苹果HD-Zip I转录因子基因MdHB-7在提高植株水分利用效率中的应用

摘要

本发明涉及基因工程应用技术领域，具体公开了苹果HD‑Zip I转录因子基因MdHB‑7在提高植株水分利用效率中的应用，所述MdHB‑7基因能够提高苹果植株的光合效率，促进生物量的积累，MdHB‑7基因过表达能够降低苹果的气孔密度，减少水分散失，能够在长期中度水分亏缺条件下减轻对根系生长的抑制，提高根系的导水能力。本发明中发现的苹果HD‑Zip I转录因子基因MdHB‑7能够提高苹果植株的水分利用率，有望创制高WUE的苹果种质资源。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程应用技术领域，具体涉及苹果HD-Zip I转录因子基因MdHB-7在提高植株水分利用效率中的应用。

背景技术

植物不可避免地受到各种环境胁迫的挑战，特别是干旱胁迫，这极大地限制了作物的产量。世界上许多地方的农作物都面临严重的水资源短缺。提高水分利用效率(WUE)是减轻因干旱胁迫造成生产损失的有效方法。影响植物WUE的因素很多，包括环境因素和植物本身因素。植物的WUE与光合和蒸腾作用这两个生理过程密切相关，因此影响植物光合和蒸腾作用的所有因素都对WUE产生影响。根系是植物从周围土壤吸收水分的主要界面，因此根系也被认为是干旱下决定WUE的关键因素。苹果是温带地区种植最广泛的经济果树之一。黄土高原是我国主要的苹果产区之一，干旱是限制该产区苹果产业发展的主要因素之一。因此，鉴定与WUE相关的基因，提高苹果WUE已成为苹果育种的重要目标。

许多研究表明WUE的复杂性。气孔通过控制蒸发速率和CO

同源域-亮氨酸拉链(HD-Zip)转录因子(TF)是植物特有的，它们编码一个同源域(HD)和一个亮氨酸拉链(Zip)域，并被分为四个亚家族：I，II，III和IV。许多研究表明，HD-Zip I TFs参与了植物的各种非生物胁迫反应。例如，水分亏缺和ABA处理强烈诱导了ATHB7和ATHB12的表达；玉米HD-Zip I基因ZmHDZ4和ZmHDZ10的过表达提高了转基因水稻耐旱性；ATHB13或HaHB1的过表达维持了转基因拟南芥细胞膜的完整性，并提高了转基因拟南芥对的干旱和盐胁迫的耐受性；TaHDZipI-5在小麦中的过表达显着增强了转基因小麦植物对霜冻和干旱的抗性,但对生物量和产量产生负面影响；向日葵HD-Zip I基因HaHB4的异位表达在正常和干旱条件下都提高了小麦产量；同样，HaHB4在大豆中的异位表达可提高其WUE和产量。尽管部分研究已经对几种HD-Zip I转录因子基因在非生物胁迫中的作用进行了表征，但是大多数该类基因的生物学功能尚不清楚，尤其是在木本植物中研究更少。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了苹果HD-Zip I转录因子基因MdHB-7在提高植株水分利用效率中的应用，有望创制高WUE的苹果种质资源。

本发明提供了苹果HD-Zip I转录因子MdHB-7在提高植株水分利用效率中的应用。

进一步地，所述MdHB-7基因在长期中度水分亏缺条件下能够提高植株的光合效率，促进生物量的积累。

进一步地，所述长期中度水分亏缺条件是指60天内保持田间持水量为45％-55％。

进一步地，所述MdHB-7基因过表达能够降低苹果的气孔密度，减少水分散失。

进一步地，所述MdHB-7基因过表达能够在长期中度水分亏缺条件下减轻对根系生长的抑制，提高根系的导水能力。

进一步地，所述长期中度水分亏缺条件是指60天内保持田间持水量为45％-55％。

进一步地，所述植株为苹果植株。

本发明还提供了上述苹果HD-Zip I转录因子MdHB-7在创制高WUE的苹果种质资源中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、经过本发明的研究，提供了苹果HD-Zip I转录因子MdHB-7过表达在提高苹果的水分利用效率中的应用；

2、本发明中所述MdHB-7基因在长期中度水分亏缺条件下能够提高植株的光合效率，促进生物量的积累；

3、本发明中所述MdHB-7基因过表达能够降低苹果的气孔密度，减少水分散失；

4、本发明中所述MdHB-7基因过表达能够在长期中度水分亏缺条件下减轻对根系生长的抑制，提高根系的导水能力；

5、利用所述MdHB-7基因能够提高苹果的水分利用效率为研究者在创制高WUE的苹果种质资源奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的技术路线图；

图2为长期中度水分亏缺条件下MdHB-7转基因苹果植物的生长指标；

其中，图2(a)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系在60d内正常浇水的表型；

图2(b)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系在60d内中度水分亏缺条件下的表型；

OE代表MdHB7的过表达，RNAi代表MdHB7的干扰；

图2(c)表示MdHB-7过表达或干扰对株高的影响；

图2(d)表示MdHB-7过表达或干扰对茎粗的影响；

其中，图2(c)和图2(d)中的数据为平均值±标准差(b和c为n＝3，每个生物重复包含6株植物)，根据单向方差分析Tukey的多范围测试，不同字母表示GL-3和转基因苹果植物之间存在显着差异(p<0.05)；

图3为MdHD-Zips基因在MdHB-7转基因植株中的表达水平；

其中，图3(a)表示MdHB-like基因在MdHB-7转基因植株中的表达水平；

图3(b)表示MdHD-Zip7基因在MdHB-7转基因植株中的表达水平；

图3(c)表示MdHD-Zip6基因在MdHB-7转基因植株中的表达水平；

MdMDH为内参基因，使用2

图4为长期中度干旱下MdHB-7转基因苹果植物的生物量及WUE；

其中，图4(a)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系的生物量；

图4(b)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系的生物量的积累；

图4(c)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系的长期WUE；

图4(a)-(c)中的数据为平均值±标准差(a,b和c为n＝6,每个株系使用6株植物)，根据单向方差分析Tukey的多范围测试，不同字母表示GL-3和转基因苹果植物之间存在显着差异(p<0.05)；

图5为长期中度水分亏缺条件下MdHB-7转基因苹果植物的相关生理指标；

其中，图5(a)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系的叶片相对含水量；

图5(b)表示MdHB-7过表达或干扰对叶绿素含量的影响；

图5(c)表示MdHB-7过表达或干扰对净光合速率的影响；

图5(d)表示MdHB-7过表达或干扰对蒸腾速率的影响；

图5(e)表示MdHB-7过表达或干扰对瞬时水分利用效率(WUEi)的影响；

图5(f)表示MdHB-7过表达或干扰对Fv/Fm的影响；

其中，图5(a)-(f)中的数据为平均值±标准差(a,b和f为n＝5,5个生物学重复；c,d,e,为n＝5，每个株系使用五株植物)，根据单因素方差分析，不同字母表示GL-3和转基因苹果植物之间存在显着差异(p<0.05)。*,p<0.05；**,p<0.01；

图6为MdHB-7对气孔密度和叶片水分流失的影响；

其中，图6(a)-(e)分别表示MdHB-7干扰、MdHB-7干扰、GL-3、MdHB-7过表达和MdHB-7过表达对对气孔密度的影响；

图6(f)表示长期中度干旱处理60天前后MdHB-7对转基因苹果植株的叶片气孔密度的影响；

图6(g)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系正常浇水下叶片水分流失；

其中，图6(a)-(g)中的数据为平均值±标准差(a为n＝50,每个株系使用50张气孔密度图片；b为n＝5，5个生物学重复),根据单向方差分析Tukey的多范围测试，不同字母表示GL-3和转基因苹果植物之间存在显着差异(p<0.05),*,p<0.05；**,p<0.01；

图7为长期中度干旱下MdHB-7对根系的影响；

其中，图7(a)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系在60d内正常浇水或长期中度干旱胁迫下的根系表型；

图7(b)表示GL-3，MdHB-7过表达苹果株系，干扰苹果株系的根系干重；

图7(c)表示MdHB-7过表达或干扰对根系活力的影响；

图7(d)表示MdHB-7过表达或干扰对根系导水率的影响；

其中，图7(a)-(d)中的数据为平均值±标准差(b,c和d为n＝6,每个株系使用6株植物)。根据单因素方差分析，不同字母表示GL-3和转基因苹果植物之间存在显着差异(p<0.05)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明提供苹果HD-Zip I转录因子MdHB-7在提高植株水分利用效率中的应用。

具体实施例如下：

实施例1

对MdHB-7转基因苹果植株进行长期中度干旱处理

本实验所使用的植物材料是：GL-3(嘎啦-3)，MdHB-7过表达植株和MdHB-7干扰植株，GL-3是沈阳农业大学从'Royal Gala'苹果中分离的具有高再生能力的苹果株系，是苹果转基因常用的苹果品系。

使用本领域常规方法将MdHB-7基因的编码区连接至pCambia2300载体上，构建成过表达载体；选择MdHB-7非保守结构域的260bp的特异性序列，连接至pK7GWIWG2D载体上，构建成干扰载体，将构建成功的过表达载体或干扰载体通过热击法转入EHA105农杆菌菌株，获得的阳性菌株备用。然后通过农杆菌介导法转化GL-3苹果株系来获得MdHB-7过表达植株和MdHB-7干扰植株。

GL-3和MdHB-7转基因组培苗在补充有0.2mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA的MS琼脂培养基上，在温度为24±1℃，光照时间为16h的光照培养箱中培养4周，然后选取生长健壮的茎尖进行继代和扩繁；GL-3和MdHB-7转基因组培苗在补充有0.5mg/L IBA和0.5mg/L IAA的MS琼脂培养基上生根。40天后，将生根的GL-3和MdHB-7转基因植株移栽到装有营养土壤，蛭石和珍珠岩(3：1：1；v：v：v)的塑料花盆(8cm×8cm)中，并在25±1℃，光周期为光照时间为16h、黑暗时间8小时的培养室中进行适应性培养；适应生长一个月后，将长势一致的植物移植到装有沙子和土壤混合物的花盆(38cm×23cm)中，每个花盆中的沙子和土壤的混合物的质量是相等的，并在温室中继续生长，当植物生长到58-62cm时，将幼苗分为浇水充足的对照组(75％-85％的田间持水量，n＝40)和中度水分亏缺的处理组(45％-55％的田间持水量，n＝40)，其中，n代表每个组中GL-3或MdHB-7转基因苗的数量；培养60天后，从对照组和处理组的植物中收获叶片，并测量对照组和处理组的植物的株高和直径。将所有组织在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃下。

对上述实施例1中的HD-Zip I基因MdHB-7过表达和干扰植株的表型进行分析，分析结果如下：

(1)MdHB-7对转基因苹果生物量以及WUE的影响

在正常条件下，观察到GL-3和MdHB-7过表达植株的株高、茎粗没有明显差异，而MdHB-7干扰植株的株高较GL-3矮，茎粗与GL-3相比较细(图2)。

为了消除MdHB-7通过调节其他HD-Zip基因的表达影响植物生长的可能性，我们检查了GL-3和MdHB-7转基因植物中MdHD-Zips的表达水平；这些MdHD-Zips与MdHB-7具有较高的序列同一性，结果表明这些基因的表达在MdHB-7过表达和干扰株系均未受到显著影响(图3)。

因此，MdHB-7干扰株系的长势较弱是由于MdHB-7的表达受到影响，而不是其他MdHD-Zips的表达受到影响引起的。

将MdHB-7过表达和干扰转基因苹果进行60天的长期中度水分亏缺后，MdHB-7过表达转基因植株与GL-3相比，株高较高，茎粗较粗，而MdHB-7干扰植株最矮，茎干最细(图2)；另外，在长期中度水分亏缺处理60天后，MdHB-7过表达苹果植株的长势均优于GL-3，而MdHB-7干扰株系的长势最差；60天的中度干旱理后，MdHB-7过表达苹果植株明显更高(图2)，并且积累的生物量要比GL-3高(图4(a)，图4(b))；干旱条件下，MdHB-7过表达转基因植物的WUE也比GL-3高(图4(c))。

长期中度水分亏缺条件下对叶片相对含水量的评估表明，MdHB-7过表达转基因植株的叶片相对含水量值比GL-3和RNAi植株高(图5(a))。

以上结果表明本发明中苹果MdHB-7过表达具有提高苹果植株在长期中度干旱胁迫下的生物量和WUE，具有创制高WUE的苹果种质资源的应用价值。

(2)MdHB-7对转基因苹果植株光合作用以及WUE的影响

光合作用是直接影响植物产量和WUE的关键生理过程，结果显示，在长期中度干旱条件下，MdHB-7过表达转基因植株中的Pn值显着高于GL-3，而MdHB-7干扰植株中的Pn值低于GL-3；在浇水条件良好的情况下各基因型植株间则没有发现这种差异(图5(c))；叶绿素是类囊体色素-蛋白质复合物的重要组成部分，如果叶绿素含量降低，该复合物的功能就会受到影响，从而降低叶绿体对光能的吸收，因为我们发现长期中度水分亏缺条件下MdHB-7过表达苹果植株的净光合速率较高(图5(c))，所以我们比较了不同基因型植株中的叶绿素含量；在正常条件下，GL-3和转基因植株中叶绿素的含量没有差异。干旱处理导致所有植物叶片的叶绿素含量下降，但MdHB-7过表达苹果植株中的叶绿素含量下降较少(图5(b))。这与MdHB-7过表达苹果植株的Pn值较高的发现相符。在水分充足和长期中度干旱条件下，MdHB-7过表达苹果植株的蒸腾速率也低于GL-3，WUEi则高于GL-3(图5(d),图5(e))。

此外，我们还测量了光系统II(PSII)光化学的最大光化学效率(Fv/Fm)。在正常浇水条件下，GL-3和转基因植株在Fv/Fm比值的差异不显著；

长期中度干旱处理60天后，与GL-3相比MdHB-7干扰植株中的叶绿素荧光受到显着抑制，Fv/Fm明显降低；而MdHB-7过表达苹果植株的Fv/Fm比值高于GL-3(图5(f))；

这些数据表明本发明中苹果MdHB-7过表达具有在长期中度干旱条件下维持植物较高的光合作用从而提高植物WUE的应用价值。

(3)MdHB-7对转基因苹果植株的叶片气孔密度以及WUE的影响

气孔密度与WUE高度相关，因为它对叶片水分流失具有重大影响，无论在正常生长条件还是长期中度水分亏缺条件下，MdHB-7过表达转基因苹果植株叶片气孔密度显着低于GL-3，而MdHB-7干扰株系的叶片气孔密度显着高于GL-3(图6(a)-(f))，因此，我们测试了正常浇水下叶片的失水率，发现在离体8小时后，MdHB-7过表达转基因株系的叶片失水率比GL-3植物低，表明MdHB-7过表达减慢了叶片失水速度，因此表明，由于MdHB-7过表达植物气孔密度降低从而减少了水分损失(图6(g))；

上述结果表明本发明中苹果MdHB-7的过表达具有降低转基因苹果植物气孔密度，减少水分散失，提高植物WUE的作用，为创制高WUE的苹果种质资源提供基因资源。

(4)MdHB-7对转基因苹果植株根系以及WUE的影响

根是植物从周围土壤吸收水分的主要器官，因此，根系被认为是不同干旱条件下WUE的关键决定因素之一。

正常浇水条件下，我们发现与GL-3植物相比，MdHB-7干扰株系的根长势最弱，且干重最低，GL-3和MdHB-7过表达转基因株系中根系长势和干重没有显著差异，这些结果表明MdHB-7在苹果根发育中具有潜在作用；

我们还发现长期中度干旱处理显著影响各基因型植物根生长及其干重：

经过2个月的长期中度干旱处理，与GL-3植物的根系相比，MdHB-7干扰株系的根要小得多，而MdHB-7过表达转基因株系的根要大的多，且干重更重(图7(a),图7(b))；

此外，我们还观察到在长期中度干旱处理下，与GL-3相比，MdHB-7过表达株系的根系活力被抑制程度较低且根系导水率高，而MdHB-7干扰株系的根系活力被抑制程度较高且根系导水率低(图7(c)，图7(d))。

如图1所示，本发明通过图1的技术路线图，对影响苹果植株水分利用率(WUE)的上述各指标进行了分别研究，最终证明苹果MdHB-7的过表达能够提高植物的水分利用率(WUE)。

以上结果表明，本发明中苹果MdHB-7的过表达具有减少干旱胁迫对根的伤害，提高根系导水能力，从而提高植物WUE，为以根系为利用价值，创制高WUE苹果种质资源方面提供了重要的基因资源。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。