一种基于比色适配体传感器快速检测抗生素的方法

摘要

本发明属于食品安全检测领域，具体为一种基于比色适配体传感器快速检测抗生素的方法，包括以下步骤：(1)磁性颗粒复合物、目标抗生素的适配体与待测样品或标准液混合孵育后，磁分离，取结合适配体的磁性颗粒复合物；所述的磁性纳米复合物为连接有待测的目标抗生素的磁珠；(2)结合适配体的磁性颗粒复合物用脱氧核苷酸及生物素修饰的脱氧核苷酸进行TdT扩增反应，在适配体的3’‑OH端延伸，磁分离取经过TdT扩增的磁性纳米复合物；(3)步骤(2)产物与亲和素修饰的辣根过氧化酶连接得到比色适配体传感器；(4)比色适配体传感器中加入过氧化氢和TMB，避光反应后磁分离，取上清液检测吸光度。该方法可以放大比色检测信号，从而提高检测灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体公开了一种基于TdT酶和磁珠的比色适配体传感器及利用该传感器快速检测抗生素的方法。

背景技术

抗生素是能影响其他细胞生长发育等正常生命活动的一类化学物质。现有常用的抗生素种类主要包括：氯霉素类、氨基糖甙类、大环内酯类、β-内酰胺类、林可霉素类、喹诺酮类、四环素类等。作为一类抗感染的药剂或抗菌促生长的饲料添加剂，抗生素在畜牧业、渔业等与食品相关的行业发挥了积极的作用。但是，随着抗生素滥用现象的频出，特别是人们在食品及饮用水中都能检测到抗生素，使得人们对这一问题越来越重视。食品中的抗生素残留是目前食品安全面临的一个重大问题。由于抗生素的大量广泛使用，其残留问题也变得越来越严重，人们日常生活中所吃的肉、蛋、奶及其制品等动物源性食品中也经常会检测到它的存在。由于抗生素残留于食物和水中，经过食物链的传递可在人体内积聚，严重者可能导致中毒，进而引起一系列过敏反应，如心律失常、听力丧失、恶心、呕吐、急性胰腺炎等症状。此外，滥用抗生素可导致细菌耐药性增加，使感染治疗变得更加困难。因此，抗生素的快速灵敏检测成为了食品行业一个亟待解决的问题。

传统的抗生素检测方法，如微生物检测法，其存在菌种筛选困难、检测效率不高及干扰因素过多等问题，有时候会出现样品不能有效检出等现象，还需要与其他方法联用才能得到最终结果；理化分析检测法，其主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等方法，但该方法程序复杂，检测费用昂贵，需要工作人员较为熟练的操作水平以及复杂繁琐的前处理过程；免疫检测法，它是通过抗原与抗体的特异性结合反应来实现检测，虽然该方法灵敏度比较高，但由于此法中抗体识别性能易受外界环境的影响，且检测结果假阳性率较高，容易产生交叉反应。另外，该法中生产小分子靶物质的抗体较为耗时且成本昂贵。因此，这些检测方法都有各自的局限性。

近年来，核酸适配体因适用范围广、操作相对简单快速、亲和力高以及实用性强等的优点，已经在检测方面脱颖而出了。核酸适配体是指通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从体外筛选得到的单链DNA或RNA，它是指可以与待测物特异性结合的单链寡聚核苷酸链。以适配体作为识别元件，结合不同的信号输出方式，就能得到不同的适配体生物传感器。

基于核酸适配体的传感器主要有以下几类：荧光适配体传感器、电化学适配体传感器、化学发光适配体传感器及比色适配体传感器等。荧光适配体传感器通常需要对适配体序列修饰荧光基团或者需要重金属作为荧光来源，而这些材料对环境则具有一定的破环性。电化学适配体传感器虽然灵敏度高，但是通常需要对电极进行繁琐的修饰以及极易受周围环境的影响。化学发光适配体传感器通常需要标记催化酶或者化学发光分子，而且该发光过程会发生裂变，从而导致结果不稳定；同时，该方法操作步骤繁琐，测试的成本也比较高。

尽管近年来，抗生素的快速检测已经得到了迅速的发展，但是要实现快速、灵敏、成本低的检测还是很有局限性的。因此，本发明提供了一种快速检测抗生素的比色适配体传感器。

比色适配体传感器规避了以上适配体传感器的弊端，不需要精密的仪器以及繁琐的操作就可以用肉眼直观地观察到颜色的改变，由于其成本低、简单、实用，因而被广泛的应用于与食品、医疗相关的小分子、金属离子的检测中。

目前存在的比色适配体传感器仍然存在检测限不够低，检测范围不够广以及不能实现现场快速检测的问题。因此，开发一种灵敏、快速的比色适配体传感器是十分有必要的。功能化核酸适配体以及纳米材料的发展，为构建新型的基于比色适配体传感器检测抗生素，创建了全新的平台。

发明内容

本发明涉及提供了一种基于比色适配体传感器快速检测抗生素的方法。

本发明方案为，一种基于比色适配体传感器快速检测抗生素的方法，步骤包括：

(1)磁性颗粒复合物、目标抗生素的适配体与待测样品或标准液混合孵育后，磁分离，取结合适配体的磁性颗粒复合物；

所述的磁性纳米复合物为连接有待测的目标抗生素的磁珠，优选的，磁珠为粒径0.5～5μm的四氧化三铁；更优选的，粒径为0.5～1μm；

(2)结合适配体的磁性颗粒复合物用脱氧核苷酸及生物素修饰的脱氧核苷酸进行TdT扩增反应，在适配体的3’-OH端进行单核苷酸链的延伸，磁分离，取经过TdT扩增的磁性纳米复合物；

(3)步骤(2)产物与亲和素修饰的辣根过氧化酶连接得到比色适配体传感器；

(4)比色适配体传感器中加入过氧化氢和TMB，避光反应后磁分离，取上清液检测吸光度。

优选的，根据检测的吸收值及标准曲线，可测定待测样品中抗生素的含量。

步骤(1)磁性颗粒复合物制备方法为：表面带氨基的四氧化三铁磁珠表面经过醛基化处理，用MES和EDC偶联，连接待测的目标抗生素。

步骤(1)中，在孵育之前，用蛋白封闭磁性颗粒复合物。优选的，用BSA蛋白封闭磁性颗粒复合物。封闭的目的是封闭磁珠的活性位点，防止磁珠发生非特异性的吸附，进而使背景值升高。

步骤(1)中，孵育时目标抗生素的适配体在90～95℃变性3～10min后降至室温再与磁性纳米复合物和待测样品混合。其目的是为了打开适配体的二级结构，从而使适配体更加高效地与靶标结合。

步骤(1)的孵育条件为，取磁性纳米复合物与目标抗生素的适配体、待测样品或者标准溶液混合充分，35～38℃恒温孵育0.5～2h。优选的，在37℃恒温孵育1h。

步骤(2)TdT扩增反应条件为：结合适配体的磁性纳米复合物中加入缓冲液、TdT酶、脱氧核苷酸及生物素修饰的脱氧核苷酸，混合后35～38℃恒温孵育0.5～1h。优选的，在37℃恒温孵育；更优选的，在37℃恒温孵育40min。

扩增体系pH值为7.4。

生物素修饰的脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比为1：0.5～2，优选为1：0.6～1.5，更优选为1：0.75。

所述的脱氧核苷酸为dATP，生物素修饰的脱氧核苷酸为Biotin-dUTP。dATP与生物素修饰的脱氧核苷酸为Biotin-dUTP。

步骤(3)的方法为：步骤(2)产物与亲和素修饰的辣根过氧化酶混合，避光反应15～30min，优选为15min，磁分离去除未反应的亲和素修饰的辣根过氧化酶。

优选的，步骤(2)产物先进行封闭，再用亲和素修饰的辣根过氧化酶孵育。

步骤(4)中，TdT扩增的磁性纳米复合物与亲和素修饰的辣根过氧化酶孵育后磁分离，去除未反应的亲和素修饰的辣根过氧化酶，产物比色适配体传感器中加入含有H

本方法是利用一种新型的基于磁珠和末端脱氧核苷酸转移酶的竞争型比色适配体传感器，旨在进一步提高传感器的灵敏度。磁珠预先与目标检测物抗生素连接起来，形成磁性复合材料。磁性复合材料会与溶液中游离的待测样共同竞争溶液中的适配体(aptamer)，这样，aptamer就会固定在磁性纳米材料的表面。当加入末端脱氧核苷酸转移酶和生物素化的碱基，生物素化的碱基就会在aptamer上进行TdT扩增，从而实现信号放大。由于生物素与亲和素会发生特异性结合，当存在亲和素化的辣根过氧化物酶(avidin-horseradish peroxidase,avidin-HRP)时，avidin-HRP会偶连在磁性纳米复合物上，从而催化TMB介导的H

本发明的方案通过末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase,TdT)对抗生素适配体的3’-OH端进行核酸扩增，进而实现比色放大检测。与之前的传感器相比，由于加入了TdT酶，从而使适配体捕获抗生素的信号得到了进一步的放大；使用磁性材料，通过磁分离技术，使得溶液(含avidin-HRP)便于清洗，从而使得背景噪声变低；因降低了背景值，检测精度和灵敏度都极大的提升。二者相互协同，从而使比色检测的灵敏度大大提高。这是对现有比色适配体传感器的一种改进。

以卡那霉素为例，检测限可以达到0.01nM，而且在0.01～500nM范围内有良好的线性关系。

本发明的有益效果在于，针对现有的比色适配体传感器存在灵敏度低以及难以实现现场快速检测的问题，提出了一种快速检测抗生素的基于磁珠和TdT的比色适配体传感器的制备方法，通过TdT酶对适配体捕获抗生素这一信号的放大，比原来直接检测适配体捕获靶标的信号有了显著的提高，进而提高了该传感器的灵敏度。该比色适配体传感器的制备可以实现高效、实用、低成本、高灵敏度地快速检测抗生素及一些小分子物质。

附图说明

图1为磁性颗粒复合物TdT扩增示意图

图2为比色适配体传感器检测不同浓度卡那霉素的吸光度

图3为为色适配体传感器颗粒652nm处吸光度与卡那霉素对数浓度的拟合曲线

图4为进行TdT扩增和省略TdT扩增的吸光度对比

具体实施方式

以下结合具体的实施例来对本发明的技术方案加以说明。

实施例1卡那霉素的检测

(1)氨基磁珠醛基化

即氨基磁珠活化，具体步骤如下：用移液枪移取从美国Polysciences，Inc.购买的8600-10氨基磁珠(粒径1.5μm)3mL(150mg)到50mL离心管；加24mL 0.01M的吡啶缓冲液，在室温下剧烈震荡混合均匀后，进行磁分离，弃去上清液，该过程重复三次；之后加入12mL5％(体积分数)的戊二醛溶液(用0.01M的吡啶缓冲液稀释配制)，在非磁性混合设备即恒温摇床振荡器中25℃避光震荡3h，以保证磁珠和戊二醛溶液充分混合；然后进行磁分离去除未反应完的戊二醛溶液，用24mL 0.01M的吡啶缓冲液反复清洗3-4次，直至溶液澄清后，进行磁分离，移除上清液；最终，将磁珠加入15mL 0.01M的PBS中重悬，4℃储存备用。

(2)磁性纳米复合物的制备

磁性纳米复合物采用碳二乙胺交联法制备，详细的制备步骤如下：

取2mL(20mg)的醛基化磁珠于15mL离心管中，离心吸取上清液丢弃，加入2mL 20mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate,MES)偶联液洗涤3次；之后加入2mL 20mM的MES偶联液和2mL20mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)溶液重悬磁珠，于恒温摇床振荡器25℃下避光活化3h；磁分离后，用2mL 20mM MES偶联液洗涤3次；加入4mL100g/L的硫酸卡那霉素，在25℃下放于恒温摇床振荡器中避光孵育震荡6h，之后进行磁分离，弃去上清液；最后将产物用4mL的清洗缓冲液(0.01M PBS,1mM MgCl

(3)磁性纳米复合物、适配体及游离待测物的孵育：

取能够特异性识别卡那霉素Kanamycin的适配体序列，将适配体序列以及不同浓度的游离卡那霉素同提前制备好的磁珠-卡那霉素磁性复合物一起孵育，游离的卡那霉素会与磁珠-卡那霉素共同竞争aptamer。步骤为：

取5μL磁珠纳米复合物，磁分离去除上清液，加入50μL 2％的BSA溶液室温下封闭40min。封闭的目的是封闭磁珠的活性位点，防止磁珠发生非特异性的吸附，进而使背景值升高。

封闭结束后，磁分离去除上清液，加入20μL 500nM待测样的适配体(90℃变性5min，后缓慢降至室温，这样操作的目的是为了打开适配体的二级结构，从而使适配体更加高效地与靶标结合)以及20μL不同浓度的硫酸卡那霉素溶液(0、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、500nM)，将离心管放于旋涡振荡器上振荡以保证适配体和待测样混合均匀充分反应，之后放入恒温金属浴于37℃孵育1h。孵育结束后，磁分离去除上清，将产物用清洗缓冲液冲洗三次。

Kanamycin aptamer序列为：

5′-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA GTC AC-3′

由生工生物工程(上海)有限公司合成。

(4)TdT扩增反应：

将上述产物依次加入14.8μL 50mM的Tris-HCl(PH＝7.4)，4μL 5×ReactionBuffer，0.4μL 1mM的Biotin-11-dUTP，0.3μL 1mM的dATP，0.5μL 20U/μL的TdT酶。之后将该扩增体系放于37℃恒温浴中孵育40min，以保证TdT酶可以充分地催化aptamer的3’-OH末端，从而使aptamer进行链的延伸。反应结束后进行磁分离操作技术，以便使未反应的TdT酶从该体系中分离出来，用清洗缓冲液清洗3遍，从而得到TdT扩增产物。

其原理示意图如图1所示。

(5)亲和素修饰的辣根过氧化酶(avidin-HRP)与磁性纳米材料孵育：

将上述产物用50μL 4％的BSA溶液进行封闭，封闭时间为40min，进行此操作的原因是：将磁珠上的活性位点封闭，以免使磁珠发生非特异性吸附，进而影响反应的灵敏度。封闭结束后，进行磁分离操作，除去多余的BSA溶液。将上述产物加入2μL稀释1000倍的avidin-HRP，避光反应20min。然后进行磁分离将未反应的avidin-HRP除去，得到比色适配体传感器。

(6)TMB显色反应：

磁分离操作之后将上述溶液加入50μL 0.01M的PBS缓冲液清洗四到六遍，直至溶液不再浑浊即完成了清洗步骤，之后进行磁分离操作弃去上清的清洗液。将上述产物比色适配体传感器中加入含有2mM H

适配体捕获靶标结束后，加入TdT酶以及生物素化的碱基对aptamer进行TdT扩增，扩增结束后加入avidin-HRP，这样HRP就会通过生物素和亲和素的特异性结合从而固定在aptamer上。加入TMB后，HRP就会催化TMB形成氧化型的TMB，从而使溶液呈现蓝色，在特定的波长652nm处有相应的吸收值。对照组中不加游离的卡那霉素即游离卡那霉素的浓度为0nM时，由于无竞争反应出现，所以磁珠上固定的适配体是最多的，652nm处的OD值也最大；实验组的适配体的量取决于游离的卡那霉素的浓度，游离卡那霉素的浓度越大，竞争效果越明显，溶液中游离卡那霉素捕获的适配体的量就越多，磁珠复合物上固定的卡那霉素的适配体就越少，652nm处的OD值也就越小。紫外吸收值与游离卡那霉素的浓度呈现负相关。652nm处实验组与对照组吸光度的差值与游离卡那霉素的浓度会呈现一定的相关性，从而可以定量的检测卡那霉素的浓度。

结果如图2、3所示，在0.01～500nM范围内都有良好的灵敏度和线性关系。

吸光度与卡那霉素对数浓度的线性拟合方程：

ΔA＝0.1895logC

以0.01nM卡那霉素为检测对象，采用上述方法进行检测，以及省略TdT扩增步骤的检测检测结果对比如图4所示。可以看到，TdT反应可以有效增强信号。

实施例2

选取能够特异性识别链霉素Streptomycin的适配体序列，对照组是将适配体序列、去离子水和提前制备好的磁珠-链霉素磁性复合物一起孵育，适配体就会与磁珠-链霉素充分反应；实验组则是将适配体序列以及不同浓度的游离链霉素同提前制备好的磁珠-链霉素磁性复合物一起孵育，游离的链霉素会与磁珠-链霉素共同竞争aptamer，从而使磁珠复合物上固定的适配体有所减少。其余操作同实施例1。

特异性识别链霉素的适配体(Streptomycin aptamer)由生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列如下：

5′-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC CGG GGT CTG GTG TTC TGC TTT GTT CTGTCG GGT CGT CTG CAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3′

适配体捕获靶标结束后，加入TdT酶以及生物素化的碱基对aptamer进行TdT扩增，扩增结束后加入avidin-HRP，这样HRP(辣根过氧化酶)就会通过生物素和亲和素的特异性结合从而固定在aptamer上。加入TMB后，HRP就会催化TMB形成氧化型的TMB，从而使溶液呈现蓝色，在特定的波长652nm处有相应的吸收值。对照组中不加游离的链霉素即游离链霉素的浓度为0nM时，由于无竞争反应出现，所以磁珠上固定的适配体是最多的，652nm处的OD值也最大；实验组的适配体的量取决于游离的链霉素的浓度，游离链霉素的浓度越大，竞争效果越明显，溶液中游离链霉素捕获的适配体的量就越多，磁珠复合物上固定的链霉素的适配体就越少，652nm处的OD值也就越小。紫外吸收值与游离链霉素的浓度呈现负相关。652nm处实验组与对照组吸光度的差值与游离链霉素的浓度会呈现一定的相关性，从而可以定量的检测链霉素的浓度。