人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种人sDR5‑Fc重组融合蛋白在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用，其中编码sDR5‑Fc重组融合蛋白的核苷酸序列具有：a)SEQ ID NO：1所示的碱基序列；或b)与SEQ ID NO：1的互补配对序列；或c)与a或b的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a或b的核苷酸序列不同的序列；或sDR5‑Fc重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，且有一个或多个氨基酸被取代，但生物活性不改变的sDR5‑Fc重组融合蛋白；或sDR5‑Fc重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6所示。

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白，特别是涉及一种人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是指肝外科手术过程中阻断肝脏血流供应一段时间后恢复血流供应，肝脏功能障碍和结构损伤不仅没有减轻，反而加重的病理现象。

我国是肝脏疾病的高发国家，在失血性休克、肝脏肿瘤切除及肝脏移植等疾病和手术中，肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)均参与其中。肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia/reperfusion injury，HI/RI)还常引起远端器官损伤，严重的HIRI可能导致病人肝衰竭、全身炎症反应综合征、多器官功能障碍甚至死亡。因此，如何防治HIRI是肝脏外科研究的热点。

肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是肝脏手术后常见的损伤之一，严重影响疾病治疗效果，但其中具体机制尚不明确。在肝脏缺血再灌注损伤中，肝脏缺血、再灌注两个过程是两个独立的过程，肝脏缺血后引起肝脏氧供不足、能量不足，使肝细胞缺乏必须的生存物质，引起细胞内能量代谢不平衡、离子紊乱、细胞器及蛋白质变性等。在肝脏恢复血供后，炎症介质、酸性代谢产物、氧自由基等对肝脏细胞进行二次损伤打击，引起肝脏缺血再灌注损伤。目前研究表明，HIRI可能与细胞器变性、蛋白质变性、炎症因子释放、氧自由基增加、细胞内钙离子超载、细胞凋亡等密切相关。肝脏缺血再灌注损伤不仅是一种涉及肝脏的病理生理过程，也是影响多种组织器官的复杂系统过程。其不仅可导致肝脏功能的可逆或不可逆损害，也会因肝脏功能障碍而引起多器官功能障碍。

目前，针对预防或减轻HIRI的措施主要有缺血预处理、缺血后处理、高压氧预处理等，但没有一种方法是完善的。由此可见，目前治疗药物种类和疗效均有限，因此亟需开发新的治疗药物。

肝移植导致的组织缺血再灌注损伤被认为是器官移植手术过程中重要的危险因子，是导致移植失败的重要原因。由于缺血再灌注损伤在肝组织损伤中的重要性，引起大量相关研究。可惜的是，许多动物实验中被证明能保护肝缺血再灌注损伤的药物和方法，在临床试验过程中都相继失败。寻找更理想的器官保护工具仍然十分必要。

DR5是肿瘤坏死因子受体家族的成员，分布在多种正常组织，包括小肠、心脏、肺、肝脏、骨骼肌和肾脏；活化的外周血淋巴细胞、心脏、脾脏、胰腺、炎症组织、缺血组织和一些肿瘤细胞中表达水平高。DR5与TRAIL相结合后引起一系列信号级联反应，激活Caspase-8，Caspase-8通过非线粒体依赖途径和线粒体依赖途径引发细胞凋亡。

人DR5蛋白由411个氨基酸组成，N端位于胞外，C端位于胞内，只有一次跨膜。属于Ⅰ型跨膜蛋白，其中1～55位氨基酸是信号肽，84～179位氨基酸是含有2个富含半胱氨酸的重复功能区的链状结合区，184～206位氨基酸为跨膜区，胞内区含有死亡结构域。

可溶性DR5(soluble DR5,sDR5)为DR5不含跨膜区域的可溶性形式，因缺乏跨膜区域不能在细胞膜上表达而被分泌至细胞外。sDR5虽然保持与TRAIL配体相结合的活性，但不能向细胞内传导凋亡信号，可阻断TRAIL-DR5介导的细胞凋亡反应。因此，作为与TRAIL亲和力最高的受体，DR5具有可以作为肝脏缺血再灌注损伤治疗靶点的潜力。

sDR5-Fc融合蛋白通过与TRAIL分子结合，中和TRAIL可以阻断内源性TRAIL与DR5的结合，从而起到延迟肝细胞凋亡的作用，延长治疗时间窗。并且sDR5是人体自身蛋白，具有毒性小、无免疫原性的优点，因此sDR5-Fc融合蛋白药物作为一个全新的靶点治疗肝脏缺血再灌注损伤，作用机理明确新颖，作用效果独特，弥补了目前药物的短板，疗效显著，安全性高，极具开发潜力。

本发明涉及一种人可溶性死亡受体5(soluble death receptor 5，简称sDR5-Fc抗体融合蛋白(sDR5-Fc)的药用用途，尤其是人sDR5-Fc抗体融合蛋白作为肝脏缺血再灌注损伤治疗药物的应用。本发明经实验证实，所述的人sDR5-Fc抗体融合蛋白在小鼠、大鼠肝脏缺血再灌注损伤中用药后损伤减弱，改善肝脏病理损伤。本发明作为治疗肝脏缺血再灌注损伤的一种新型候选药物，作用特异且迅速，疗效显著，安全性高，极具开发潜力。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种人sDR5-Fc重组融合蛋白及其编码核苷酸序列的应用，该sDR5-Fc重组融合蛋白生物活性高，稳定性好。

具体技术方案如下：

人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治肝脏缺血再灌注损伤和联合用药的药物中的应用，其中编码sDR5-Fc重组融合蛋白的核苷酸序列具有：a)SEQ ID NO：1所示的碱基序列；或b)与SEQ ID NO：1的互补配对序列；或c)与a或b的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a或b的核苷酸序列不同的序列；

或sDR5-Fc重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或氨基酸序列如SEQID NO：2所示，且有一个或多个氨基酸被取代，但生物活性不改变的sDR5-Fc重组融合蛋白；

或sDR5-Fc重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6所示。

其中遗传密码的简并性：是指编码同一氨基酸的几个三联体遗传密码中一二位碱基大多是相同的只是第三位不同例如ACU,ACC,ACA,ACG都是苏氨酸的密码子，UGU,UGC,UGA,UGG都是缬氨酸的密码子，这样如果密码子第三位碱基出现了点突变并不影响所翻译出的氨基酸种类。

进一步地，联合用药包括甘草酸。

进一步地，编码sDR5-Fc重组融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；所述sDR5-Fc重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

人sDR5-Fc抗体融合蛋白的蛋白序列、序列修饰及相关生物工程产品在制备治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

上述人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用，所述药物的给药途径包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔注射和透皮给药等任何能达到治疗效果的途径，给药剂量取决于疾病的严重程度、患者年龄、体重、给药方式和给药频率。

本发明的另一目的在于提供一种防治肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物。

具体技术方案如下：

一种防治肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物，其活性成分包括有以下至少之一的sDR5-Fc重组融合蛋白，所述sDR5-Fc重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，且有一个或多个氨基酸被取代，但生物活性不改变的sDR5-Fc重组融合蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6所示。

在其中一些实施例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

本发明的有益效果：(1)人sDR5-Fc重组融合蛋白作用机理明确新颖，作用效果独特，疗效显著，安全性高。(2)肝脏缺血再灌注损伤是一个常见的临床问题，它是在包括肝叶切除术和肝移植术在内的外科手术过程中引起肝脏损伤的重要原因，它可导致10％的早期肝脏移植后肝功能衰竭，45％急慢性组织排异现象和器官损伤，极大阻碍了肝脏手术的应用和救治效果。长久以来，肝IR损伤缺乏有效的疗法和用药目标。本发明人sDR5-Fc抗体融合蛋白能阻断胞凋亡的核心信号通路，TRAIL-DR5凋亡信号通路广泛存在于多种因素导致的肝脏缺血再灌注损伤，因此人sDR5-Fc抗体融合蛋白在治疗肝脏缺血再灌注损伤中具有广泛性。同时，人sDR5-Fc抗体融合蛋白来源于人体自身的蛋白，代谢产物为氨基酸，因此安全性较其它治疗药物更优，且能够安全的与其它治疗药物联用，增强疗效，促进康复。因此，人sDR5-Fc抗体融合蛋白在肝脏缺血再灌注损伤领域具有广阔的应用前景。(3)本发明所述sDR5-Fc蛋白具有在多种原因导致的肝脏缺血再灌注中治疗作用，治疗后损伤减轻。

附图说明

图1为sDR5-Fc的基因琼脂糖凝胶电泳图；

图2为DR5-Fc重组融合蛋白(ZJ501-5)Dot Blot检测图；

图3为8％SDS-PAGE非还原电泳图；

图4为ZJ501-5纯化后的SEC-HPLC分析图；

图5为ZJ501-5经还原后的TIC图；

图6为ZJ501-5的数据用Biopharmalynx软件处理后的质谱图；

图7为商品化Trail杀伤活性检测标准曲线；

图8为商品化DR5-Fc融合蛋白生物检测标准曲线；

图9为ZJ501-5生物活性检测标准曲线；

图10为实施例4中人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断TRAIL诱导的肝细胞凋亡结果示意图；其中：A为不同浓度TRAIL诱导HepG2细胞凋亡结果；B为不同浓度人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断TRAIL诱导HepG2细胞凋亡结果；C为TRAIL诱导的凋亡的HepG2细胞形态图；D为人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断TRAIL诱导凋亡的HepG2细胞形态图；

图11为实施例5中人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤血清ALT、AST检测结果图；

图12为实施例5中人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤H-E结果图，其中A：Sham-生理盐水；B：HIRI-生理盐水；C：HIRI-sDR5-Fc(3mg/kg)；D：HIRI-sDR5-Fc(9mg/kg)；E：HIRI-sDR5-Fc(27mg/kg)；Bar：100μm；Bar：100μm；

图13为实施例6中人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗小鼠肝脏缺血再灌注损伤血清ALT、AST检测结果图；

图14为实施例6中人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗小鼠肝脏缺血再灌注损伤H-E结果图，其中A：Sham-生理盐水；B：HIRI-生理盐水；C：HIRI-sDR5-Fc(3mg/kg)；D：HIRI-sDR5-Fc(9mg/kg)；E：HIRI-sDR5-Fc(27mg/kg)；Bar：100μm；

图15为实施例7中人sDR5-Fc抗体融合蛋白联合甘草酸治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤血清ALT、AST检测结果图；

图16为实施例8中人sDR5-Fc抗体融合蛋白联合甘草酸治疗小鼠肝脏缺血再灌注损伤血清ALT、AST检测结果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明所使用的是本公司自己生产的sDR5-Fc蛋白。

实施例1：重组人DR5-Fc表达序列的设计和重组

发明人经过长期的经验积累，构建重组融合蛋白，将人DR5与Fc进行多种方式的融合，质谱分析结果显示目的蛋白大多发生了N端11个氨基酸(ITQQDLAPQQR)的剪切，为了表达出N端较为均一的目的蛋白，最后筛选到融合蛋白常用信号肽基础上去掉中间连接序列和N端18个氨基酸，命名为sDR5-Fc(ZJ501-5)。将质粒进行瞬时转染，表达上清纯化后进行质谱分析和活性分析。

ZJ501-5的DNA序列：

atgggtgtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatgtccagcccctcagagggattgtgtccacctggacaccatatctcagaagacggtagagattgcatctcctgcaaatatggacaggactatagcactcactggaatgacctccttttctgcttgcgctgcaccaggtgtgattcaggtgaagtggagctaagtccctgcaccacgaccagaaacacagtgtgtcagtgcgaagaaggcaccttccgggaagaagattctcctgagatgtgccggaagtgccgcacagggtgtcccagagggatggtcaaggtcggtgattgtacaccctggagtgacatcgaatgtgtccacaaagaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO.1)

ZJ501-5的氨基酸序列：

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO.2)

通过酶切、连接等常规技术手段将sDR5-Fc(ZJ501-5)的基因序列连接到pL101真核表达载体并用Hind3和EcoR1双酶切进行鉴定。琼脂糖凝胶电泳可见1300bp左右目的片段及9kb左右pL101载体片段，载体构建后双酶切验证结果，结果见图1。

实施例2：人sDR5-Fc重组蛋白的表达及理化性质的检测

将sDR5-Fc/pL101质粒用Lipofectamine2000进行瞬时转染CHO.K1细胞，48小时后收集上清进行Dot Blot检测，结果为阳性，见图2。

复苏CHO.K1-S细胞，按5×10

转染前一天，摇瓶计数后调整细胞密度至5-6×10

转染当日CHO.K1-S计数并计算活率，密度应在1.2-1.5×10

轻轻颠倒混匀FreeStyle

将孵育后的混合物加入上述准备好的CHO.K1-S细胞摇瓶中，37℃8％CO2振荡培养箱120rpm培养7天，产物经亲和柱纯化后进行SDS-PAGE、SEC-HPLC和质谱分析。

质谱分析步骤：

1.先将样品置换缓冲液到50mM NH4FA(pH6.6)中，并检测其浓度；

2.各样品用Ides进行酶切；

3.加入DTT还原二硫键；

4.质谱进样分析。

参见SDS-PAGE(图3)、ZJ501-5纯化后的SEC-HPLC(图4)(蛋白纯度达到99.47％)和ZJ501-5经还原后的TIC(图5)以及ZJ501-5的数据用Biopharmalynx软件处理后的质谱(图6)。根据图5和图6，分析N端剪切体比例，参见下表，其中，M(O)代表相应的蛋白N端多出一个甲硫氨酸并被氧化，S-S代表形成二硫键。O代表第一个氨基酸被氧化。且将图5，图6导入数据库后分析得出N端减一个氨基酸和N端减两个氨基酸的结果。

N端剪切体比例如下表

结果显示，ZJ501-5的纯度达到99％，仅有微量的N端剪切一个氨基酸和两个氨基酸的变异体出现，比例为1.11％，其中只有约0.11％左右的N端剪切两个氨基酸变异体存在。

ZJ501-5是在ZJ501-1，ZJ501-2，ZJ501-3，ZJ501-4蛋白的基础上，去除N端不稳定序列，最终获得的N端较为均一的目的蛋白。ZJ501-1，ZJ501-2，ZJ501-3，ZJ501-4，ZJ501-5蛋白的N端剪切体比例见下表。

由上可知，ZJ501-5蛋白药物稳定性最高。

ZJ501-1，ZJ501-2，ZJ501-3，ZJ501-4蛋白的序列如下：

ZJ501-1

MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGPRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEGSSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.3)

ZJ501-2

MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGPRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.4)

ZJ501-3

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.5)

ZJ501-4氨基酸序列(信号肽-目的序列)

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.6)。

实施例3：ZJ501-5的生物活性鉴定

(1)建立商品化Trail杀伤活性检测方法

收集对数生长期的Jurkat细胞，计数后用10％FCS RPMI-1640/DMEM重悬细胞，调整细胞密度8*10

将商品化Trail按终浓度500-1000ng/ml重悬于含放线菌素D(终浓度为0.03ug/ml)的上述完全培养液中，用含放线菌素D的完全培养液2倍比稀释商品化Trail，共15-20个浓度梯度。将稀释后的样品按100ul/孔加入96孔细胞培养板中，并置于培养箱中培养18-22小时。加入新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS显色溶液20ul/孔，培养箱中继续孵育培养3-4小时，用酶标仪检测其A490-A630值。

采用M5分析软件拟合标准曲线：横坐标为样品的浓度，纵坐标为A490-A630，选用4参数方程回归模型，曲线为反“S”形。软件自动计算EC50为8.382ng/ml，EC90为27.65ng/ml。(参见图7)。

(2)建立商品化DR5-Fc融合蛋白生物活性检测方法

收集对数生长期的Jurkat细胞，计数后用10％FCS RPMI-1640/DMEM重悬细胞，调整细胞密度8*10

计算商品化Trail杀伤活性的EC90，在含放线菌素D(终浓度为0.03ug/ml)的上述完全培养液中加入终浓度为EC90的Trail，用上述含放线菌素D及EC90的Trail的完全培养液系列倍比稀释商品化DR5-Fc(R&D systems公司)，10ng/ml 2倍比15个浓度。将稀释后的样品按100ul/孔加入96孔细胞培养板中，并置于培养基中培养18-22小时。

加入新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS显色溶液20ul/孔，培养箱中继续孵育培养3-4小时。用酶标仪检测其A490-A630值。

商品化DR5-Fc融合蛋白(R&D systems公司)生物活性检测结果：采用M5分析软件拟合标准曲线：横坐标为样品的浓度，纵坐标为A490-A630，选用4参数方程回归模型，曲线为正“S”形。进行三次不同实验，比较EC50的变异情况。EC50为71.82ng/ml。参见图8。

(3)ZJ501-5生物活性及相对活性检测方法

方法同(2)，样品为ZJ501-5(SEQ ID NO.2)，参比品为商品化DR5-Fc(R&D systems公司)。实验为两个不同操作者分别进行三次实验，计算每次实验ZJ501-5相对生物活性(％)＝商品化DR5-Fc EC50/样品DR5-Fc EC50*100。比较不同操作者及实验批次间的变异情况。

本发明ZJ501-5生物活性检测及相对活性结果：ZJ501-5EC50平均为20.25ng/ml，商品化DR5-Fc EC50为71.82ng/ml，ZJ501-5相对生物活性为355％,(参见图9)。

实施例4：sDR5-Fc阻断TRAIL诱导的肝细胞凋亡

方法同实施例3的(1)和(2)，靶细胞为HepG2细胞，样品为ZJ501-5(SEQ ID NO.2)，参比品为商品化DR5-Fc(R&D systems公司)。

实验发现(参见图10)，人sDR5-Fc重组融合蛋白能有效阻断TRAIL诱导的肝细胞凋亡，且在HepG2细胞中ZJ501-5的生物活性(EC50＝5.7ng/ml)是R&D公司sDR5-Fc蛋白的生物活性(EC50＝27.6ng/ml)的近5倍。

实施例5：人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤

雄性，体重180g～220g，SPF级Wistar大鼠40只，按照完全随机化原则分为A:假手术组(Sham组)、B:缺血再灌注组(IR组)、C:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)低剂量组、D:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)中剂量组和E:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)高剂量组，共5组，每组8只。将实验动物禁食不禁水12小时，腹腔注射适量10％的水合氯醛0.3mL·kg

实验发现：(参见图11-12)，本发明所述的sDR5-Fc在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中能降低转氨酶ALT,AST的水平，并且H-E染色结果显示，sDR5-Fc组肝脏损伤明显减少。表明sDR5-Fc在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中有治疗效果。

实施例6：人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗小鼠肝脏缺血再灌注损伤

40只，6-8周，18～22g，SPF级C57BL/6雄性小鼠按照完全随机化原则分为5组。A:假手术组(Sham组)、B:缺血再灌注组(IR组)、C:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)低剂量组、D:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)中剂量组和E:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)高剂量组，每组8只。术前禁食12h，自由进水，10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定于恒温加热板。Sham组只开腹暴露肝门，不做其他处理。B、C、D、E组取中线开腹，以无损伤血管夹夹闭通往肝左叶及肝中叶(约占整个肝脏质量70％)的肝蒂，包括门静脉、肝动脉和胆道(此时可见肝左叶及中叶的颜色变暗灰，注意不要影响肝右叶及尾状叶血流)。无菌生理盐水纱布覆盖腹部切口。缺血45min后撤离无损伤血管夹，恢复血流(可见缺血肝叶颜色由暗灰变为暗红)，开始再灌注，逐层关腹。再灌注1小时后，B、C、D、E组分别尾静脉注射生理盐水，sDR5-Fc 3mg/kg，sDR5-Fc9mg/kg，sDR5-Fc 27mg/kg。24h后取颌下静脉血，室温静置1小时，离心提取血清，－80℃冰箱保存待测。取血后处死小鼠，开放胸腔暴露心脏及主动脉弓，向主动脉弓注入生理盐水冲洗全身血液，取肝脏组织固定于4％多聚甲醛中，用于组织学H-E染色检测，其余组织分装后置于EP管－80℃保存待用。

实验发现：(参见图13-14)，本发明所述的sDR5-Fc在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中能降低转氨酶ALT,AST的水平，并且H-E染色结果显示，sDR5-Fc组肝脏损伤明显减少。表明sDR5-Fc在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中有治疗效果。

实施例7：人sDR5-Fc抗体融合蛋白联合甘草酸治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤

雄性，体重180g～220g，SPF级Wistar大鼠40只，按照完全随机化原则分为A:假手术组(Sham组)、B:缺血再灌注组(IR组)、C:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)组、D:甘草酸组和E:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)联合甘草酸组，共5组，每组8只。将实验动物禁食不禁水12小时，腹腔注射适量10％的水合氯醛0.3mL·kg

实验发现：(参见图15)，本发明所述的sDR5-Fc联合甘草酸能降低大鼠肝脏缺血再灌注损伤血清中的转氨酶，肝脏损伤减轻，因此sDR5-Fc联合甘草酸在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中具有治疗作用。

实施例8：人sDR5-Fc抗体融合蛋白联合甘草酸治疗小鼠肝脏缺血再灌注损伤

40只，6-8周，18～22g，SPF级C57BL/6雄性小鼠按照完全随机化原则分A:假手术组(Sham组)、B:缺血再灌注组(IR组)、C:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)组、D:甘草酸组和E:sDR5-Fc(本发明ZJ501-5)联合甘草酸组，共5组，每组8只。术前禁食12h，自由进水，10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定于恒温加热板。Sham组只开腹暴露肝门，不做其他处理。B、C、D、E组取中线开腹，以无损伤血管夹夹闭通往肝左叶及肝中叶(约占整个肝脏质量70％)的肝蒂，包括门静脉、肝动脉和胆道(此时可见肝左叶及中叶的颜色变暗灰，注意不要影响肝右叶及尾状叶血流)。无菌生理盐水纱布覆盖腹部切口。缺血45min后撤离无损伤血管夹，恢复血流(可见缺血肝叶颜色由暗灰变为暗红)，开始再灌注，逐层关腹。再灌注1小时后，B、C、D、E组分别尾静脉注射生理盐水，sDR5-Fc9mg/kg，甘草酸9mg/kg，sDR5-Fc 9mg/kg和甘草酸9mg/kg。24h后取颌下静脉血，室温静置1小时，离心提取血清，－80℃冰箱保存待测。

实验发现：(参见图16)，本发明所述的sDR5-Fc联合甘草酸能降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤血清中的转氨酶，肝脏损伤减轻，因此sDR5-Fc联合甘草酸在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中具有治疗作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市中科艾深医药有限公司

<120> 人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用

<130> CP11901904C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatgtccag cccctcagag ggattgtgtc cacctggaca ccatatctca 120

gaagacggta gagattgcat ctcctgcaaa tatggacagg actatagcac tcactggaat 180

gacctccttt tctgcttgcg ctgcaccagg tgtgattcag gtgaagtgga gctaagtccc 240

tgcaccacga ccagaaacac agtgtgtcag tgcgaagaag gcaccttccg ggaagaagat 300

tctcctgaga tgtgccggaa gtgccgcaca gggtgtccca gagggatggt caaggtcggt 360

gattgtacac cctggagtga catcgaatgt gtccacaaag aagagcccaa atcttgtgac 420

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 480

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 660

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 780

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 840

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1020

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1080

tccctgtctc cgggtaaatg a 1101

<210> 2

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu

20 25 30

Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser

35 40 45

Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe

50 55 60

Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro

65 70 75 80

Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe

85 90 95

Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys

100 105 110

Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile

115 120 125

Glu Cys Val His Lys Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

130 135 140

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

145 150 155 160

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

165 170 175

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

180 185 190

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

195 200 205

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

210 215 220

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

225 230 235 240

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

245 250 255

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

260 265 270

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

275 280 285

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

290 295 300

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

305 310 315 320

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

325 330 335

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

340 345 350

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360 365

<210> 3

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys

1 5 10 15

Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu

35 40 45

Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln

50 55 60

Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu

65 70 75 80

Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser

85 90 95

Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe

100 105 110

Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro

115 120 125

Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe

130 135 140

Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys

145 150 155 160

Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile

165 170 175

Glu Cys Val His Lys Glu Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

180 185 190

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

195 200 205

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

210 215 220

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

225 230 235 240

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

245 250 255

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

260 265 270

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

275 280 285

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

290 295 300

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

305 310 315 320

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

325 330 335

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

355 360 365

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

370 375 380

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

385 390 395 400

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

405 410 415

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425

<210> 4

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys

1 5 10 15

Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu

35 40 45

Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln

50 55 60

Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu

65 70 75 80

Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser

85 90 95

Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe

100 105 110

Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro

115 120 125

Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe

130 135 140

Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys

145 150 155 160

Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile

165 170 175

Glu Cys Val His Lys Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

180 185 190

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

195 200 205

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

210 215 220

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

225 230 235 240

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

245 250 255

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

260 265 270

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

275 280 285

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

290 295 300

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

305 310 315 320

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

325 330 335

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

340 345 350

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

355 360 365

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

370 375 380

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

385 390 395 400

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

405 410

<210> 5

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala

20 25 30

Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu

35 40 45

Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys

50 55 60

Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu

65 70 75 80

Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu

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Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly

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Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr

115 120 125

Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser

130 135 140

Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

145 150 155 160

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

290 295 300

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 6

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg

20 25 30

Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu

35 40 45

Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr

50 55 60

His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys

85 90 95

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100 105 110

Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp

115 120 125

Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Glu Pro Lys

130 135 140

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

145 150 155 160

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

165 170 175

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

180 185 190

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

195 200 205

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

210 215 220

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

225 230 235 240

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

245 250 255

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

260 265 270

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

275 280 285

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

290 295 300

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

305 310 315 320

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

325 330 335

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

340 345 350

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355 360 365

Leu Ser Pro Gly Lys

370