一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法

摘要

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，包括如下步骤：用限制性内切酶酶切果实果色发育相关DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA；辣椒盛花坐果期，通过花粉管通道法将目的基因导入辣椒植株；设置正常对照组，观察并记录辣椒果实果色的表型变化，基于辣椒果实果色的表型变化判定对应的果实果色发育相关基因的功能。本发明可以实现辣椒果实果色发育相关基因功能的快速鉴定，是一种快速、有效鉴定植物基因功能的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法。

背景技术

辣椒（Capsicum annuum L.）属于茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum）， 一年或多年生草本植物，原产于中南美洲热带亚热带地区，现在世界各地普遍栽培，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一。

辣椒果实中含有叶绿素、类胡萝卜素、花青苷及类黄酮等多种色素，其中类胡萝卜素与辣椒果实颜色关系紧密，类胡萝卜素各组分相对含量的差异造成了辣椒果实颜色多样性。辣椒果色的形成与众多色素合成相关酶基因有关，但是，面对大量的果色相关的基因，如何鉴定基因功能成为一个亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，包括如下步骤：

S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirD1、VirD2、VirE2浓度分别调整至100μg/μL；

S2、用限制性内切酶酶切果实果色发育相关DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA；

S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，获取外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL的混合液A；

S4、取步骤S1所得溶液中的一种或几种共2μL，依次加入8μL混合液A，6μL脂质体混合后，加入30μL的缓冲液中，4℃静置2小时后，备用；

S5、辣椒盛花坐果期，通过花粉管通道法将目的基因导入辣椒植株；

S6、设置正常对照组，观察并记录辣椒果实果色的表型变化，基于辣椒果实果色的表型变化判定对应的果实果色发育相关基因的功能。

进一步地，所述缓冲液包含5-15mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.4-0.6mmol/L二氨基乙烷四乙酸，1-10mmol/L氯化钙、0.015μg·μL

进一步地，质粒DNA保护剂由介孔二氧化硅、磷酸钙保护剂按体积比10：1的比例混合所得。

进一步地，限制性内切酶为限制性内切酶Hind Ⅲ .+EcoR Ⅰ酶。

进一步地，实验组果色与对照组存在明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关，然后根据明显差异的特点，进一步判定果实果色基因的功能；相反，果实果色与对照相比没有明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。

本发明具有以下有益效果：

可以实现辣椒果实果色发育相关基因功能的快速鉴定，是一种快速、有效鉴定植物基因功能的方法。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，包括如下步骤：

S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirD1、VirD2浓度分别调整至100 μg/μL；

S2、用限制性内切酶酶切果实果色发育相关DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA；

S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，获取外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL的混合液A；

S4、取步骤S1所得的VirD1溶液、VirD2溶液各1μL，依次加入8μL混合液A，6μL脂质体混合后，加入30μL的缓冲液中，4℃静置2小时后，备用；

S5、辣椒盛花坐果期，通过花粉管通道法将目的基因导入辣椒植株；

S6、设置正常对照组，观察并记录辣椒果实果色的表型变化，基于辣椒果实果色的表型变化判定对应的果实果色发育相关基因的功能。

本实施例，所述缓冲液包含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.5mmol/L二氨基乙烷四乙酸，5.5mmol/L氯化钙、0.035μg·μL

本实施例中，质粒DNA保护剂由介孔二氧化硅、磷酸钙保护剂按体积比10：1的比例混合所得。

本实施例中，限制性内切酶为限制性内切酶Hind Ⅲ .+EcoR Ⅰ酶。

本实施例中，实验组果色与对照组存在明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关，相反，果实果色与对照相比没有明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。

实施例2

一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，包括如下步骤：

S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirD1、VirE2浓度分别调整至100 μg/μL；

S2、用限制性内切酶酶切果实果色发育相关DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA；

S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，获取外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL的混合液A；

S4、取步骤S1所得的VirD1溶液、VirE2溶液各1μL，依次加入8μL混合液A，6μL脂质体混合后，加入30μL的缓冲液中，4℃静置2小时后，备用；

S5、辣椒盛花坐果期，通过花粉管通道法将目的基因导入辣椒植株；

S6、设置正常对照组，观察并记录辣椒果实果色的表型变化，基于辣椒果实果色的表型变化判定对应的果实果色发育相关基因的功能。

本实施例，所述缓冲液包含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.5mmol/L二氨基乙烷四乙酸，5.5mmol/L氯化钙、0.035μg·μL

本实施例中，质粒DNA保护剂由介孔二氧化硅、磷酸钙保护剂按体积比10：1的比例混合所得。

本实施例中，限制性内切酶为限制性内切酶Hind Ⅲ .+EcoR Ⅰ酶。

本实施例中，实验组果色与对照组存在明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关，然后根据明显差异的特点，进一步判定果实果色基因的功能，每个实验组至少设置10组；相反，果实果色与对照相比没有明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。

实施例3

一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，包括如下步骤：

S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirD1、VirD2、VirE2浓度分别调整至100μg/μL；

S2、用限制性内切酶酶切果实果色发育相关DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA；

S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，获取外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL的混合液A；

S4、取步骤S1所得VirD1溶液、VirE2溶液各0.5μL、VirD2溶液1μL，依次加入8μL混合液A，6μL脂质体混合后，加入30μL的缓冲液中，4℃静置2小时后，备用；

S5、辣椒盛花坐果期，通过花粉管通道法将目的基因导入辣椒植株；

S6、设置正常对照组，观察并记录辣椒果实果色的表型变化，基于辣椒果实果色的表型变化判定对应的果实果色发育相关基因的功能。

本实施例，所述缓冲液包含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.5mmol/L二氨基乙烷四乙酸，5.5mmol/L氯化钙、0.035μg·μL

本实施例中，质粒DNA保护剂由介孔二氧化硅、磷酸钙保护剂按体积比10：1的比例混合所得。

本实施例中，限制性内切酶为限制性内切酶Hind Ⅲ .+EcoR Ⅰ酶。

本实施例中，实验组果色与对照组存在明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关，然后根据明显差异的特点，进一步判定果实果色基因的功能，每个实验组至少设置10组；相反，果实果色与对照相比没有明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。

经试验验证，可以实现辣椒果实果色发育相关基因功能的快速鉴定，准确率在98%左右，是一种快速、有效鉴定植物基因功能的方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。