抑制具万古霉素抗药性肠球菌的益生菌及其组合与其用途

摘要

一种抑制具万古霉素抗药性肠球菌的益生菌组合，系由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)所组成，且此益生菌组合用于制备抑制具万古霉素抗药性肠球菌生长、贴附宿主细胞或毒力的医药保健品，且可用于抑制具万古霉素抗药性肠球菌的毒力基因的表现。

说明书

技术领域

本公开系关于一种益生菌组合，尤指一种抑制具万古霉素抗药性肠球菌的益生菌组合。

背景技术

肠球菌(enterococci)是人类肠道内常驻的一种肠内菌，现在已成为全球最主要的伺机性感染病原菌之一，当病人的免疫状况低下，例如严重的潜在性疾病、白血球数目低下、尿道或血管导管置放、住院日数过长时，就可能造成泌尿道感染、心肌炎、脑膜炎、或败血症，造成医疗上连后线抗生素都无法有效治疗的严重问题。在全世界各地的肠球菌临床分离株发现对于万古霉素有抗药性的肠球菌(vancomycin-resistant enterococci，简称VRE)的比例在欧洲为4.0％，在加拿大为6.0％，在亚洲为11.9％，在南美洲为12.9％，在美国甚至高达35.5％，且各地加护病房病人对于VRE的带原率近年来不断攀升已达4.4-12.3％不等。中国台湾在1996年发现第一株VRE，而在2013年的中国台湾伺机感染监测系统的年度报告中，从加护病房病人的肠球菌分离株中已高达28.7％对万古霉素具有抗药性，且在台大医院加护病房住院高达每1000人日的住院当中就有21.9人新得到VRE的发生率，可见VRE已经成为全球人类健康和医疗上极重大的威胁。

近年来有少数利用益生菌将人类肠道中VRE的定植(colonization)去除的研究，但是所用的益生菌株不尽相同，是否有效尚未有定论。例如鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，简称LGG)在两个临床试验中看到了定植在人类肠道VRE的下降(Manley et al.(2007)Med J Aust 186:454-457；Szachta et al.(2011)J ClinGastroenterol 45:872-877)，但是在另一个小型试验中却没有看出有效的去除效应(Doron et al.(2015)Antimicrob Agents Chemother.59(8):4593-9)。此外，另一株鼠李糖乳杆菌Lcr35(Lactobacillus rhamnosus Lcr35)在成人的小型试验中也没看到具体效果(Vidal et al.(2010)J Clin Microbiol 48:2595-2598)。另外两个研究显示出多重组合的益生菌株对VRE在人类定植肠道没有预防效果，甚至有将抗生素传播给肠内菌的疑虑(de Regt et al.(2010)Antimicrob Agents Chemother 54:2801-2805；Topcuoglu etal.(2015)J Matern Fetal Neonatal Med 28:1491-1494)。

由于这些少数的临床研究所使用的菌株、剂量、时间、研究方法不一，所以目前仍亟需找到能有效抑制或去除VRE定植效果的益生菌组合。

发明内容

本公开的目的在于提供一种益生菌组合，其可抑制具万古霉素抗药性肠球菌的生长、贴附宿主细胞或毒力，进而减少具万古霉素抗药性肠球菌对人体的危害。

为达上述目的，本公开提供一种抑制具万古霉素抗药性肠球菌的益生菌组合，该益生菌组合系由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillusrhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)所组成。

为达上述目的，本公开更提供一种益生菌组合的用途，其系用于制备抑制具万古霉素抗药性肠球菌生长、贴附宿主细胞或毒力的医药保健品，其中该益生菌组合系由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)所组成。

为达上述目的，本公开更提供一种益生菌组合的用途，其系用于抑制具万古霉素抗药性肠球菌的毒力基因的表现，且该毒力基因包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm的至少其中之一，其中该益生菌组合系由凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)所组成。

为达上述目的，本公开更提供一种抑制具万古霉素抗药性肠球菌的益生菌，该益生菌包含凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillusrhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的至少其中之一。

为达上述目的，本公开更提供一种益生菌的用途，其系用于制备抑制具万古霉素抗药性肠球菌生长、贴附宿主细胞或毒力的医药保健品，其中该益生菌包含凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的至少其中之一。

为达上述目的，本公开更提供一种益生菌的用途，其系用于抑制具万古霉素抗药性肠球菌的毒力基因的表现，且该毒力基因包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm的至少其中之一，其中该益生菌包含凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的至少其中之一。

在一实施例中，益生菌或益生菌组合系抑制具万古霉素抗药性肠球菌贴附于宿主的肠道上皮细胞。

在一实施例中，具万古霉素抗药性肠球菌包含屎肠球菌(Enterococcus faecium)及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

在一实施例中，医药保健品为一胶囊，且胶囊包含一赋形剂。

在一实施例中，赋形剂为玉米淀粉。

附图说明

图1显示本公开挑选益生菌组合的方法流程图。

图2显示VRE与10种益生菌共同培养的结果。

图3显示VRE与10种益生菌共培养时的微生物相对表现量。

图4显示所预测的微生物交互作用关系图。

图5显示含有Lactobacillus acidophilus或Lactobacillus plantarum在益生菌组合中与VRE共同培养的结果。

图6显示VRE与不同菌株来源的益生菌组合的共同培养结果。

图7至图11显示VRE分别与四种益生菌组合及个别单一菌种的共同培养结果。

图12至图15显示VRE与四种益生菌于不同组合比例下的共同培养结果。

图16显示第一来源的益生菌组合对屎肠球菌的acm基因表现的影响。

图17显示第一来源的益生菌组合对粪肠球菌的asa1基因表现的影响。

图18显示第二来源的益生菌组合对屎肠球菌的acm基因及粪肠球菌的asa1基因表现的影响。

图19即显示以竞争分析法比较不同比例的益生菌组合对屎肠球菌贴附于上皮细胞的影响。

图20显示以竞争分析法比较不同的益生菌对屎肠球菌贴附于上皮细胞的影响。

图21显示以取代分析法比较不同的益生菌对屎肠球菌贴附于上皮细胞的影响。

图22至图30显示第二来源的益生菌组合对屎肠球菌各毒力基因在宿主细胞存在环境下的影响。

其中，附图标记说明如下：

S1：步骤1

S2：步骤2

S3：步骤3

S4：步骤4

S5：步骤5

具体实施方式

体现本公开特征与优点的一些实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本公开能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本公开的范围，且其中的说明及图式在本质上为说明之用，而非用以限制本公开。

本公开乃利用有方向性的微生物交互作用网路结合生物实验挑选出能有效抑制具万古霉素抗药性肠球菌(vancomycin-resistant enterococci，简称VRE)生长、贴附宿主细胞或毒力(virulence)，及抑制其毒力基因(virulence gene)表现的益生菌组合。此益生菌组合系由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillusrhamnosus GG，简称LGG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)所组成，可以有效地在体外实验中明显抑制VRE生长，同时明显抑制VRE毒力基因的表现，以及减少VRE贴附于人类肠道上皮细胞株。本公开提供的益生菌组合将有助于在临床上治疗的应用，以及将VRE从宿主肠道中去定植(decolonization)，进而减少VRE对人体的危害。

以下实施例将进一步说明本公开挑选益生菌组合的方法及相关实验验证。图1显示本公开挑选益生菌组合的方法流程图。如图1所示，本公开挑选益生菌组合的方法包含挑选菌种(步骤S1)、共同培养(步骤S2)、微生物体分析(步骤S3)、选出益生菌组合(步骤S4)、以及实验验证(步骤S5)等步骤，分别说明如下。

首先说明，本公开用以进行测试的具万古霉素抗药性肠球菌(VRE)是由台北医学大学附设医院感染管制室所取得，且经纸锭扩散法(disc diffusion assay)确认对于万古霉素(vancomycin)的抗药性，并以PCR确认vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG等抗药基因是否存在。其中，VRE包含至少两种菌种，分别为屎肠球菌(Enterococcus faecium)及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

在步骤S1中，为达到微生物种类的多样性，本公开从目前中国台湾卫生福利部食品药物管理署公告列举的可供食用的益生菌种中，利用分类，并考虑菌种的可得性以及共同培养的可行性，在当中不同属各挑两种，初步筛选出表1所列10种益生菌。

表1

接着在步骤S2中，将初步筛选出的10种益生菌以震荡方式培养，各取1×10

随后选取共同培养过程三天中的11个时间点(作两重复)的菌液，抽取细菌genomic DNA，并利用次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)技术鉴别并定量所有细菌的16s rDNA。

接着在步骤S3中，利用微生物体分析(microbiome analysis pipeline,MAP)技术，使用分析软体QIIME(Caporaso et al.(2010)Nat Methods.7(5):335-336)进一步得到各个培养时间点的各菌种族群的相对丰富度分析结果。图3显示VRE与10种益生菌共培养时的微生物相对表现量，可观察各时间点当下各种细菌物种于整体的相对比例。其中，Enterococcus_s代表VRE，Lactobacillus_s代表植物乳杆菌(L.plantarum)或嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，Lactobacillus_rhamnosus代表LGG。另外，原本实验中有加入唾液链球菌(Sporolactobacillus inulinus)，但次世代定序(NGS)分析时没有能被QIIME分类到，故图3中没有这只菌。

在得到各个培养时间点的各菌株族群的相对丰富度分析结果后，利用以规则为基础的微生物网路演算法(rule-based microbial network algorithm,RMN)(Tsai et al.,(2015)BMC Syst Biol 9:54)把任意三个微生物的相对表现量做数值分析，可得到微生物间的合作关系和竞争关系，进而产生微生物交互作用网路。图4显示所预测的微生物交互作用关系图，其中实心箭头为抑制效果，空心箭头为协助效果。本公开利用以规则为基础的微生物网路演算法(RMN)推论出VRE与益生菌的合作关系和竞争关系，也推论出益生菌间的合作关系和竞争关系，接着去除与VRE有合作关系的益生菌，以及去除益生菌间为竞争关系的益生菌，最后选择出如图4所示的具抑制VRE效果的益生菌组合(步骤S4)，包含凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，简称LGG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及Lactobacillus_s。

接着在步骤S5中，透过体外(in vitro)实验来验证找到的益生菌组合抑制VRE的效果。

首先，由于Lactobacillus_s包含植物乳杆菌(L.plantarum)及嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，为了确认L.plantarum以及L.acidophilus何者较为有效，本公开比较L.plantarum(ATCC14917菌株)搭配B.coagulans(ATCC7050菌株)、LGG(Hansen菌株)、L.reuteri(BioGaia菌株)，与L.acidophilus(Infloran菌株)搭配B.coagulans(ATCC7050菌株)、LGG(Hansen菌株)、L.reuteri(BioGaia菌株)这两种不同的组合(四种菌皆以等比例组合)，在共培养过程中对VRE生长抑制的效果。同样在共同培养过程中，以VRE显色培养基(CHROM VRE agar)定量VRE数量。图5显示含有L.acidophilus或L.plantarum在益生菌组合中与VRE共同培养的结果。由图5结果可知，L.acidophilus搭配B.coagulans、LGG、L.reuteri的组合相较于L.plantarum搭配B.coagulans、LGG及L.reuteri的组合而言，具有较佳的VRE生长抑制效果，同时也证明以规则为基础的微生物网路演算法(RMN)所推断出的益生菌组合确实可成功抑制VRE的生长。

由于L.acidophilus比L.plantarum具有较佳的VRE生长抑制效果，因此本公开便选择B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus这四种益生菌作为本公开的益生菌组合。

为了使用此四种益生菌于临床试验及未来可能的产品开发，本公开另外采购不同来源的菌株，包含B.coagulans的BC1031菌株、LGG的DSMZ32250菌株、L.reuteri的BR101菌株，及L.acidophilus的LA1063菌株进行实验，并与原先的四株食用菌株进行16s rDNA序列比较。根据序列比对结果显示，B.coagulans的ATCC7050菌株与BC1031菌株的16s rDNA在V3-V4区域具有99％的序列相似度，LGG的Hansen菌株与DSMZ32250菌株的16s rDNA在V3-V4区域具有100％的序列相似度，L.reuteri的BioGaia菌株与BR101菌株的16s rDNA在V3-V4区域具有100％的序列相似度，L.acidophilus的Infloran菌株与LA1063菌株的16s rDNA在V3-V4区域具有100％的序列相似度。换言之，不同来源的菌株其16s rDNA具有几乎相同的V3-V4区域序列，故可预测不同来源的菌株也应具有相当的抑制效果。

图6显示VRE与不同菌株来源的益生菌组合的共同培养结果，其中四种菌皆以等比例组合。根据图6结果可知，由不同来源的菌株组成的B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus等四种益生菌的组合具有相当的抑制效果，也证明了此一益生菌组合的效果确实并非只限于特定来源的菌株。

另外将四种益生菌的等比例组合与个别单一菌种在等菌量(4×10

为了找出四种益生菌的较佳组合比例，以进一步应用于临床人体试验，本公开将四种菌以不同比例组合，并进行共同培养的实验，以比较不同组合比例的VRE抑制效果。由于预测的微生物交互作用关系图(如图4所示)显示L.reuteri为最主要抑制VRE的菌种，故调整后的比例皆以L.reuteri为主要菌种，其他三种菌为次要。图12至图15显示VRE与四种益生菌于不同组合比例下的共同培养结果。在一些实施例中，B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus四种益生菌以四种组合比例进行实验，分别为1:1:1:1(亦即四种菌的含量分别为25％、25％、25％及25％)、1.2:0.5:1.8:0.5(亦即四种菌的含量分别为30％、12.5％、45％及12.5％)、0.5:0.5:1.8:1.2(亦即四种菌的含量分别为12.5％、12.5％、45％及30％)、以及0.5:1.2:1.8:0.5(亦即四种菌的含量分别为12.5％、30％、45％及12.5％)。换言之，B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus等四种菌的含量分别为12.5～30％、12.5～30％、25～45％及12.5～30％。

如图12及图13所示，由B.coagulans_ATCC7050、LGG_Hansen、L.reuteri_BioGaia及L.acidophilus_Infloran所组成的益生菌组合(以第一来源表示)，其在1:1:1:1、1.2:0.5:1.8:0.5、0.5:0.5:1.8:1.2、或0.5:1.2:1.8:0.5的组合比例下，抑制VRE生长的效果皆相近。又如图14及图15所示，由另一来源的B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063所组成的益生菌组合(以第二来源表示)，其在1:1:1:1或0.5:1.2:1.8:0.5的组合比例下，抑制VRE生长的效果相当，0.5:0.5:1.8:1.2组合比例的抑制效果则略逊一筹，而1.2:0.5:1.8:0.5组合比例的抑制效果也在第41小时的时间点略逊于等比例组合。

根据上述实验结果可知，B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus等四种菌分别以12.5～30％、12.5～30％、25～45％及12.5～30％的含量所组成的益生菌组合，对于VRE的生长有明显的抑制效果，其中大致上以等比例的组合具有较佳的VRE生长抑制效果。由于前述组合比例对于VRE的生长皆有明显的抑制效果，并未因组合比例不同而显著影响此益生菌组合限制VRE生长的效果，故可合理推论不论等比例或不等比例的组合皆能有效限制VRE的生长，而上述实施例所采用的组合比例仅用以示范可能实施的范围，并非用以限制本公开，故同样四种菌的其他组合比例亦当不脱离本公开的保护范围。

另一方面，本公开也进一步分析由B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus所组成的益生菌组合，在共培养过程中对于VRE的宿主内黏附及存活相关的毒力基因acm和asa1的表现影响，其中，acm基因主要与屎肠球菌(E.faecium)的黏附和定植有关，而asa1基因主要与粪肠球菌(E.faecalis)的黏附和定植有关。此实验系对于共培养过程中0小时及16小时的样本进行取样，并萃取细菌RNA，进行定量反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)，再计算acm基因或asa1基因于共培养16小时后相对于共培养刚开始时的表现量，以分析VRE与本公开的益生菌组合共培养后，此两个毒力基因的表现量变化。

图16显示第一来源的益生菌组合对屎肠球菌的acm基因表现的影响，图17显示第一来源的益生菌组合对粪肠球菌的asa1基因表现的影响，图18则显示第二来源的益生菌组合对屎肠球菌的acm基因及粪肠球菌的asa1基因表现的影响。由图式结果可知，由B.coagulans_ATCC7050、LGG_Hansen、L.reuteri_BioGaia及L.acidophilus_Infloran所组成的益生菌组合(第一来源)，其在1:1:1:1及0.5:1.2:1.8:0.5的组合比例下，皆能有效抑制acm基因及asa1基因的表现量，且效果相近。另外，由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063所组成的益生菌组合(第二来源)，其在1:1:1:1及0.5:0.5:1.8:1.2的组合比例下，较能显著抑制acm基因的表现，而对asa1基因的表现，则是在1:1:1:1、0.5:1.2:1.8:0.5、及0.5:0.5:1.8:1.2的组合比例下，皆可有效抑制其表现。因此，本公开提供的益生菌组合更可直接有效抑制VRE的毒力基因acm和asa1的表现，而由于acm基因和asa1基因与VRE在宿主肠道中的黏附和定植有关，故抑制acm基因和asa1基因的表现，将有助于将VRE从宿主肠道中去定植，进而减少VRE对人体的危害。

此外，本公开也进一步观察由B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus所组成的益生菌组合与VRE以及人类肠道上皮细胞株的互动，其系以竞争分析法(competitionassay)进行比较，在人类肠道上皮细胞株Caco-2存在的情况下，同时加入益生菌组合与VRE进行共同培养后，再观察益生菌组合减少VRE贴附于Caco-2细胞的效果。在一示范实验中，为了简化实验设计，仅使用临床上对万古霉素抗药性较为严重的屎肠球菌作为VRE代表来进行实验。本公开的益生菌组合系与屎肠球菌以及人类肠道上皮细胞株Caco-2进行共同培养，图19即显示不同比例的益生菌组合对屎肠球菌贴附于上皮细胞的影响。由图式结果可知，由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063所组成的益生菌组合(第二来源)，其在1:1:1:1、1.2:0.5:1.8:0.5、0.5:1.2:1.8:0.5、及0.5:0.5:1.8:1.2的组合比例下，皆能以竞争方式显著减少屎肠球菌贴附于Caco-2细胞的数量。亦即，本公开提供的不同比例的益生菌组合皆可显著减少VRE贴附于人类肠道上皮细胞。

另一方面，本公开亦尝试比较四种菌的组合及单一菌种在减少VRE贴附上皮细胞的效果差异。此一实验可分为前述的竞争分析法(competition assay)及取代分析法(displacement assay)两种不同的分析方法。竞争分析法系将益生菌与VRE同时加入与肠道上皮细胞株共同培养，一段时间后与没有加入任何益生菌的对照组比较VRE贴附的数量是否有减少。取代分析法则系先将VRE与肠道上皮细胞株共同培养一段时间后，再加入益生菌共同培养，最后与没有加入任何益生菌的对照组比较，观察后续加入的益生菌能否减少先加入的VRE贴附于肠道上皮细胞株的效果。在此实验中使用的肠道上皮细胞株为人类肠道上皮细胞株Caco-2，VRE则为屎肠球菌。

图20显示以竞争分析法比较不同的益生菌对屎肠球菌贴附于上皮细胞的影响，图21则显示以取代分析法比较不同的益生菌对屎肠球菌贴附于上皮细胞的影响。由图20结果可知，由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063以等比例所组成的益生菌组合(第二来源)、或是单独的B.coagulans_BC1031、单独的LGG_DSMZ32250、单独的L.reuteri_BR101皆能将屎肠球菌对Caco-2细胞的贴附降至没有加入益生菌对照组的30％至40％，且这几组间没有显著差异，而单独使用L.acidophilus_LA1063的组别则没有明显减少屎肠球菌对Caco-2细胞的贴附。此外，由图21结果可知，四种菌的组合或是单独的B.coagulans_BC1031、单独的LGG_DSMZ32250、单独的L.reuteri_BR101皆能将先行贴附于Caco-2细胞的屎肠球菌数量降至没有加入益生菌的对照组的65％至77％，且这几组间没有显著差异，而单独使用L.acidophilus_LA1063的组别则无法明显减少屎肠球菌的贴附。根据前述实验，除了四种菌的组合可显著减少VRE贴附于宿主细胞之外，单独的B.coagulans、LGG及L.reuteri亦可显著减少VRE贴附于宿主细胞。

为了解本公开益生菌组合影响VRE贴附于宿主细胞的原因，本公开进一步于VRE与人类肠道上皮细胞株Caco-2共同培养后，观察VRE的贴附宿主细胞及生物膜相关的毒力基因的表现量，所分析的毒力基因包含acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm等九个，并观察益生菌组合的加入是否会影响这些VRE毒力基因的表现量。在一示范实验中，本公开的益生菌组合由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063以等比例组合，并与屎肠球菌以及人类肠道上皮细胞株Caco-2进行共同培养2.5小时，之后进行采样并分析各毒力基因的表现量。

图22至图30显示第二来源的益生菌组合对屎肠球菌各毒力基因在宿主细胞存在环境下的影响，主要分析VRE与Caco-2进行共同培养(VRE+Caco-2)后，各毒力基因相对于VRE未与Caco-2接触的对照组(VRE)的表现量，以及当益生菌组合也存在于培养环境中时(VRE+Caco-2+益生菌组合)的表现量。表现量以对照组(VRE)为基准，呈现实验组的相对值，并将数值取Log

因此，本公开提供的益生菌组合确实可明显抑制VRE生长、贴附宿主细胞或毒力，故可进一步开发制备为医药保健品，以有效预防或治疗VRE感染。例如，本公开提供的益生菌组合可进一步制备为益生菌胶囊，包含B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus四种菌，以及赋形剂。在一实施例中，四种菌系以等比例组合，且赋形剂可为玉米淀粉，但不以此为限。在一些其他实施例中，四种菌系分别以12.5～30％、12.5～30％、25～45％及12.5～30％的含量组成，且赋形剂可为玉米淀粉，但不以此为限。而除了在感染VRE后服用益生菌组合来治疗VRE感染外，亦可在病人住院或免疫状况低下时即先服用益生菌组合来预防VRE感染，甚或是日常服用来促进肠道健康。

值得注意的是，本公开最重要精神在于利用有方向性的微生物交互作用网路挑选出能有效抑制VRE生长的益生菌组合，并结合生物实验进一步验证其抑制VRE的功效。而上述实施例所采用的四种菌的组合比例仅用以示范可能实施的范围，并非用以限制本公开，且同样四种菌的其他组合比例亦当不脱离本公开的保护范围。

此外，除了本公开提供的四种菌的益生菌组合可有效抑制VRE生长、贴附宿主细胞、或毒力之外，单独的B.coagulans、LGG、L.reuteri或L.acidophilus也有抑制VRE生长、贴附宿主细胞、或毒力的效果，例如图8至图11可看出单独的LGG、L.reuteri或L.acidophilus抑制VRE生长的效果，又如图20及图21可看出单独的B.coagulans、LGG或L.reuteri抑制VRE贴附宿主细胞的效果。因此，单一菌种抑制VRE的功效亦当涵盖在本公开的保护范围。

综上所述，本公开利用有方向性的微生物交互作用网路结合生物实验挑选出能有效抑制具万古霉素抗药性肠球菌(VRE)生长的益生菌组合，包含凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，简称LGG)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)等四种菌。此益生菌组合可以有效地在体外实验中明显抑制VRE生长，且四种益生菌不限于特定来源的菌株，而四种菌的组合比例亦不受限。此外，此益生菌组合更可减少VRE贴附于人类肠道上皮细胞，且明显抑制VRE毒力基因，包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm等基因的表现。综合以上，本公开提供的益生菌组合可有效抑制VRE生长、贴附宿主细胞或毒力，可望进一步开发制备为医药保健品，将有助于在临床上治疗或预防的应用，以及将VRE从宿主肠道中去定植，降低VRE的毒力，进而减少VRE对人体的危害。

纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本技艺人士任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附申请专利范围所欲保护者。