一种EGFR/HER2受体酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗HER2突变癌症药物中的用途

摘要

本发明涉及一种EGFR/HER2受体酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗HER2突变癌症药物中的用途。具体而言涉及式A所示化合物或其可药用盐在制备治疗HER2突变的癌症的药物中的用途。

说明书

本申请是申请号为201780000888.0，申请日为2017年01月23日，发明名称为“一种EGFR/HER2受体酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗HER2突变癌症药物中的用途”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

一种EGFR/HER2受体酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗HER2突变癌症的药物中的用途。

背景技术

在世界范围内，无论男性还是女性，肺癌均已成为癌症死亡的主要原因。根据《2015年中国肿瘤登记年报》的统计表明，在中国肺癌的发病率和死亡率都占据了首位。肺癌的发病率和死亡率均随年龄增长而上升，一般40岁以后肺癌的发病率明显上升，到75岁左右达到高峰，之后有所下降(石元凯,孙燕.临床肿瘤内科手册.北京:人民卫生出版社,2015:315-341)。在肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)大约占所有肺癌患者的85％(Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics.CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29)。发达国家中腺癌是非小细胞肺癌中最常见的病理类型，约占40％。大多数NSCLC就诊时就处于局部晚期或远处转移，无法进行手术切除。

转移性NSCLC的一线治疗根据病理类型及基因改变情况而定。对EGFR基因突变阳性的患者建议进行EGFR-TKI治疗，ALK阳性的患者建议给予克唑替尼治疗(石元凯,孙燕.临床肿瘤内科手册.北京:人民卫生出版社,2015:315-341)。上述基因表达阴性的非鳞癌患者建议培美曲塞或其他含铂两药联合方案化疗，在化疗基础上可联合血管内皮抑素(YH-16)或西妥昔单抗(Cetuximab)。对一线治疗达到疾病控制(完全缓解、部分缓解和稳定)的患者，可选择维持治疗。目前循证医学证据支持的药物有培美曲塞(非鳞癌)和吉西他滨，对于EGFR基因突变患者可选择表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)维持治疗。二线治疗可选用多西紫杉醇、培美曲塞和EGFR-TKI。而三线治疗目前并没有明确的推荐治疗方案，大量的临床试验正在探索其他的有效治疗方法(石元凯,孙燕.临床肿瘤内科手册[M].北京:人民卫生出版社,2015:315-341)。除以上提及的靶点外，肺癌的研究还发现了诸多基因异常的改变，包括MET和FGFR1的扩增，PIK3CA、AKT、KRAS、NRAS、BRAF、MEK1、AKT1、FGFR2、DDR2和HER2突变，以及RET和ROS1重排等(Mazières J,Peters S,Lepage B,et al.Lungcancer that harbors an HER2 mutation：Epidemiologic characteristics andtherapeutic perspectives.J Clin Oncol,2013，31(16):1997-2003)。

其中人表皮因子受体2(HER2)基因属于HER酪氨酸受体家族的一员，HER2突变主要出现在20外显子，约占NSCLC患者的2-4％(Clin Cancer Res.2012,18:4910-4918；CancerRes.2005,65:1642-1646；Lung Cancer.2011,74:139-144.)。但2013年Barlesi等在一大型分子标记物研究中发现，10,000例晚期NSCLC患者中HER2突变率占0.9％(J Clin Oncol,2013,31(suppl):abstr 8000)。Mazières等报道检测了3800例肺腺癌患者中检测到65例(1.7％)HER2突变的患者(J Clin Oncol,2013，31(16):1997-2003)。HER2突变与其他驱动基因异常(EGFR、KRAS、BRAF突变及ALK重排等)互相排斥(Lung Cancer,2015,87(1):14-22)。Suzuki等(Lung Cancer,2015,87(1):14-22)也报道了HER2突变是浸润性非小细胞肺腺癌患者预后较差的独立影响因素(p＝0.005)。临床试验中，Tomizawa等观察到1例经铂类药为基础的化疗和吉非替尼治疗无效的HER2突变女性肺腺癌患者对曲妥珠单抗联合长春瑞滨(作为第三线治疗)有效(Lung Cancer,2011,7:139–144)。另一项研究Mazières等对HER2突变的NSCLC患者的临床特征和疗效的分析结果显示：共16例HER2突变的非小细胞肺腺癌患者接受了HER2靶向药物治疗，其中部分患者接受了2种(3例)或4种(1例)不同的HER2靶向药物(J Clin Oncol,2013，31(16):1997-2003)。总计16例HER2突变的非小细胞肺腺癌的患者接受了22次HER2靶向药物治疗并有可评估的疗效结果，其中有4例疾病进展(PD)，7例疾病稳定(SD，32％)，11例部分缓解(PR，50％)，疾病控制率(DCR)为82％。其中15例使用含曲妥珠单抗(trastuzumab)治疗的患者DCR为96％，4例使用阿法替尼(afatinib)的患者DCR为100％，2例使用拉帕替尼(lapatinib)和1例使用masatinib的患者疗效评价为PD。其中一线使用HER2靶向药物的15例患者的中位PFS为5.1个月(Mazières J et al,J ClinOncol,2013，31(16):1997-2003)。另一项来那替尼单药或联合替西罗莫司(temsirolimus)治疗HER2突变非小细胞肺癌的临床研究(NCT01827267)，2014年9月发布结果显示：13例服用来那替尼单药的受试者中，PR 0例，SD占54％，SD≥12周占31％；即ORR为0，DCR为54％。14例服用来那替尼联合替西罗莫司的患者中PR 3例(21％)，SD 11例(79％)，SD≥12周9例(64％)；即ORR为21％，DCR为100％。来那替尼单药或联合替西罗莫司用药组的PFS分别为2.9个月和4个月(http://www.bioportfolio.com/resources/trial/131948/Neratinib-With-and-Without-Tems irolimus-for-Patients-With-HER2-Activating-Mutations-in.html)。上述多个试验结果显示，一些HER2和/或EGFR靶向药物可能对HER2突变的非小细胞肺癌患者有抗肿瘤疗效，而有一些HER2和/或EGFR靶向药物则无效，至于一种具体的HER2和/或EGFR靶向药物对于HER2突变的癌症是否有效则难以预测。

CN102471312B公开了如下式A所示的化合物(化学名(E)-N-[4-[[3-氯-4-(2-吡啶基甲氧基)苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-3-[(2R)-1-甲基吡咯烷-2-基]丙-2-烯酰胺)，并公开了其具有很强的EGFR和HER2的抑制作用，并预期其可能用于治疗EGFR和HER2过度表达的癌症，

CN102933574B公开了式A化合物的一系列可药用盐。CN103974949B公开了式A化合物的二马来酸盐的晶型。

然而上述文献均没有公开式A化合物对于治疗HER2突变的癌症的作用。

发明内容

本发明惊奇地发现，化合物A或其可药用盐，对于治疗HER2突变的癌症有着惊人的效果，从而完成了本发明。

在本发明优选的实施方案中，所述的癌症是肺癌、乳腺癌或胃肠道癌症。优选所述的肺癌是非小细胞肺癌，更进一步地优选HER2突变的非小细胞肺腺癌，特别是HER2突变的晚期非小细胞肺腺癌患者。优选所述的胃肠道癌症为胃癌。

在本发明中，所述HER2突变的癌症指的是在这些癌症患者中可检测出HER2基因的癌症驱动突变(driver mutation)，突变的类型主要为第20号外显子的非移码插入突变，其次是酪氨酸激酶结构域内和其他区段的一些错义突变和小的插入和缺失突变，例如772-775YVMA duplication(本来蛋白质中772-775位置的氨基酸是一个YVMA，由于基因中插入12个碱基形成了另外一对YVMA，造成YVMA了的重复)，G776delinsVC(由于相应位点3个碱基的插入造成776号氨基酸G变成了V，并插入了氨基酸C，也可表示成insG776V C或G776>VC)，P780_Y781insGSP(由于相应位点9个碱基的插入造成780-781号氨基酸之间插入GSP三个氨基酸)，V777L(由于一个碱基的错义突变造成777号氨基酸V变成L),L755S,S310F,S310Y,G309A,G309E,D769Y,D769H,V842I,L866M,R896C，L755_E757delinsS(由于相应位点6个碱基的缺失造成755-757号3个氨基酸被一个氨基酸S取代)，L869R，L841V，G776V，L755-T759Del(由于相应位点15个碱基的缺失造成755-759号氨基酸缺失)，G776L，V777L，L755P，和S779_P780insVGS(由于相应位点9个碱基的插入造成779-780号氨基酸之间插入VGS三个氨基酸)(氨基酸序列号参照P04626 ERBB2_HUMAN)。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的癌症是EGFR突变阴性或ALK融合基因阴性的癌症，或者二者均为阴性的癌症。

在本发明优选的实施方案中，所述的癌症是经过化疗、放疗或靶向治疗后仍然进展的癌症。即患有该癌症的患者在经过化疗、放疗或靶向治疗后疾病得不到控制，仍然继续进展。其中所述的化疗可以是使用各种常规的化疗药物治疗，例如烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、尼莫司丁、雷莫司汀、达卡巴嗪、替莫唑胺、盐酸氮芥、二溴甘露醇等)、铂络合剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂等)、代谢拮抗剂(例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、替加氟、吉西他滨、卡培他滨、氟维司群、培美曲塞等)、植物生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛、依托泊苷、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、长春瑞滨、米托蒽醌、长春氟宁、拓扑替康等)、激素抗癌剂(例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、度他雄胺、地塞米松、他莫昔芬等)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、来那度胺等)、芳香化酶抑制剂(例如依西美坦、来曲唑、阿那曲唑等)、优选是经过选自卡铂、顺铂、奥沙利铂、培美曲塞、吉西他滨或多西他赛中的一种或多种进行化疗。所述的靶向治疗可以是使用选自EGFR抑制剂和VEGFR抑制剂中的一种或多种治疗。这些靶向药物是本领域熟知的，例如EGFR抑制剂可以选自吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼和阿法替尼中的一种或几种；VEGFR抑制剂选自舒尼替尼、阿帕替尼、法米替尼中的一种或几种。

在本发明中，化合物A在实际使用时，优选其可药用盐的形式，特别是马来酸盐或二马来酸盐。

在本发明中，化合物A或其可药用盐的每日用量范围可以是1mg/kg～20mg/kg，优选2mg/kg～10mg/kg，更优选4～8mg/kg。。对于成年人类，优选以化合物A计，100mg～1000mg，优选240至560mg，更优选320至480mg。其中，对于亚洲人，每日用量范围还可在240至400mg之间，特别是400mg。

化合物A或其可药用盐也可以与药学上可接受的载体一起制成本领域熟知的组合物形式，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂等。本发明还涉及使用含有化合物A的药物组合物用于HER2突变的癌症的用途。

附图说明

图1显示化合物A和拉帕替尼对体外培养肿瘤细胞增殖的抑制作用(量-效曲线)。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

实施例1：化合物A和拉帕替尼对体外培养ATCC H1781细胞增殖的影响。

1、受试药物

药物名称：化合物A的二马来酸盐(批号S0915100514)、拉帕替尼二对甲苯磺酸盐(批号20090105)。配制方法：均用DMSO配制。

2、细胞株

ATCC H1781细胞来自上海肺科医院，该细胞为HER2突变(InsG776V，C)，患者为66岁妇性高加索人肺腺癌患者，用含10％胎牛血清(FBS)的PRIM 1640培养基培养。

3、试剂及仪器

PRIM 1640购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自Gibco公司；多功能酶标仪购自BioTek公司；磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)购自Sigma公司。

4、试验方法

应用SRB蛋白染色法检测药物对肿瘤细胞增殖生长的抑制作用。主要步骤如下：

接种对数生长期细胞于96孔培养板，加入相应浓度的药物(1-10000nM)，每个浓度设复孔，同时设相应浓度的溶媒对照。肿瘤细胞在37℃、5％CO

抑制率＝(OD值

根据各浓度抑制率，根据非线性回归方法计算半数抑制浓度IC

5、试验结果

试验结果表明化合物A对HER2突变的肺腺癌细胞有很好的抑制效果，而拉帕替尼效果较差，具体结果如表1和图1所示：

表1化合物A、拉帕替尼对体外培养肿瘤细胞ATCC H1781增值IC

R为相关系数。

实施例2：化合物A和拉帕替尼对体外HER2重组蛋白酶活性的影响

1、受试药物

化合物A(批号SHR120201-002-06)，和拉帕替尼(批号SHR115758-010-17)都由江苏恒瑞医药提供，星形孢菌素购自美国MedChem(Monmouth Junction,NJ)(批号MC-2104)。

2、重组蛋白

重组人蛋白HER2 WT(Lot#W353-1)和5个HER2突变蛋白(A775_G776insYVMA:lot#Z1251-6；D769H:lot#K1683-5；D769Y:lot#P1688-9；V777_G778insCG:lot#Z1287-3；V777L:lot#K1850-3)都购自SignalChem(Richmond,BC V6V 2J2,CANADA).这些重组蛋白是HER2蛋白676号氨基酸到C末端1255号氨基酸的多肽，都是由杆状病毒在Sf9昆虫细胞里表达的，而且N末端被GST标记。EGFR基因索引号是NM_004448。WT HER2和四个HER2突变蛋白(A775_G776insYVMA,D769H,D769Y,V777_G778insCG)的蛋白纯度大于85％，另外一个HER2突变蛋白V777L纯度大于90％。

3、试验方法

以牛血清白蛋白(BSA)作为底物，向反应体系(20mM Hepes(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.02％Brij35，0.02mg/ml BSA，0.1mM Na3VO4,2mM DTT,1％DMSO)中加入10μM-0.5nM的待测化合物(化合物A或阳性对照物星形孢菌素)，再加入33P-ATP 0.01μCi/μl(Perkin Elmer)来启动磷酸化反应，以测定EGFR的酶活性。实验结果表明，化合物A对重组人野生型EGFR和第20号外显子插入性突变的酶活性都有较强的抑制作用，且随着化合物A的浓度的不断增加，EGFR全酶活性逐渐降低，呈现浓度依赖性关系。以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位为纵坐标，用Prism4软件(GraphPad)计算IC50值。

4试验结果

试验结果表明化合物A对HER2突变的肺腺癌细胞有较好的抑制效果，其中拉帕替尼，来那替尼和星形孢菌素作为对照化合物。具体结果如表2所示：

表2化合物A对体外HER2重组蛋白酶活性IC

实施例3：化合物A和拉帕替尼对体外培养HER2突变MCF10A细胞系增殖的影响。

1、受试药物

药物名称：化合物A(批号S0915151219)、拉帕替尼(批号SHR115758-010-17)。配制方法：均用DMSO配制。

2、细胞株

MCF10A细胞购自ATCC，以该细胞为母细胞，用载体GV341包装过表达慢病毒，然后用慢病毒感染建立19个混合克隆稳定细胞株，包括空载体对照(NC),HER2 WT，HER2YVMAdup，P780_Y781insGSP，G776>VC，V777L，L755S，D769H，G776R，G776C，L755P，V842I，L866M，R896C，S310F，S310Y，G309A，G309E和D769Y。所有细胞培养都用DMEM/F12培养基加5％马血清,20ng/ml EGF,10μg/ml insulin,0.5μg/ml hydrocortisone，1％penicillin/streptomycin(P/S)和100ng/ml Cholera Toxin。

3、试剂及仪器

DMEM/F12(Gibco，10-092-CVR)、马血清(源叶生物，MP20006)、胰岛素(源叶生物，11070-73-8)、表皮生长因子(Peprotech,AF-100-15-100)、霍乱毒素(sigma,9012-63-9)、

氢化可的松(源叶生物，50-23-7)、胰酶(Gibco,25200-072)、Puromycin(翊圣，60210ES25)、RIPA裂解液(鼎国，WB-0071)、MTT(Genview，JT343)。

4、试验方法

应用MTT药敏试验法检测药物对肿瘤细胞增殖生长的抑制作用。每种药物10个浓度点，1个检测时间点，2复孔。在96孔培养板每孔接种2000个细胞(培养基100μl/孔)，加入相应浓度的药物(化合物A用0.00128-500nM；拉帕替尼用0.00128-500μM)，每个浓度设复孔，同时设相应浓度的溶媒对照。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72h。然后用进行MTT检测。用酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，以下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％

根据各浓度抑制率，根据非线性回归方法计算半数抑制浓度IC50。

5、试验结果

试验结果表明化合物A对HER2突变的肺腺癌细胞有较好的抑制效果，而对照化合物拉帕替尼则抑制效果差。具体结果如表3所示：

表3化合物A对体外HER2突变细胞增殖抑制IC

实施例4：一项化合物A治疗HER2突变的晚期非小细胞肺腺癌的试验

试验方法：入组受试者为经病理学确诊的晚期非小细胞肺腺癌患者，并经检测确认存在HER2基因突变(采用厦门艾德生物医药科技有限公司的“人类HER2基因检测试剂盒荧光PCR法(第1至7例、第10例)和NGS二代测序的方法(第8例、第9例、第11例)”对患者的肿瘤病理切片进行检测)。符合入组要求的受试者均给予化合物A 320mg/d和/或400mg/d口服，每天一次，连续给药直至患者出现疾病进展/不耐受等情况为止。截止至2016年8月，已入组11例HER2突变的晚期非小细胞肺腺癌患者。受试者的平均年龄为58.4岁。所有的受试者分别经过不同的手段治疗后疾病继续进展，例如经过多西他赛或培美曲塞化疗，或者经过吉非替尼、阿法替尼等靶向药物治疗。不良事件均为1～2级，包括1/2级腹泻(4例)、2级乏力(2例)、1级皮疹(2例)和1级呼吸困难(1例)，呈临床可控。未发生严重不良事件(SAE)及因不良事件导致暂停给药、剂量下调及提前出组的情况。6例(54.5％)患者获得PR，3例(27.3％)患者疾病稳定，2例(18.2％)患者PD，ORR为54.5％，DCR为81.8％。中位PFS为6.2个月(95％CI 1.23-11.57)。目前仍有5例患者在组治疗中。

上述试验结果提示在HER2突变的非小细胞肺腺癌患者中，化合物A320 mg/d及400mg/d的安全性、耐受性良好，临床可控，且抗肿瘤疗效显著。

已有疗效评估的患者详细信息如下表4。其中，各个英文缩写的含义如下。

PD：疾病进展，直径和比靶病灶直径之和的最小值增加至少20％且直径和的绝对值增加至少5mm(出现一个或多个新病灶也视为疾病进展)；SD：疾病稳定，靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD PR：部分缓解，靶病灶直径之和比基线水平减少至少30％，至少维持4周。UK：未知。