一种同时检测雌二醇和睾酮的速测卡及其制备和使用方法

摘要

本发明公开了一种同时检测雌二醇和睾酮的速测卡及其制备和使用方法。本发明提供了速测卡，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有胶体金标记雌二醇抗体和胶体金标记睾酮抗体的金标垫、含有雌二醇检测线T1、睾酮检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜，和吸水垫，所述雌二醇检测线T1由雌二醇抗原或其溶液形成；所述睾酮检测线T2由睾酮抗原或其溶液形成。本发明提供同时检测雌二醇和睾酮的二合一免疫胶体金速测卡，其可以实现一次检测待测样本是否为雄性或者雌性，为实际检测部门提供了快速、现场和灵敏的检测方法，主要应用于粪便样品的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测雌二醇和睾酮的速测卡及其制备和使用方法。

背景技术

目前常规检测雌二醇和睾酮的方法为液相色谱，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。

以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，而同时检测雌二醇和睾酮的速测卡还未见有公开报道。

发明内容

为了实现同时检测雌二醇和睾酮，本发明提供如下技术方案：

本发明一个目的是提供一种同时检测雌二醇和睾酮的速测卡。

本发明提供的速测卡，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有胶体金标记雌二醇抗体和胶体金标记睾酮抗体的金标垫、含有雌二醇检测线T1、睾酮检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜，和吸水垫，

所述雌二醇检测线T1由雌二醇抗原或其溶液形成；

所述睾酮检测线T2由睾酮抗原或其溶液形成。

上述速测卡中，所述雌二醇抗体为雌二醇单克隆抗体；

或，所述睾酮抗体为睾酮单克隆抗体；

或，所述雌二醇抗原为E2抗原，

或，所述睾酮抗原为T抗原。

上述速测卡中，所述包被有胶体金标记雌二醇抗体和胶体金标记睾酮抗体的金标垫为将胶体金标记雌二醇抗体溶液和胶体金标记睾酮抗体溶液混匀后喷于金标垫上形成；

所述胶体金标记雌二醇抗体溶液和所述胶体金标记睾酮抗体溶液的体积比为1:1；

所述胶体金标记雌二醇抗体溶液的浓度为0.4mg/ml；

所述胶体金标记睾酮抗体溶液的浓度为0.4mg/ml；

或，所述E2抗原溶液的浓度为1.0mg/mL；

或，所述T抗原溶液的浓度为1.0mg/mL；

或，所述质控线C由IgG抗体或IgG抗体溶液形成；

或，所述IgG抗体溶液的浓度具体为1mg/ml。

本发明另一个目的是提供如下方法：

本发明提供了一种制备上述速测卡的方法，包括如下步骤：先制备包被有胶体金标记雌二醇抗体和胶体金标记睾酮抗体的金标垫和制备含有雌二醇检测线T1、睾酮检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜；再将样品垫、所述包被有胶体金标记雌二醇抗体和胶体金标记睾酮抗体的金标垫、所述含有雌二醇检测线T1、睾酮检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到检测雌二醇和睾酮的速测卡；

所述包被有胶体金标记雌二醇抗体和胶体金标记睾酮抗体的金标垫为将浓度为0.4mg/ml胶体金标记雌二醇抗体溶液和浓度为0.4mg/ml胶体金标记睾酮抗体溶液按照体积比为1:1混匀后喷于金标垫上形成；

所述含有雌二醇检测线T1、睾酮检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜为将浓度为1.0mg/mL雌二醇抗原溶液在硝酸纤维素膜上划T1线作为检测线，浓度为1.0mg/mL睾酮抗原溶液在硝酸纤维素膜上划T2线作为检测线，且将浓度为1.0mg/mL的羊抗鼠二抗溶液在所述硝酸纤维素膜上划C线作为质控线得到的。

上述速测卡的在制备检测或辅助检测雌二醇和/或睾酮产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述速测卡的在制备同时检测或辅助同时检测待测样品中是否同时含有雌二醇和/或睾酮产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述产品为试剂盒。

上述应用中，所述待测样品来自鹤。

本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样品中是否含有雌二醇和/或睾酮的方法，包括如下步骤：用上述速测卡检测待测样本；

若所述速测卡出现1条C线与两条T线，则待测样品中不含有或候选不含有雌二醇和睾酮；

若所述速测卡C线显色，且T1线不显色，T2线显色，则待测样品中含有或候选含有雌二醇且不含有睾酮；

若所述速测卡C线显色，且T2线不显色，T1线显色，则待测样品中不含有或候选不含有雌二醇且含有睾酮；

若所述速测卡C线显色，且T2线不显色，T1线不显色，则待测样品中含有或候选含有雌二醇且含有睾酮。

本发明还提供了一种检测或辅助检测待测鹤是雌性还是雄性的方法，包括如下步骤：

1)用有机溶液对待测鹤的粪便进行提取，得到提取液；

2)用上述速测卡检测所述提取液；

若所述速测卡C线显色，且T1线不显色，T2线显色，则待测鹤为或候选为雌性；

若所述速测卡C线显色，且T2线不显色，T1线显色，则待测鹤为或候选为雄性。

上述用有机溶液对待测鹤的粪便进行提取，得到提取液的方法具体如下：

1、取0.4g鹤的粪便于15mL离心管中，加入体积百分含量为80％甲醇水溶液4mL，震荡5分钟；

2、5000rpm离心3分钟；

3、取2mL上清液于5mL离心管中，60℃空气吹干；

4、加0.2mL体积百分含量为10％甲醇水溶液与0.2mL正己烷于离心管中充分震荡溶解；

5、5000rpm离心3分钟；

6、取下层清液100μL作为待测样本提取液进行检测。

本发明制得的新型雌二醇和睾酮二合一速测卡对样本具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于样本的快速检测，较现有的速测卡操作相比，具有以下特有优势：

(1)同一张卡上能同时检测雌二醇和睾酮，而不是两张单种卡的简单物理性胶连，加样仅需1次，而且反应均在同一条件下进行。

(2)样品前处理完全统一，操作简单，100微升样品加样量即可。

(3)检测时间短(5-8min)、结果判定标准统一：完全阴性结果(出现1条C线与两条T线)；阳性(+)：C线显色，T线只要任何一条不显色，则为阳性，两条T线都不显色，则两种物质都为阳性。

本发明提供同时检测雌二醇和睾酮的二合一免疫胶体金速测卡，其可以实现一次检测待测样本是否为雄性或者雌性，为实际检测部门提供了快速、现场和灵敏的检测方法，主要应用于粪便样品的检测。

附图说明

图1为同时检测雌二醇和睾酮的二合一免疫胶体金速测卡的示意图；1为结果观察孔；2为C线、控制线；3为雌二醇线；4为睾酮线；5为加样孔。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

下述实施例中采用的pH 7.4，0.2mol/L PBS配方如下:8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1L。

下述实施例中采用的浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液的配方如下表1：

表1

实施例1、检测雌二醇和睾酮二合一速测卡的制作

一、雌二醇和睾酮二合一速测卡的制备

1、含有检测线T1、T2和质控线C的硝酸纤维素膜的制备

1)、包被抗原的制备

E2抗原(购自上海佑隆生物科技有限公司，产品目录号：BC2111)，也可为由雌二醇(购自sigma)羟基基团与BSA蛋白的氨基基团共价偶联得到产物；

将E2抗原用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/mL得到E2抗原溶液，作为检测线T1的包被抗原。

T抗原(购自上海佑隆生物科技有限公司，产品目录号：BC2311)，也可为由睾酮(购自sigma)羟基基团与BSA蛋白的氨基基团共价偶联得到产物；

将T抗原用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/mL得到T抗原溶液，作为检测线T2的包被抗原。

羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗(购自杭州隆基)溶于浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，且羊抗鼠IgG二抗浓度为1mg/ml。

2)、包被

选取PALL170的硝酸纤维素膜(NC膜)用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的E2抗原溶液以1.0μL/cm划T1线，作为检测线；将浓度为1.0mg/mL的T抗原溶液以1.0μL/cm划T2线，作为另一检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被抗原的硝酸纤维素膜。

2、固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫的制备

1)胶体金制备

a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中(重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用。

b)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末(购于sigma)于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存。

c)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠(购自sigma)溶解于99ml超纯水中，混匀。

d)胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml。倒入棕色瓶，4℃避光保存；得到胶体金溶液(其中胶体金的粒径为40nm；浓度为万分之一)。

2)抗体标记

e)抗体的标记：取1.5ml上述1)制取好的胶体金溶液，用0.1M的K

f)标记抗体纯化：先用低速(1500r/min)离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速(8500r/min)离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％(质量百分含量)BSA的0.1M PBS(PH7.4)复溶沉淀，4℃保存；得到标记胶体金雌二醇抗体溶液(浓度为0.4mg/ml)和标记胶体金睾酮抗体溶液(浓度为0.4mg/ml)。

3)喷金与划膜

将上述2)制备的标记胶体金雌二醇抗体溶液0.4mg/ml和标记胶体金睾酮抗体溶液0.4mg/ml按1:1混匀，得到混合溶液，再将混合溶液以2.0μL/cm喷于预处理过的金标垫试纸条，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫试纸条。

试纸条中，雌二醇抗体和E2抗原之间的质量比5：4；睾酮抗体和T抗原之间的质量比5：4。

3、雌二醇和睾酮二合一速测卡的组装

雌二醇和睾酮二合一速测卡的结构示意图见图1，具体按照如下方法组装：

在上层的塑料板有两个的孔，分别为加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm，观察孔大小为4mm×18mm。

在塑料板下方从加样孔往上依次为并排粘贴的：玻璃纤维膜作为样品垫(加样孔的位置，大小为4mm×15mm)、上述2制备的固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫试纸条(金标记抗体试纸条大小为3mm×4mm)、上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜(观察孔的位置，NC膜大小为4mm×28mm)和吸收垫(4mm×19mm)。然后置于37℃真空干燥30min，得到雌二醇和睾酮二合一速测卡。

4、雌二醇和睾酮二合一速测卡的检测方法的建立

1)检测原理

检测时，首先向加样孔中加入待检样本，如果样本中含有待检测物质，则样本中的待检测物质在侧向移动的过程中与位于金标垫上的胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制在NC膜检测线上与相应的抗原结合，则该检测线(T线)不显色，多余的金标单克隆抗体则与控制线上的二抗结合，控制线(C线)显色；如果样本中不含有待检测物质，则检测线(T线)显色，控制线(C线)显色。

2)检测方法

加样孔中加入100μL样品溶液并水平放置，样品溶液会沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，抑制抗体与NC膜上的抗原结合。8-10min后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断。

结果判断：

若速测卡出现1条C线与两条T线，则待测样品中不含有雌二醇和睾酮；

若速测卡C线显色，且T1线不显色，T2线显色，则待测样品中含有雌二醇且不含有睾酮，即待测样品来自雌性物种；

若速测卡C线显色，且T2线不显色，T1线显色，则待测样品中不含有雌二醇且含有睾酮，即待测样品来自雄性物种；

若速测卡C线显色，且T2线不显色，T1线不显色，则待测样品中含有雌二醇且含有睾酮。

实施例2、雌二醇和睾酮二合一速测卡检测标品溶液效果评价

空白样品液为pH 7.4、浓度为0.2mol/L PBS缓冲液。

雌二醇标品溶液为将雌二醇标品(购自sigma)溶解在pH 7.4、浓度为0.2mol/LPBS缓冲液中，且浓度为10ng/ml；

睾酮标品溶液为将睾酮标品(购自sigma)溶解在pH 7.4、浓度为0.2mol/L PBS缓冲液中，且浓度为20ng/ml；

同时含有10ng/ml的雌二醇标品溶液和20ng/ml的睾酮标品溶液的混合溶液为将20ng/ml的雌二醇标品溶液和30ng/ml的睾酮标品溶液按照体积比1:1混合得到。

将上述各个溶液分别加入实施例1制备的雌二醇和睾酮二合一速测卡的加样孔检测，结果如下：

①雌二醇和睾酮二合一速测卡的加样孔中加入100μL空白样品液，在室温条件下反应8分钟后在结果观察孔中观察显色结果。

结果表明，观察孔中控制线C线显色，T1线和T2线显色。

②加样孔中加入100μL10 ng/ml的雌二醇标品溶液，按照与空白样品同样的操作步骤。

结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线显色，检测线T1线不显色，证明本发明的检测卡能够检测雌二醇。

③加样孔中加入100μL20 ng/ml的睾酮标品溶液，按照与空白样品同样的操作步骤。

结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T1线显色，检测线T2线不显色，证明本发明的检测卡能够检测睾酮。

④加样孔中加入100μL同时含有10ng/ml的雌二醇标品溶液和20ng/ml的睾酮标品溶液的混合溶液，按照与空白样品同样的操作步骤。

结果表明，观察孔中控制线C线显色，检测线T1线、检测线T2线均不显色，证明本发明的检测卡能够在一次加样条件下，同时检测雌二醇和睾酮。

实施例3、雌二醇和睾酮二合一速测卡检测样本效果评价

一、样本处理

本实施例中采用的样本为雌鹤粪便样本和雄鹤粪便样本，处理方法如下：

1、取0.4g样本于15mL离心管中，加入体积百分含量为80％甲醇水溶液4mL，震荡5分钟；

2、5000rpm离心3分钟；

3、取2mL上清液于5mL离心管中，60℃空气吹干；

4、加0.2mL体积百分含量为10％甲醇水溶液与0.2mL正己烷于离心管中充分震荡溶解；

5、5000rpm离心3分钟；

6、取下层清液100μL作为待测样本提取液进行检测。

得到雌鹤粪便样本提取液和雄鹤粪便样本提取液。

二、雌二醇和睾酮二合一速测卡检测样本

阴性样本为体积百分含量为10％甲醇水溶液。

雌二醇和睾酮均为阳性的样本提取液为将上述一提取的雌鹤粪便样本提取液和雄鹤粪便样本提取液按照体积比为1:1混合得到。

将上述各个样本溶液分别加入实施例1制备的雌二醇和睾酮二合一速测卡的加样孔检测，结果如下：

①加样孔中加入100μL阴性样本，按照与实施例2中空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线显色，检测线T1线、T2线不显色。

②加样孔中加入100μL上述一制备的雌鹤粪便样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线显色，检测线T1线不显色。

③加样孔中加入100μL上述一制备的雄鹤粪便样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线显色，检测线T1线不显色。

④加样孔中加入100μL雌二醇和睾酮均为阳性的样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线显色，检测线T2线、检测线T1线均不显色。

三、雌二醇和睾酮二合一速测卡检测样本准确度检测

选取30份雌鹤粪便样本和30份雄鹤粪便样本，分别按照上述一的方法制备样本提取液。

将上述样本提取液分别加入实施例1制备的雌二醇和睾酮二合一速测卡的加样孔检测，结果如下表2所示：

表2为雌二醇和睾酮二合一速测卡

上述结果表明，同时检测雌二醇和睾酮含量，结果与理论值符合率为91.7％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明专利的技术方案，所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明专利的任何改进，均落在本发明的专利保护范围内。

对比例：

选择如下不同的抗原浓度(划膜浓度)和不同的标记胶体金抗体溶液浓度(喷金浓度)按照实施例1的方法制备雌二醇和睾酮二合一速测卡。

按照实施例2的方法，分别检测在T线达到同样色度的情况下雌二醇或睾酮的检出限，结果如表3所示，可以看出，本发明实施例1中速测卡的灵敏度最高。

表3