动物细胞的悬浮培养用添加物、悬浮培养用培养基和悬浮培养方法

摘要

本发明涉及含有水溶性聚合物的动物细胞的悬浮培养用添加物和培养基、以及包括用含有水溶性聚合物的培养基对动物细胞进行悬浮培养的动物细胞的悬浮培养方法，根据本发明，能够提供在动物细胞的悬浮培养中，可抑制因搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激导致的胰岛素等培养基成分的析出、提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质的动物细胞的悬浮培养用添加物、悬浮培养用培养基和悬浮培养方法。

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞的悬浮培养用添加物、悬浮培养用培养基和悬浮培养方法。

发明背景

以胚胎干细胞、人工多能干细胞等干细胞为代表的大量动物细胞通过使用基质胶、玻连蛋白、层粘连蛋白等人型重组基质等作为支撑材料的粘附培养来生长和维持。

然而，为了将动物细胞应用于研究、物质生产、医疗等，需要高效增殖的培养方法。作为大量培养动物细胞的方法，广泛使用的是用搅拌叶片搅拌而进行悬浮培养的方法、使用蠕动泵使培养基回流而进行培养的方法、一边使用喷淋器从底面进行气体通风一边进行培养的方法等。

此外，很多动物细胞的培养中使用不含可能含有未知的因子、朊病毒、病毒等的血清的无血清培养基、白蛋白含量少的低白蛋白培养基，但有报告称，如果使用上述培养基进行上述那样的伴有搅拌等的悬浮培养，则培养基中会发生析出，推测该析出物有可能是，无血清培养基、低白蛋白培养基中作为细胞增殖所必需的因子所添加的胰岛素由于搅拌、回流、气体通风等导致的物理刺激而析出(非专利文献1)。

如果发生上述培养基成分的析出，则细胞的增殖减少，因此为了进行高效的动物细胞培养，希望抑制那样的析出。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：D.Massai等,科学报告(Sci.Rep.)7 3950(2017)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于上述情况做出的。本发明人等通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法(MALDI－TOFMS)对使用无血清培养基、低白蛋白培养基的悬浮培养中由于物理刺激而产生的析出物为胰岛素进行了确认。

因此，本发明的目的在于，提供能够在动物细胞的悬浮培养中抑制搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激导致的胰岛素等培养基成分的析出、提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质的动物细胞的悬浮培养用添加物、悬浮培养用培养基和悬浮培养方法。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过在含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基中添加水溶性聚合物，能够很好地抑制由于物理刺激而产生的胰岛素等培养基成分的析出，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下方案。

[1]一种动物细胞的悬浮培养用添加物，含有水溶性聚合物。

[2]根据[1]所述的添加物，水溶性聚合物为具有表面活性的非离子性水溶性聚合物。

[3]根据[2]所述的添加物，具有表面活性的非离子性水溶性聚合物为选自由聚乙烯醇、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物和聚氧乙烯山梨聚糖单脂肪酸酯组成的组的1种或2种以上。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的添加物，动物细胞为干细胞。

[5]根据[4]所述的添加物，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的添加物，其为用于抑制培养基成分的析出的添加物。

[7]根据[6]所述的添加物，培养基成分为胰岛素。

[8]一种动物细胞的悬浮培养用培养基，含有水溶性聚合物。

[9]根据[8]所述的培养基，水溶性聚合物为具有表面活性的非离子性水溶性聚合物。

[10]根据[9]所述的培养基，具有表面活性的非离子性水溶性聚合物为选自由聚乙烯醇、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物和聚氧乙烯山梨聚糖单脂肪酸酯组成的组的1种或2种以上。

[11]根据[8]～[10]中任一项所述的培养基，其用于干细胞的悬浮培养。

[12]根据[11]所述的培养基，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。

[13]根据[8]～[12]中任一项所述的培养基，培养基成分的析出受到抑制。

[14]根据[13]所述的培养基，培养基成分为胰岛素。

[15]一种动物细胞的悬浮培养方法，包括用含有水溶性聚合物的培养基对动物细胞进行悬浮培养。

[16]根据[15]所述的培养方法，水溶性聚合物为具有表面活性的非离子性水溶性聚合物。

[17]根据[16]所述的培养方法，具有表面活性的非离子性水溶性聚合物为选自由聚乙烯醇、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物和聚氧乙烯山梨聚糖单脂肪酸酯组成的组的1种或2种以上。

[18]根据[15]～[17]中任一项所述的培养方法，动物细胞为干细胞。

[19]根据[18]所述的培养方法，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。

[20]根据[15]～[19]中任一项所述的培养方法，通过进行搅拌、振荡、回流或气体通风来进行悬浮培养。

[21]根据[15]～[20]中任一项所述的培养方法，用培养基成分的析出受到抑制的培养基对动物细胞进行悬浮培养。

[22]根据[21]所述的培养方法，培养基成分为胰岛素。

[23]根据[15]～[22]中任一项所述的培养方法，使动物细胞形成细胞团块而进行悬浮培养。

发明的效果

根据本发明，能够提供一种添加物，其通过添加在含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基中，能够很好地抑制由于搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激而产生的胰岛素等培养基成分的析出。

此外，根据本发明，能够提供一种含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基，即使施加搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激，胰岛素等培养基成分的析出也会被很好地抑制，可以使用含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基，一边进行搅拌、振荡、回流、气体通风等一边进行动物细胞的悬浮培养。

结果，能够高效形成大小受到控制的细胞团块，能够提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质。

尤其是对干细胞等未分化细胞在用维持培养基进行维持培养时和用分化诱导培养基分化诱导时，培养基成分的析出均受到抑制，能够提高维持培养时的未分化维持率、分化诱导时的分化率双方。

附图说明

图1为显示实施例2中聚乙烯醇(PVA)和泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)的各添加浓度对胰岛素的析出抑制效果的影响的图。图中的标尺表示500μm。

图2为显示实施例3中泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)的添加浓度对人iPS细胞的细胞增殖率、细胞存活率和未分化维持率的影响的图。

图3为显示实施例4中泊洛沙姆(Kolliphor P407)的添加浓度对人iPS细胞的细胞增殖率的影响的图。

图4为显示实施例5中聚乙烯醇(PVA)的添加浓度对人iPS细胞的细胞增殖率的影响的图。

图5为显示实施例6中聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Kolliphor PS20)的添加浓度对人iPS细胞的细胞增殖率的影响的图。

图6为显示实施例7中泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)对搅拌导致的胰岛素析出的效果的图。图中的标尺表示100μm。

图7为显示实施例8中泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)和聚乙烯醇(PVA)对回流导致的胰岛素析出的效果的图。上部的图中的标尺表示500μm。下部的图为将上部的图放大而得的图，图中的标尺表示100μm。

图8为显示实施例9中泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)和聚乙烯醇(PVA)对搅拌导致的胰岛素析出的效果的图。图中的标尺表示500μm。

图9为显示实施例10中泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)的添加对人iPS细胞的分化诱导的影响的图。

具体实施方式

本发明提供在含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基中添加的动物细胞的悬浮培养用添加物(以下在本说明书中也称为“本发明的添加物”)。

本发明的添加物含有水溶性聚合物。

本发明中，“水溶性聚合物”是指分子内具有亲水性基团、与水混合或在水中溶解的聚合物。本发明中，优选使用25℃时在水中的溶解度为5重量％以上的物质。

此外，作为水溶性聚合物没有特别限定，通常使用通过尺寸排阻色谱测得的重均分子量为1,000～100,000左右的显示水混合性或水溶性的聚合物。

作为该水溶性聚合物，可例示例如：羧基乙烯基聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯多元醇脂肪酸部分酯(聚氧乙烯甘油脂肪酸部分酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸部分酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸部分酯等)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯烷基胺等聚氧乙烯型非离子性表面活性剂，聚氧乙烯聚氧丙烯无规共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯型非离子性表面活性剂，聚甘油脂肪酸酯等聚甘油型非离子性表面活性剂等。

为了实现本发明的目的，作为水溶性聚合物，优选使用具有表面活性的非离子性水溶性聚合物，作为优选的水溶性聚合物，可例示聚乙烯醇、聚氧乙烯型非离子性表面活性剂、聚氧乙烯聚氧丙烯型非离子性表面活性剂和聚甘油型非离子性表面活性剂。其中，更优选使用聚乙烯醇、聚氧乙烯多元醇脂肪酸部分酯和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆)，特别优选使用聚乙烯醇、聚氧乙烯山梨聚糖单脂肪酸酯(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯等)和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆)。

本发明的添加物中，可以选择并单独使用1种水溶性聚合物，也可以选择并用2种以上水溶性聚合物。

本发明的添加物中水溶性聚合物的含量以添加在培养基中时培养基组合物中的水溶性聚合物的含量在后述含量范围内的方式进行设定。

本发明中，可以直接将上述水溶性聚合物作为本发明的添加物，此外，也可以制成在水、多元醇等溶剂中溶解或分散的水溶液、分散液等液体形态，或者与赋形剂、粘合剂等一般在制剂化中使用的添加剂混合，进行颗粒调整、造粒、打锭等，制成粉末状、颗粒状、锭剂状等固体形态的添加物。

此外，还可以将上述水溶性聚合物与碳水化合物、无机盐等以下所述培养基成分的一部分混合，调制成本发明的添加物。

从容易向动物细胞的悬浮培养用培养基添加且容易与培养基混合的观点出发，本发明的添加物优选以液状、粉末状、颗粒状、锭剂状等形态提供。

本发明的添加物优选进行灭菌处理而调制。灭菌处理的方法没有特别限制，可列举例如121℃高压釜灭菌20分钟、放射性灭菌、环氧乙烷气体灭菌、过滤器过滤灭菌等，可以根据本发明的添加物的形态等适当选择。

本发明的添加物可以添加在后述动物细胞的悬浮培养用培养基的成分中，用于动物细胞的悬浮培养用培养基的调制，此外，也可以添加在后述动物细胞的悬浮培养用培养基中进行使用。

通过将本发明的添加物添加在含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基中，尤其在所述动物细胞的悬浮培养用培养基为无血清培养基或低白蛋白培养基时，能够很好地抑制由于搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激而产生的胰岛素等培养基成分的析出，能够高效形成大小受到控制的细胞团块，能够提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质。

本发明的添加物通过添加在干细胞等未分化细胞的维持培养基、分化诱导培养基中，能够抑制维持培养和分化诱导时培养基成分的析出，能够提高维持培养时的未分化维持率、分化诱导时的分化率这两者。

本发明还提供一种动物细胞的悬浮培养用培养基(以下在本说明书中也称为“本发明的培养基”)。

这里，作为动物细胞，可列举哺乳动物来源的正常细胞、干细胞和前体细胞。

作为哺乳动物来源的正常细胞，可列举精子、卵子等生殖细胞、构成生物体的体细胞。

作为构成生物体的体细胞的例子，可列举但不限定于以下细胞：成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周细胞、树突状细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞(例如角化细胞(keratinocyte)、角质细胞等)、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵母细胞、神经细胞、胶质细胞、少突胶质细胞(Oligodendrosite)、小胶质细胞(Microglia)、星形胶质细胞(Astrocyte)、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如平滑肌细胞、骨骼肌细胞)、胰β细胞、黑色素细胞和单核细胞等。

该体细胞中，包括例如从皮肤、肾脏、脾脏、副肾、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(包括脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑、神经组织等任意组织获取的细胞。

干细胞是指具有自我复制能力和分化为其他种类细胞的能力、能够无限增殖的细胞。

可列举例如：造血干细胞、卫星细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、嗅粘膜干细胞、神经嵴干细胞、肝干细胞、胰干细胞、筋干细胞、生殖干细胞、肠管干细胞、毛包干细胞等成体干细胞，胚胎干细胞(ES细胞)、胚性肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞，癌干细胞等。

前体细胞是处于从前述干细胞向特定体细胞、生殖细胞分化的中间阶段的细胞，可列举卫星细胞、胰前体细胞、血管前体细胞、血管内皮前体细胞、造血前体细胞(脐带血来源的CD34阳性细胞等)。

本发明的培养基优选作为干细胞的悬浮培养用培养基提供，更优选作为成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞的悬浮培养用培养基提供，进一步优选作为胚胎干细胞和人工多能干细胞的悬浮培养用培养基提供。

本发明的培养基中，与上述动物细胞的悬浮培养中通常使用的培养基成分一起，含有水溶性聚合物。

关于本发明的培养基中含有的水溶性聚合物，如上文本发明的添加物中所述，本发明的培养基中，可以单独含有1种水溶性聚合物，或者组合含有2种以上水溶性聚合物。

本发明中，水溶性聚合物可以以调制成上述本发明的添加物的状态与前述培养基成分一起含有，或者也可以直接对培养基成分进行添加。

关于本发明的培养基中水溶性聚合物的含量，作为培养时的终浓度，通常为0.1μg/mL～10mg/mL，优选为1μg/mL～5mg/mL，更优选为10μg/mL～5mg/mL，进一步优选为10μg/mL～1mg/mL。

作为本发明的培养基中可含有的培养基成分，可以列举动物细胞的培养中通常使用的培养基成分，可列举例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖，天冬酰胺、天冬胺酸、谷氨酰胺、谷氨酸等氨基酸，白蛋白、转铁蛋白等蛋白质，双甘肽、大豆肽等肽，血清，维生素A、维生素B族(硫胺素、核黄素、吡哆醇、氰钴胺、生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等)、维生素C、维生素E等维生素，油酸、花生四烯酸、亚麻酸等脂肪酸，胆固醇等脂质，氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠等无机盐，锌、铜、硒等微量元素，N,N－双(2－羟乙基)－2－氨基乙磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonicacid(BES))、4－(2－羟乙基)－1－哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES))、N－[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine))等缓冲剂，两性霉素B、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素等抗生素，I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚L-赖氨酸、聚D-赖氨酸等细胞粘附因子和细胞外基质成分，白细胞介素、成纤维细胞增殖因子(FGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、转化增殖因子(TGF)－α、转化增殖因子(TGF)－β、血管内皮增殖因子(VEGF)、激活素A等细胞因子和增殖因子，地塞米松、氢化可的松、雌二醇、黄体酮、胰高血糖素、胰岛素等激素等；可以根据培养的动物细胞的种类选择使用适当的成分。

动物细胞为干细胞等未分化细胞时，可以在用于维持干细胞等未分化状态的维持培养基中添加抑制干细胞等的分化的成分。

此外，可以在诱导干细胞等分化的分化诱导培养基中添加诱导或促进干细胞等分化的成分。

作为抑制干细胞等的分化的成分，可列举例如作为胚胎干细胞的分化抑制因子的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)－β、抑制神经干细胞的分化的成骨因子(bone morphogenetic protein，BMP)、Notch蛋白质、抑制胚胎干细胞、iPS细胞的分化的多梳复合体等。

作为诱导或促进干细胞等的分化的成分，可列举例如将胚胎干细胞诱导为内胚层系细胞的激活素A、维甲酸、诱导iPS细胞向神经外胚层的分化的成骨因子(BMP)抑制剂(Noggin等)、转化生长因子(TGF)－β、诱导iPS细胞向中胚层的分化的细胞外分泌糖蛋白质(WNT)、诱导iPS细胞向中胚层、内胚层的分化的激活素、糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂等。

初期分化成外胚层系细胞、中胚层系细胞、内胚层系细胞后，向各器官、组织细胞分化时，可以根据想要分化诱导的器官、组织添加必要的增殖因子、营养因子等，例如使用脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、成骨因子(BMP)、肝细胞生长因子(HGF)等。

需说明的是，血清中有可能含有未知的因子、朊病毒、病毒等，因此，本发明的培养基优选不含血清作为培养基成分。此外，本发明的培养基作为人细胞的培养用培养基调制的情况下，优选不含来源于人以外的动物的成分。

此外，本发明中，水溶性聚合物可以在作为上述哺乳动物来源的正常细胞、干细胞和前体细胞等动物细胞的悬浮培养用的通用培养基中含有，制成本发明的培养基。

作为哺乳动物细胞来源的正常细胞的培养中使用的培养基，可列举杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)、Ham’s F12培养基(Ham’sNutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy’s 5A培养基(McCoy’s 5A medium)、最低必需培养基(Minimum Essential Medium)(MEM)、伊格尔最低必需培养基(Eagle’sMinimum Essential Medium)(EMEM)、α改良型伊格尔最低必需培养基(alpha ModifiedEagle’s Minimum Essential Medium)(αMEM)、罗斯威尔公园纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute)(RPMI)1640培养基、Iscove改良杜尔贝科培养基(Iscove’sModified Dulbecco’s Medium)(IMDM)、MCDB131培养基、威廉姆斯培养基E(William’sMedium E)、费舍尔培养基(Fischer’s Medium)等。

作为干细胞的培养中使用的培养基，可列举STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、mTeSR1培养基(干细胞技术(STEMCELLTechnologies)公司)、TeSR2培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、TeSR－E8培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、Essencial 8培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、HEScGRO(商标)Serum－Free Medium for hES cells(密理博(Millipore)公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPS Medium(EMD密理博(EMD Millipore)公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek)株式会社)、NutriStem(商标)XF/FF Cul ture Medium(史迪金(Stemgent)公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(Biological Industries Israel Beit-Haemek)株式会社)、S－medium(DSPharma生物医学株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF－FX培养基、CDM培养基、DEF－CS 500Xeno－Free 3D Spheroid CultureMedium(赛拉提斯(Cellartis)公司)、StemFlex培养基(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司)等。

作为前体细胞的培养中使用的培养基，可列举HPGM(商标)(凯姆布雷克斯公司)、QBSF－60(拜力生物公司)等。

此外，本发明中，也可以在干细胞等的分化诱导培养基中添加水溶性聚合物。

作为干细胞等的分化诱导培养基，可列举TeSR－E6培养基(干细胞技术(STEMCELLTechnologies)公司)、TeSR－E7培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、Essential 6(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司)等。

为了实现本发明的目的，优选使用无饲养层的动物细胞培养用培养基，进一步，更优选使用无血清培养基或低白蛋白培养基，此外，用于人细胞的培养用培养基中时，优选不含来源于人以外的动物的成分的培养基(Xeno-Free培养基)。

此外，从更显著地获得本发明的效果出发，优选本发明的培养基为无血清培养基或低白蛋白培养基，并且含有胰岛素。

进一步，从用于动物细胞的悬浮培养的观点出发，本发明的培养基优选制成溶液、分散液等液体形态。

本发明的培养基可以按照公知的组成，将从上述培养基成分适当选择的成分与水溶性聚合物一起添加在水等溶剂中，溶解或分散从而调制。

此外，本发明的培养基可以在由各公司、各机构提供的上述动物细胞培养用培养基中添加水溶性聚合物，溶解或分散从而调制。

进一步，本发明的培养基也可以制成下述状态：比使用时的浓度浓缩的状态；调制成冷冻干燥的粉末状状态，使用时用水等溶剂稀释或在水等溶剂中溶解而使用。

本发明的培养基优选实施上述那样的灭菌处理而调制。

使用本发明的培养基对动物细胞进行悬浮培养时，能够很好地抑制由于搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激而产生的胰岛素等培养基成分的析出，能够高效形成大小受到控制的细胞团块，能够提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质。

本发明的培养基可以作为干细胞等未分化细胞的维持培养用的培养基、以及作为分化诱导用培养基适当使用，干细胞等未分化细胞的维持培养或分化诱导时，能够抑制培养基成分的析出，能够提高维持培养时的未分化维持率、分化诱导时的分化率这两者。

进一步，本发明提供一种动物细胞的悬浮培养方法(以下在本说明书中也称为“本发明的培养方法”)。

本发明的培养方法包括使用含有水溶性聚合物的动物细胞的悬浮培养用培养基对动物细胞进行悬浮培养。

关于“含有水溶性聚合物的动物细胞的悬浮培养用培养基”如上所述，本发明中，动物细胞的悬浮培养用培养基中含有的水溶性聚合物可以作为上述本发明的添加物调制并添加，也可以直接添加水溶性聚合物本身。

此外，本发明中，关于水溶性聚合物，作为培养时的终浓度，通常以形成0.1μg/mL～10mg/mL的浓度的方式在培养基中添加，优选以形成1μg/mL～5mg/mL的浓度的方式在培养基中添加，更优选以形成10μg/mL～5mg/mL的浓度的方式在培养基中添加，进一步优选以形成10μg/mL～1mg/mL的浓度的方式在培养基中添加。

本发明的培养方法中，动物细胞的悬浮培养可以按照通常的悬浮培养方法来进行。即，根据培养规模，使用适当的细胞培养用平板、细胞培养培养瓶、生物反应器等培养器具或培养装置，在上述本发明的培养基或添加有本发明的添加物的动物细胞的悬浮培养用培养基中接种动物细胞，通常在25℃～39℃、优选在33℃～39℃下，通常在4体积％～10体积％、优选在4体积％～6体积％的二氧化碳存在下，此外通常在1体积％～25体积％、优选在4体积％～20体积％的氧存在下，通常进行1天～30天、优选进行2天～14天培养。需说明的是，每隔2～3天进行培养基更换。

培养基更换可以是，在通过离心分离、过滤使动物细胞与培养基分离后，在动物细胞中添加新的培养基。或者，可以在通过进行离心分离、过滤使动物细胞适当浓缩后，在该浓缩细胞液中添加新的培养基。

上述离心分离时的重力加速度(G)通常为50G～1,000G，优选为100G～500G，过滤中使用的过滤器的细孔大小通常为10μm～200μm。

本发明的培养方法可以进行搅拌、振荡、回流、气体通风等而实施。

搅拌可以使用生物反应器、带有搅拌叶片的培养槽等来进行。

搅拌通常以10rpm～2,000rpm、优选以40rpm～1,000rpm的搅拌速度进行。

振荡可以使用振荡机、振荡培养机来进行。

振荡通常以10rpm～500rpm、优选以50rpm～250rpm的振荡速度进行。

回流可以使用蠕动泵、油管泵等来进行。作为回流用管，使用有机硅、尼奥普林(氯丁橡胶)、Marprene(聚丙烯/乙丙橡胶)制等蠕动泵用管、油管泵用管等。

回流通常以10μL/分钟～1000mL/分钟、优选以1mL/分钟～100mL/分钟的流速进行。

气体通风可以使用微喷淋器、过滤喷淋器等各种喷淋器来进行。

气体通风通常可以以1mL/分钟～1000mL/分钟、优选以50mL/分钟～200mL/分钟的通风量来进行。

为了高效获得大小受到控制的细胞团块，动物细胞的悬浮培养优选通过搅拌或振荡来实施。

培养的动物细胞可以通过离心分离或使用过滤器过滤进行回收。

离心分离是在50G～1,000G、优选在100G～500G进行1分钟～10分钟左右。

此外，过滤可以使用具有10μm～200μm左右的细孔的过滤器来进行。

培养的动物细胞优选使用含有干细胞冻存液(STEM－CELLBANKER)(日本全药工业株式会社)等冷冻保护剂的冷冻用培养基在液氮中保存。

通过本发明的培养方法进行搅拌、振荡、回流、气体通风等实施动物细胞的悬浮培养时，能够很好地抑制由于物理刺激而产生的胰岛素等培养基成分的析出，能够形成大小受到控制的细胞团块进行悬浮培养。结果，能够提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质。

本发明的培养方法在干细胞等未分化细胞的维持培养和分化诱导中均可适当使用，在干细胞等未分化细胞的维持培养或分化诱导时，能够抑制培养基成分的析出，能够提高维持培养时的未分化维持率、分化诱导时的分化率双方。

实施例

以下通过实施例进一步详细地对本发明进行说明。

以下的实施例中，使用下述干细胞培养用培养基和下述水溶性聚合物，作为干细胞，使用未分化的人iPS细胞(hiPSC)，如下所述通过搅拌进行悬浮培养。

(1)作为干细胞培养用培养基，使用Essential 8培养基(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)公司，A1517001)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)和后述的分化诱导培养基。

(2)作为水溶性聚合物，使用聚乙烯醇(PVA)(日本合成化学工业株式会社，EG-03P)、泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)(Kolliphor(Kolliphor)(注册商标)P188 BIO)(巴斯夫(BASF)公司)、泊洛沙姆(聚氧乙烯(202)聚氧丙烯(56)嵌段共聚物)(Kolliphor(Kolliphor)(注册商标)P407)(巴斯夫(BASF)公司)、泊洛沙姆(聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)嵌段共聚物)(Kollisolv(Kollisolv)P124)(巴斯夫(BASF)公司)、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯(Kolliphor(Kolliphor)PS 20(巴斯夫(BASF)公司)、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯(Kolliphor(Kolliphor)PS 40)(巴斯夫(BASF)公司)和聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯(Kolliphor(Kolliphor PS 80)(巴斯夫(BASF)公司)。

(3)搅拌导致的培养基中胰岛素的析出的评价

作为搅拌培养器材，使用5mL容量的一次性使用生物反应器(ABLE株式会社(ABLECorporation)，S-1467)。在前述培养器材中添加5mL培养基，在37℃、5体积％二氧化碳和20体积％氧的条件下，以120rpm进行24小时搅拌。然后，将培养基移至6孔细胞培养板，用倒置显微镜(“CKX41”，奥林巴斯株式会社(Olympus Corporation)，倍率＝40倍)进行观察，进行照片拍摄。

(4)未分化人iPS细胞(hiPSC)通过搅拌进行的悬浮细胞培养

作为未分化人iPS细胞(hiPSC)，使用1210B2株的hiPS细胞(参照Nakagawa,M.等,Sci.Rep.4,3594,2014)。

通过搅拌进行的悬浮细胞培养中，使用5mL容量一次性使用生物反应器(ABLE株式会社(ABLE Corporation)，S-1467)作为培养器材来进行。

在上述生物反应器中添加5mL含有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)(富士胶片和光纯药株式会社，034-24024)的培养基，添加单细胞化的hiPSC，在37℃、5体积％二氧化碳和20体积％氧的条件下，80rpm进行搅拌培养。

第2天以后进行培养基更换。培养基更换如下进行：将各实施例记载的量的培养基上清抽出，200G离心分离5min，将上清除去后，添加等量新培养基，使沉淀悬浮后，添加至生物反应器。

此外，下述各实施例中，如下进行对培养的干细胞中细胞团块数和长径的测定、细胞数和存活率的测定、细胞的未分化维持率以及向胚体内胚层细胞的分化率的测定。

(1)细胞团块数和长径的测定

取500μL含有细胞团块的培养基上清加入24孔板。对细胞团块进行振荡使其分散后，用BZ－X荧光显微镜(株式会社基恩士(Keyence))对全部孔进行拍照。通过对拍摄的图像进行宏细胞计数，求出细胞团块的个数和长径的平均值。

(2)细胞数和存活率的测定

回收全部量的含有细胞团块的培养基上清，500G离心分离5min。将上清除去后，进行10次轻敲，添加1mL细胞分离/分散溶液(Accumax(密理博(Millipore)公司，SCR006)，使细胞团块沉淀悬浮。室温温育5min后，通过吹吸使细胞团块再次悬浮。再次室温温育5min后，通过吹吸使细胞团块单细胞化。添加4mL培养基，500G离心分离5min。将上清除去后，进行10次轻敲从而使沉淀破碎，添加1mL含有Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的培养基，通过吹吸使细胞再次悬浮。使悬浮液通过40μm的细胞过滤器(BD Falcon(康宁公司)，2-1919-02)，进一步用1mL含有Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的培养基对细胞过滤器进行共洗。用生死细胞自动分析仪Vi－CELL XR(贝克曼库尔特株式会社)对回收的细胞悬浮液进行分析，从而进行细胞数和存活率的测定。

用回收的细胞中的活细胞数除以回收的总细胞数，求出细胞的存活率，用活细胞数除以接种的细胞数，求出细胞的增殖率(倍)。

(3)细胞的未分化维持率的测定

将培养后单细胞化的细胞用细胞固定/细胞通透溶液(BD Cytofix/Cytoperm(商标)Kit(BD生物科学(BD Biosciences)公司，554714))固定。具体地，添加200μL Cytofix/Cytoperm，冰上静置20分钟，从而进行hiPSC的固定。

接下来，添加1mL BD Perm/Wash buffer(商标)(BD生物科学(BD Biosciences)公司，554723)，5,000rpm进行2min离心分离，将上清除去。接下来，悬浮在适量BD Perm/Washbuffer(商标)中，分成双重染色用样品、单染色用样品、同型对照用样品、非染色用样品，分别注入离心管，5,000rpm进行2min离心分离，将上清除去。

双重染色和单染色通过下述方法进行：添加100μL将1:5(5倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)488mouse anti－oct3/4(贝克顿-迪金森(Becton Dickinson)公司，560253)和1:10(10倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)647mouse anti―SSEA－4(贝克顿-迪金森(Becton Dickinson)公司，560796)中的两方或一方添加在BD Perm/Wash buffer(商标)中而得的溶液，室温、避光下温育20min。

在同型对照用样品中加入100μL添加有1:20(20倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)488Mouse IgG1κIsotype Control(贝克顿-迪金森(Becton Dickinson)公司，557721)或1:20(20倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)647Mouse IgG3、κIsotype Control(贝克顿-迪金森(Becton Dickinson)公司，560803)的BD Perm/Wash buffer(商标)，同样地在室温、避光下温育20min。

上述各反应后，添加500μL BD Perm/Wash buffer(商标)，5,000rpm离心分离2min，将上清除去。在各样品中添加1mL Focusing fluid(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司，4488621)，再次5,000rpm进行2min离心分离后悬浮在200μL Focusingfluid(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司，4488621)中。调制的样品用Attune NxT Flow Cytometer(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司)实施分析。Alexa Fluor(注册商标)488用BL1进行检测，Alexa Fluor(注册商标)647用RL1进行检测。

细胞的未分化维持率可以用培养的细胞中的Oct3/4/SSEA4阳性率来表示。

(4)hiPSC向胚体内胚层细胞的分化率的测定

将培养后单细胞化的细胞5,000rpm离心分离2min。将细胞沉淀悬浮在100μL BDPerm/Wash buffer(商标)(BD生物科学(BD Biosciences)公司，554723)中，添加1μL BDPharmingen(商标)APC Mouse Anti－Human CD184(BD生物科学(BD Biosciences)公司，560936)或1μL BD Pharmingen(商标)APC Mouse IgG2a,κIsotype Control(BD生物科学(BD Biosciences)公司，555576)，室温、避光下温育20min，从而进行染色。染色的细胞用1000μL FACS buffer洗涤一次后，再次离心分离形成沉淀，用细胞固定/细胞通透溶液(BDCytofix/Cytoperm(商标)Kit(BD生物科学(BD Biosciences)公司，554714))固定。具体地，添加200μL Cytofix/Cytoperm，冰上静置20分钟，从而进行细胞的固定。

接下来，添加1mL BD Perm/Wash buffer，5,000rpm进行2min离心分离，将上清除去，悬浮在200μL BD Perm/Wash buffer(商标)中。添加1μL BD Pharmingen(商标)PEMouse anti－Human Sox17(BD生物科学(BD Biosciences)公司，561591)或BD Pharmingen(商标)PE Mouse IgG1，κIsotype Control(BD生物科学(BD Biosciences)公司，400139)，室温、避光下温育20min进行反应。

上述反应后，添加500μL BD Perm/Wash buffer(商标)，5,000rpm离心分离2min，将上清除去。在各样品中添加1mL Focusing fluid(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司，4488621)，再次5,000rpm进行2min离心分离后悬浮在200μL Focusingfluid(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司，4488621)中。调制的样品用Attune NxT Flow Cytometer(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司)实施分析。PE用BL1进行检测，APC用RL1进行检测。

细胞的分化率可以用培养的细胞中的CXCR4或SOX17阳性率来表示。

[实施例1]各种水溶性聚合物对胰岛素析出的效果的研究

在含有胰岛素的Essential 8培养基中添加上述水溶性聚合物各1mg/mL，如上所述，在搅拌培养器材中，120rpm进行24小时搅拌。然后，用倒置显微镜对培养基的状态进行观察，根据培养基中胰岛素的析出程度，按照下述评价基准评价水溶性聚合物的胰岛素析出抑制效果。

需说明的是，为了进行比较，不添加水溶性聚合物，同样地进行处理，对培养基中胰岛素的析出程度进行评价。

将结果示于表1。

＜评价基准＞

非常好(胰岛素的析出完全被抑制)：++

良好(胰岛素的析出基本被抑制)：+

没有抑制效果(确认到胰岛素的析出)：－

[表1]

如表1所示，添加了聚乙烯醇、各种泊洛沙姆和各种聚氧乙烯山梨聚糖单脂肪酸酯的情况下，确认到搅拌导致的胰岛素析出被很好地抑制。

由实施例1的上述结果可见，通过将聚乙烯醇等水溶性聚合物添加在含有胰岛素的培养基中，能够抑制对培养基进行搅拌时产生的胰岛素析出。

[实施例2]聚乙烯醇和泊洛沙姆的各添加浓度对胰岛素析出抑制效果的影响的研究

在含有胰岛素的Essential 8培养基中添加500ng/mL～10mg/mL聚乙烯醇(PVA)或100ng/mL～1mg/mL泊洛沙姆(Kolliphor P188BIO)，如上所述，在5mL生物反应器中120rpm进行24小时搅拌。搅拌24小时后，用倒置显微镜对培养基进行观察。

需说明的是，为了进行比较，不添加聚乙烯醇和泊洛沙姆，同样地进行处理，在倒置显微镜下进行照片拍摄。

将显微镜下拍摄的照片示于图1。

如图1所示，在生物反应器中对含有胰岛素的Essential 8培养基进行搅拌时，确认到胰岛素的析出。而分别添加了各浓度的聚乙烯醇(PVA)和泊洛沙姆(Kolliphor P188BIO)的情况下，确认到任一浓度下胰岛素的析出均受到抑制。

根据实施例2的上述结果，可见通过在含有胰岛素的培养基中添加500ng/mL以上的聚乙烯醇、以及添加100ng/mL以上的泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)，能够抑制由于对培养基进行搅拌而产生的胰岛素析出。

[实施例3]泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)对hiPSC的增殖的效果的研究

在含有胰岛素的Essential 8培养基中添加0.1μg/mL～1mg/mL泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)，对hiPSC进行4天搅拌悬浮培养，对各浓度的泊洛沙姆的效果进行评价。

在5mL生物反应器中接种1×10

如图2所示，用添加有各浓度的泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)的培养基进行hiPSC的搅拌悬浮培养时，细胞的增殖率、存活率和未分化维持率提高。

根据实施例3的上述结果，可见通过以0.1μg/mL～1mg/mL的浓度在培养基中添加泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)(Kolliphor P188 BIO)并进行hiPSC的搅拌悬浮培养，培养基中胰岛素的析出受到抑制，并且，促进了细胞团块的生长，能够使状态好的hiPSC高效增殖。

[实施例4]泊洛沙姆(Kolliphor P407)对hiPSC的增殖的效果的研究

在含有胰岛素的Essential 8培养基中添加1μg/mL～1mg/mL泊洛沙姆(KolliphorP407)，对hiPSC进行5天搅拌悬浮培养，对各浓度的泊洛沙姆的效果进行评价。

在5mL生物反应器中接种1×10

如图3所示，如果用添加有1μg/mL～1mg/mL泊洛沙姆(Kolliphor P407)的培养基进行培养，则细胞的增殖率提高。

根据实施例4的上述结果，可见通过以1μg/mL～1mg/mL的浓度在培养基中添加泊洛沙姆(聚氧乙烯(202)聚氧丙烯(56)嵌段共聚物)(Kolliphor P407)并进行hiPSC的搅拌悬浮培养，培养基中胰岛素的析出受到抑制，并且，促进了细胞团块的生长，能够使状态好的hiPSC高效增殖。

[实施例5]聚乙烯醇(PVA)对hiPSC的增殖的效果的研究

在含有胰岛素的Essential 8培养基中添加50μg/mL～5mg/mL聚乙烯醇(PVA)，对hiPSC进行4天搅拌培养，对各浓度的聚乙烯醇的效果进行评价。

在5mL生物反应器中接种1×10

如图4所示，用添加有50μg/mL～5mg/mL聚乙烯醇(PVA)的培养基进行培养时，细胞的增殖率提高。

根据实施例5的上述结果，可见通过以50μg/mL～5mg/mL的浓度在培养基中添加聚乙烯醇(PVA)并进行hiPSC的搅拌悬浮培养，培养基中胰岛素的析出受到抑制，并且，促进了细胞团块的生长，能够使状态好的hiPSC高效增殖。

[实施例6]聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Kolliphor PS 20)对hiPSC的增殖的效果的研究

在含有胰岛素的Essential 8培养基中添加100ng/mL～10μg/mL聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Kolliphor PS 20)，对hiPSC进行4天搅拌培养，对各浓度的聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯的效果进行评价。

在5mL生物反应器中接种1×10

如图5所示，用添加有100ng/mL～10μg/mL聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Kolliphor PS 20)的培养基进行培养时，细胞的增殖率提高。

根据实施例6的上述结果，可见通过以100ng/mL～10μg/mL的浓度在培养基中添加聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Kolliphor PS20)并进行hiPSC的搅拌培养，培养基中胰岛素的析出受到抑制，并且，促进了细胞团块的生长，能够使状态好的hiPSC高效增殖。

[实施例7]泊洛沙姆对使用搅拌叶片的搅拌导致的胰岛素析出的效果的研究

作为搅拌培养器材，使用液量2L的动物细胞培养槽(下部磁力搅拌型)(ABLE株式会社(ABLE Corporation))和不锈钢(SUS316L)制搅拌叶片，对于泊洛沙姆对搅拌导致的胰岛素析出的效果进行评价。

在上述动物细胞培养槽中添加500mL含有胰岛素的Essential 8培养基和1mg/mL泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)，37℃下以150rpm进行8小时搅拌。然后，将培养基移至6孔细胞培养板，用倒置显微镜(“CKX53”，奥林巴斯株式会社(Olympus Corporation))进行观察(倍率＝100倍)，进行照片拍摄。

需说明的是，为了进行比较，不添加泊洛沙姆，同样地进行处理，在倒置显微镜下进行照片拍摄。

将显微镜下拍摄的照片示于图6。

如图6所示，虽然确认到培养基搅拌导致的胰岛素析出，但由于泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)的添加，胰岛素的析出受到了抑制。

根据实施例7的上述结果，可见通过以1mg/mL的浓度在含有胰岛素的培养基中添加泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)，即使在使用搅拌叶片对培养基进行搅拌的情况下也能够抑制由此产生的胰岛素析出。

[实施例8]水溶性聚合物对回流导致的胰岛素析出的效果的研究

作为培养基回流用器材，使用蠕动泵(“Perista BioMini Pump AC－2120”(ATTO株式会社(ATTO Corporation))，对于水溶性聚合物对回流导致的胰岛素析出的影响进行评价。作为回流用管，使用内径＝3mm、外径＝5mm的有机硅管。

在50mL容量的塑料管中分别添加45mL含有胰岛素的Essential8培养基、以及泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)和聚乙烯醇(PVA)各1mg/mL，利用上述蠕动泵，室温下以5mL/分钟的流速进行24小时回流。然后，将培养基移至6孔细胞培养板，用倒置显微镜(“CKX41”，奥林巴斯株式会社(Olympus Corporation))进行观察(倍率＝40倍和100倍)，进行照片拍摄。

需说明的是，为了进行比较，不添加泊洛沙姆和聚乙烯醇，同样地进行处理，在倒置显微镜下进行照片拍摄。

将显微镜下拍摄的照片示于图7。

如图7所示，虽然由于对培养基进行回流而产生了胰岛素的析出，但通过在培养基中添加泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)或聚乙烯醇(PVA)，胰岛素的析出受到了抑制。

根据实施例8的上述结果，可见通过分别以1mg/mL的浓度在含有胰岛素的培养基中添加泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)和聚乙烯醇，能够抑制对培养基进行回流时产生的胰岛素析出。

[实施例9]水溶性聚合物对干细胞的分化诱导培养基中的胰岛素析出的效果的研究

在含有胰岛素的分化诱导培养基(添加有4(w/v)％的TeSR－E6培养基中的添加物(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)的RPMI1640培养基)中添加1mg/mL聚乙烯醇(PVA)、1mg/mL泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)，如上所述，在5mL生物反应器中80rpm进行48小时搅拌。然后，用倒置显微镜CKX41对培养基进行观察。

需说明的是，为了进行比较，不添加聚乙烯醇和泊洛沙姆，同样地进行处理，在倒置显微镜下进行观察。

将上述在显微镜下拍摄的照片示于图8。

如图8所示，在生物反应器中对含有胰岛素的分化诱导培养基进行搅拌时，确认到胰岛素的析出。而在添加有聚乙烯醇(PVA)和泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)各1mg/mL的情况下，胰岛素的析出均受到抑制。

根据实施例9的上述结果，确认到通过分别以1mg/mL的浓度在含有胰岛素的分化诱导培养基中添加泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)和聚乙烯醇，能够抑制由于对培养基进行搅拌而产生的胰岛素析出。

[实施例10]泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)对hiPSC向胚体内胚层细胞的分化诱导的效果的研究

在30mL容量的生物反应器中添加30mL StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)，接种6×10

需说明的是，为了进行比较，不添加泊洛沙姆，同样地进行搅拌悬浮培养，诱导向胚体内胚层细胞的分化。

分化诱导后，将细胞团块破碎，如上所述测定活细胞数和细胞存活率。此外，通过上述流式细胞仪分析，针对作为胚体内胚层细胞的标记的CXCR4和SOX17，分别对阳性细胞的比例进行定量。

将结果示于图9。

如图9所示，用添加有泊洛沙姆(Kolliphor P188 BIO)的分化诱导培养基对hiPSC进行搅拌悬浮培养、进行分化诱导时，可确认到活细胞数和细胞存活率的提高。

此外，针对作为胚体内胚层细胞标记的CXCR4和SOX17，阳性细胞的比例各有增加。

根据实施例10的上述结果，确认到通过用含有泊洛沙姆(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(27)嵌段共聚物)的分化诱导培养基对hiPSC进行搅拌悬浮培养，细胞的增殖率和存活率提高，向胚体内胚层细胞的分化也被促进。

产业可利用性

如以上详细描述的那样，根据本发明，能够提供一种添加物，其可以通过添加在含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基中，良好地抑制因搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激导致的胰岛素等培养基成分的析出。

此外，根据本发明，能够提供一种含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基，即使施加搅拌、振荡、回流、气体通风等物理刺激，胰岛素等培养基成分的析出也会被很好地抑制，能够使用含有胰岛素等的动物细胞的悬浮培养用培养基，一边进行搅拌、振荡、回流、气体通风等一边进行动物细胞的悬浮培养。

结果，根据本发明，能够形成大小受到控制的细胞团块而进行动物细胞的悬浮培养，能够提高动物细胞的培养效率和培养细胞的品质。

特别是对于干细胞等未分化细胞，能够在用维持培养基进行维持培养时和用分化诱导培养基进行分化诱导时均抑制培养基成分的析出，提高维持培养时的未分化维持率、分化诱导时的分化率这两者。

本申请以在日本提出的特愿2018－141909为基础，其内容全部包括在本说明书中。