一种线粒体DNA A1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种线粒体DNA A1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒及检测方法，包括有PCR反应液、酶系、阴性对照和阳性对照，所述CR反应液规格为6孔每条，每孔21uL，6(A、B、C、D、E、F)孔中分别含A1555G‑AA型引物探针、A1555G‑GG型引物探针、C1494T‑CC型引物探针、C1494T‑TT型引物探针及dN(U)TPs、Buffer、Mg2+、dNTP和ddH2O，本发明涉及生物技术领域。本发明，以人线粒体12S rRNA基因A1555G、C1494T位点为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，通过荧光定量PCR反应，使试剂盒可以快速、简单同时分析人线粒体12S rRNA基因A1555G、C1494T位点的基因型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种线粒体DNA A1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

1.世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。

2.随着我国经济的快速发展和国民生活质量的不断提高，社会整体保健意识不断逐渐增强，定期对自己的身体进行检查，对疾病做到早预防、早诊断早治疗已经成为一种必然趋势，健康体检的健康服务产业基于此得到快速发展。耳聋是最常见的遗传病之一，而70％的遗传性耳聋表现为非综合性耳聋。有研究表明，中国人非综合性耳聋与为数不多的几个基因突变密切相关，如mtDNA12srRNA、SLC26A4、GJB2、GJB3及GJB6等。线粒体12S rRNA基因上的一些突变主要发生于12S rRNA基因和tRNASer基因，其最常见的突变位点是C1494T和A1555G且C1494T和A1555G突变被报道与非综合性耳聋有关。

3.人线粒体基因组12S rRNA基因的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12S rRNA在二级结构上与细菌的16S rRNA的相应区域的二级结构更加相似。因此，由于C1494T、A1555G突变在12S rRNA形成G-C和U-A配对使得氨基糖苷类抗生素的结合能力更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。近些年虽然有许多新型强力的抗生素不断问世，但由于氨基糖苷类抗生素价格低廉、抗菌谱广、杀菌作用快等特点，仍然在临床上广泛使用，其后果是由氨基糖苷类抗生素导致的耳聋病例在耳聋人群中占有较高的比例。携带这两个突变的个体对氨基糖苷类抗生素高度敏感，导致临床上常见的“一针致聋”现象，是后天获得性耳聋发生的重要原因。因此对着两个点突变的检测，对于预防氨基糖苷类中毒性耳聋有着重要的临床意义。

4.目前关于检测1494C>T、1555A>G基因分型有很多，各国学者对此都进行了大量研究。已报到的方法包括：直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、ScorpionsARMS、TaqManPCR、ME-PCR等。直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费时费力，但该方法的优点是能发现一些新的未知突变。

5.因此本发明采用ARMS技术与Taqman探针相结合的方法，发明一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感而且简便的同时检测1494C>T、1555A>G基因分型，大大节省人力物力和时间。高灵敏度高特异性同时检测，提供染色体相关突变的分型信息，对于线粒体1494C>T、1555A>G突变的选择能力达到0.1％。闭管检测防止了开盖检测操作而产生污染，为临床诊断和相关领域科研提供可靠方法。

发明内容

为了解决现有的检测人线粒体12S rRNA基因A1555G、C1494T位点分型试剂盒的灵敏度低和价格贵的问题，本发明的目的是提供一种线粒体DNA A1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种线粒体DNA A1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒，包括有PCR反应液、酶系、阴性对照和阳性对照，所述CR反应液规格为6(A、B、C、D、E、F)孔每条，每孔21uL，6(A、B、C、D、E、F)孔中分别含A1555G-AA型引物探针、A1555G-GG型引物探针、C1494T-CC型引物探针、C1494T-TT型引物探针及dN(U)TPs、Buffer、Mg2+、dNTP和ddH2O。

优选的，所述酶系包含Hitaq和Hitaq稀释液；所述阴性对照包含DEPC水；所述阳性对照包含目的基因片段的质粒菌。

优选的，针对A1555G-AA型设计的引物组为：

SEQ ID NO1：CCCCTACGCATTTATATAGAGGAAA

SEQ ID NO3：CTCTGGTTCGTCCAAGTG

SEQ ID NO4：FAM-CAGTACACTTACCATGTTACGA-MGB

针对A1555G-GG型设计的引物组为：

SEQ ID NO2：CCCCTACGCATTTATATAGAGGATG

SEQ ID NO3：CTCTGGTTCGTCCAAGTG

SEQ ID NO4：FAM-CAGTACACTTACCATGTTACGA-MGB

针对C1494T-CC型设计的引物组为：

SEQ ID NO5：AGAGTGCTTAGTTGAACAGGG

SEQ ID NO6：FAM-CTGAAGCGCGTACACACC-MGB

SEQ ID NO7：TTTCCGAAGTATACTTGAGGATG

针对C1494T-TT型设计的引物组为：

SEQ ID NO5：AGAGTGCTTAGTTGAACAGGG

SEQ ID NO6：FAM-CTGAAGCGCGTACACACC-MGB

SEQ ID NO8：TTTCCGAAGTATACTTGAGGAAA。

一种线粒体DNA A1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包括有以下步骤：

步骤一：提取纯化样本DNA；

步骤二：荧光定量PCR反应体系为25ul；

步骤三：PCR反应液对应A-F位置；

步骤四：将步骤二中配好的反应体系放入ABI7500做荧光定量PCR反应；

步骤五：按照质控标准进行检测；

步骤六：结果分析；

步骤七：在质控正常的前提下，实验结果判读。

优选的，所述步骤一中，使用商业化的试剂盒来提取样本DNA，具体操作步骤参照相应提取试剂盒说明书，提取的DNA使用紫外分光光度计测定核酸的浓度和纯度，满足：OD260/280在1.8-2.0之间，浓度不低于5ng/ul；提取的DNA应立即检测，否则应保存于-70℃不超过6个月。

优选的，所述步骤二中，反应体系包括PCR反应液21ul、酶系2ul、A-D孔加待测DNA样本2ul、E孔加阳性对照2uL和F孔加阴性对照2uL。

优选的，所述步骤五中，质控标准为：

A阴性对照：结果为阴性，在FAM通道无扩增；

b阳性对照：结果为阳性，FAM通道Ct值≤28；

以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。

优选的，所述步骤六中，实验结束后，根据相关仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准，FAM基线选取3～15个循环区域；记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。

与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明以人线粒体12S rRNA基因A1555G、C1494T位点为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，通过荧光定量PCR反应，使试剂盒可以快速、简单同时分析人线粒体12S rRNA基因A1555G、C1494T位点的基因型。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：

图1为本发明的检测方法的示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种线粒体DNAA1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒，包括有PCR反应液、酶系、阴性对照和阳性对照，所述CR反应液规格为6(A、B、C、D、E、F)孔每条，每孔21uL，6(A、B、C、D、E、F)孔中分别含A1555G-AA型引物探针、A1555G-GG型引物探针、C1494T-CC型引物探针、C1494T-TT型引物探针及dN(U)TPs、Buffer、Mg2+、dNTP和ddH2O；

所述酶系包含Hitaq和Hitaq稀释液；所述阴性对照包含DEPC水；所述阳性对照包含目的基因片段的质粒菌。

针对A1555G-AA型设计的引物组为：

SEQ ID NO1：CCCCTACGCATTTATATAGAGGAAA

SEQ ID NO3：CTCTGGTTCGTCCAAGTG

SEQ ID NO4：FAM-CAGTACACTTACCATGTTACGA-MGB

针对A1555G-GG型设计的引物组为：

SEQ ID NO2：CCCCTACGCATTTATATAGAGGATG

SEQ ID NO3：CTCTGGTTCGTCCAAGTG

SEQ ID NO4：FAM-CAGTACACTTACCATGTTACGA-MGB

针对C1494T-CC型设计的引物组为：

SEQ ID NO5：AGAGTGCTTAGTTGAACAGGG

SEQ ID NO6：FAM-CTGAAGCGCGTACACACC-MGB

SEQ ID NO7：TTTCCGAAGTATACTTGAGGATG

针对C1494T-TT型设计的引物组为：

SEQ ID NO5：AGAGTGCTTAGTTGAACAGGG

SEQ ID NO6：FAM-CTGAAGCGCGTACACACC-MGB

SEQ ID NO8：TTTCCGAAGTATACTTGAGGAAA。

实施例2：

一种线粒体DNAA1555G和C1494T突变的荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包括有以下步骤：

步骤一：提取纯化样本DNA；

步骤二：荧光定量PCR反应体系为25ul；

步骤三：PCR反应液对应A-F位置，如下表；

步骤四：将步骤二中配好的反应体系放入ABI7500做荧光定量PCR反应，反应条件如下；

仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM，淬灭基团MGB(注：ABI 7500淬灭基团和荧光校正信号选择为none)；

步骤五：按照质控标准进行检测；

步骤六：结果分析；

步骤七：在质控正常的前提下，实验结果判读，如下表：

所述步骤一中，使用商业化的试剂盒来提取样本DNA，具体操作步骤参照相应提取试剂盒说明书，提取的DNA使用紫外分光光度计测定核酸的浓度和纯度，满足：OD260/280在1.8-2.0之间，浓度不低于5ng/ul；提取的DNA应立即检测，否则应保存于-70℃不超过6个月。

所述步骤二中，反应体系包括PCR反应液21ul、酶系2ul、A-D孔加待测DNA样本2ul、E孔加阳性对照2uL和F孔加阴性对照2uL。

所述步骤五中，质控标准为：

A阴性对照：结果为阴性，在FAM通道无扩增；

b阳性对照：结果为阳性，FAM通道Ct值≤28；

以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。

所述步骤六中，实验结束后，根据相关仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准，FAM基线选取3～15个循环区域；记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。

实施例3：

步骤一，将李某线粒体12S rRNA基因A1555G、C1494T位点进行基因分型检测

步骤二，提取纯化样本DNA，推荐使用商业化的试剂盒来提取样本DNA，具体操作步骤参照相应提取试剂盒说明书。提取的DNA应使用紫外分光光度计测定核酸的浓度和纯度，应满足：OD260/280在1.8—2.0之间，浓度不低于5ng/ul；提取的DNA应立即检测，否则应保存于-70℃不超过6个月。

步骤三，荧光定量PCR反应体系为25ul，包括PCR反应液21ul、酶系2ul、A-D孔加待测DNA样本2ul、E孔加阳性对照2uL和F孔加阴性对照2uL。

步骤四，PCR反应液对应A-F位置，如下表

步骤五，将步骤二配好的反应体系放入ABI7500做荧光定量PCR反应，反应条件如下：

仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM，淬灭基团MGB(注：ABI 7500淬灭基团和荧光校正信号选择为none)。

检测质控Ct值如下表：

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。