144h；

S7，在无菌，充气CO2，磁力搅拌环境条件下，防止微藻细胞附壁或下沉。

所述改良CM培养基的配方如下：

请参阅图1所示，在第3天到第9天加速细胞分裂速度，纤细裸藻细胞分裂节律平均周期可控制在25.25±2.14h。本发明方法培养方式利用黑暗胁迫条件，在不影响藻细胞生长的条件下提高藻细胞NAD激酶和NADP磷酸酶含量。

请参阅图2所示，将生产控制在NADP磷酸酶饱和浓度为1.75mM时，此时可产出每小时和每纤细裸藻10

请参阅图3所示，将生产控制在NAD激酶饱和浓度为1.55mM时，此时可产出每小时和每纤细裸藻10

本发明研究发现纤细裸藻在细胞分裂过程中会在细胞膜、细胞质和叶绿体产生丰富高活性的NAD激酶和NADP磷酸酶。

本发明专利主要是发明一种培养方法达到控制纤细裸藻生长周期以达到高产率，并且巧妙应用纤细裸藻富含59种人体必需的营养元素等特质，来稳定NAD激酶和NADP磷酸酶的活性，而且这些营养元素无需像微生物菌种必须纯化分离造成辅酶的丢失或破坏活性，故本发明能因此达到高效产出高质量NAD激酶和NADP磷酸酶。

需要进一步说明的是，本发明中提及的CM培养基为Cramer和Myers's培养基，本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

以上实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。