一种仿生靶向巨噬细胞光学成像剂的制备方法及其在巨噬细胞相关疾病诊断的应用

摘要

本发明涉及生物材料合成及应用技术领域，具体公开了一种仿生靶向巨噬细胞光学成像剂的制备方法及其在巨噬细胞相关疾病诊断的应用，制备方法包括以下步骤：步骤a：合成聚集诱导发光效应的2‑(2’‑羟基苯基)苯并唑类化合物(AIEgen)；步骤b：提取主要成分为β‑1,3‑D的酵母微囊(GPs)；步骤c：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，将步骤b中GPs溶于PBS配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品。该系统通过模拟真菌感染途径可被体内巨噬细胞特异性吞噬，受病变部位急剧增多趋化因子的招募，携载酵母微囊光学成像剂的巨噬细胞会大量迁移至病变部位，实现巨噬细胞相关疾病的无创诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料合成及应用技术领域，特别涉及一种仿生靶向巨噬细胞光学成像剂的制备方法与应用。

背景技术

巨噬细胞在宿主防御中发挥重要功能，其在免疫调节、器官发育及器官功能上有着重要作用，在各种疾病中发挥着调节作用。其中肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤组织中的巨噬细胞，从肿瘤起始到加速进展和转移，均起着关键作用，其数量与多种肿瘤的恶性程度和不良预后有关。此外，巨噬细胞参与多种炎症性疾病的发病进程，如类风湿性关节炎的发生发展，动脉粥样硬化，由感染导致全身炎症反应的脓毒症，炎症性肺损伤，炎症性肝损伤等。大量研究表明器官移植排斥反应发生时移植物中巨噬细胞的数量增加，例如心脏移植急性排斥反应发生时心肌组织中的巨噬细胞数量显著增多，肾移植早期巨噬细胞数量也是显著增加的，另外有文献指出肾移植病理活检中巨噬细胞的密度可预测移植肾功能。目前，已有研究表明，巨噬细胞相关疾病发生时，巨噬细胞将会像单核细胞一样直接快速不经循环地被招募至病变组织，这一生物学特性为靶向巨噬细胞成像病变部位奠定了坚实的基础。因此，对巨噬细胞进行实时长期监测可实现巨噬细胞相关疾病的早期诊断及病理进程评估，为临床早期干预和预后评估提供必要信息。

目前，示踪巨噬细胞的方式主要有正电子发射计算机断层显像(PET)、磁共振成像(MRI)、电子计算机X线断层扣描(CT)和荧光成像。PET能够实现定量成像，但存在辐射且对仪器要求较高，此外还无法提供精确的解剖学定位。MRI无辐射，能够清楚定位解剖位置，但存在空间分辨率较差的缺陷，无法实现早期精确诊断。CT虽然是临床最常用的诊断手段，但示踪巨噬细胞需要大量纳米颗粒，通常毒性较高。与临床常用的PET、MRI、CT等影像方法相比，荧光成像具有快速、无创、实时、灵敏、无辐射等优点，在疾病的早期检测和术中引导手术治疗等方面发挥着重要的作用。目前，大多数关于细胞靶向性研究主要通过荧光成像手段验证，因此荧光成像成为巨噬细胞示踪的理想成像方式。

例如，申请号为201911279822.7，专利名称为“一种巨噬细胞示踪荧光探针的制备方法及其应用”的发明专利公开了一种巨噬细胞示踪荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

S110、将羧甲基化葡聚糖、NHS或sulfo-NHS中的一个、和活化羧基试剂置于缓冲液中，室温搅拌反应得到活化好的羧甲基化葡聚糖溶液；

S120、将交联剂溶解在缓冲液中，加入活化好的羧甲基化葡聚糖溶液，室温搅拌反应后得到澄清溶液；

S130、将澄清溶液滴加至预冷的无水乙醇中去，离心得到沉淀，将得到的沉淀复溶于水，过微滤膜得到过滤液；

S140、将过滤液进行室温透析，透析结束后过滤膜，于第一温度下预冻后转移至第二温度下冷冻,再冷冻干燥得到冻干粉；

S150、将活化羧基试剂、NHS溶于二甲基亚砜中，加入示踪小分子，示踪小分子活化后加之冻干粉的水溶液中，避光室温反应得到反应液；

S160、将反应液中的游离造影小分子去除后浓缩得到浓缩液；

S170、将丁二酸酐溶于二甲基亚砜中，加入催化量三乙胺与所述浓缩液避光室温反应，室温透析后过微滤膜，得到巨噬细胞示踪荧光探针。

但是，传统的荧光染料存在聚集诱导淬灭，光稳定性差等缺陷难以实现巨噬细胞的长期示踪。而具有AIE效应的荧光团通常具有荧光量子产率高，光稳定性强等优势，能够实现长期示踪巨噬细胞的策略。

目前巨噬细胞靶向策略主要包括在成像剂递送系统表面修饰巨噬细胞特异性配体、抗体等，如修饰CD206抗体或小分子甘露糖以靶向巨噬细胞表面CD206蛋臼(又称甘露糖受体)或靶向巨噬细胞表面胶原结构巨噬细胞受体(MARCO)，CCR2受体等。

虽然抗体靶向具有很好的特异性，但纯化困难费用昂贵，且该靶向策略通常只能靶向某一亚型的巨噬细胞，另一方面存在小分子修饰易被肾脏代谢清除的问题。因此，亟待发展一种既具有靶向功能又能够长期示踪巨噬细胞的新策略。

大量研究表明，酵母真菌等微生物经胃肠道感染后大量分布于体内巨噬细胞。此外，酵母等真菌经消化道系统感染进入体内巨噬细胞过程中，其细胞壁表面的β-1,3-D葡聚糖是机体识别的重要抗原。研究进一步表明，酵母来源的β-1,3-D葡聚糖颗粒在胃肠道感染途径中，可通过派尔集合淋巴结部位的M细胞转运至肠相关淋巴组织，随后被巨噬细胞及树突状细胞表面的Dectin-l受体识别，进而被吞噬并转运至机体巨噬细胞。因此，通过提取主要成分为β-1,3-D的酵母微囊结合具有AIE效应的荧光探针制备仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂，有望成为主动靶向巨噬细胞的新策略以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种仿生靶向巨噬细胞光学成像剂的制备方法，以解决现有示踪巨噬细胞制备工艺繁琐，抗体靶向纯化困难，费用昂贵，且其稳定性差及无法长期示踪的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种仿生靶向巨噬细胞光学成像剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：合成一种结构新颖具有激发态分子内质子转移和聚集诱导发光效应的2-(2’-羟基苯基)苯并唑类化合物(AIEgen)，该化合物为光学探针。

步骤b：通过热酸碱有机溶剂提取法提取主要成分为β-1,3-D的酵母微囊(GPs)。

步骤c：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，备用，将步骤b中GPs溶于磷酸盐缓冲液(PBS)配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品，即为酵母微囊光学成像剂(AIEgen/GPs)。

优选的，所述步骤a中所述苯并唑类化合物为HBTTPA、HBTTPAQ、HBTTPI、HBTTPIQ、HBTTPAP、HBTTPEP、HBTTPIP中的一种。

优选的，所述步骤b中热酸为60℃，pH 4-5，热碱为80℃，有机溶剂为异丙醇，丙酮。

优选的，所述步骤c中GPs浓度为5-50mg/mL；GPs孵育时间为0.5-4h；AIEgen与GPs体积比为1:0.1-1:1000。

优选的，步骤c中AIEgen与GPs孵育时间为2-72h。

进一步，所述步骤a中具有聚集诱导发光性能的光学探针为正电性质的化合物。

进一步，所述步骤a中AIEgen的亲水亲油平衡值为8-18。

进一步，所述步骤a中AIEgen为近红外区发光的化合物。

进一步，步骤b中酵母菌种类除安琪酵母外还包括酿洒酵母、葡萄汁有袍汉逊酵母、季也蒙有袍汉逊酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母、膜璞毕赤酵母、美极梅奇酵母、红冬袍酵母和假丝酵母。

上述制备的光学成像剂应用于体内靶向巨噬细胞，进而实现巨噬细胞相关疾病的早期检测、病程监测及疗效评估。

具体为，该仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂用于口服用药后对体内巨噬细胞的靶向性应用，对体内巨噬细胞的长期示踪，时间为1周-1月。

进一步，该仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂用于肿瘤的早期无创诊断或肿瘤切除术中的淋巴结清扫或炎症性肠病的早期无创诊断及病程发展监测或类风湿性关节炎的早期无创诊断及病程发展监测。

进一步，该仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂用于急性肝损伤的早期无创诊断及病程发展监测或急性肺损伤的早期无创诊断及病程发展监测或动脉粥样硬化的早期无创诊断及病程发展监测。

进一步，该仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂用于排斥反应的早期无创诊断及病程发展监测或巨噬细胞异常增加的各类疾病。

本发明的有益效果为：

(1)本发明合成的荧光探针具有荧光量子产率高，光稳定性强等优势，可解决传统荧光染料存在聚集诱导淬灭，光稳定性差等缺陷。

(2)本发明基于酵母微囊构建的光学成像剂具有被动及主动的双重靶向性，能够在巨噬细胞内长期稳定存在实现巨噬细胞的长期示踪，本发明有助于推动巨噬细胞示踪的研究与发展，同时为巨噬细胞相关疾病的早期诊断、病程评估及预后提供新方法。此外，本发明提出的仿生光学成像剂制备方法简单，原材料丰富、重现性好、生物安全性好，具有较高的临床转化前景。

(3)本发明适应性广，可广泛应用于各种巨噬细胞相关疾病如肿瘤，炎症性疾病包括肠炎、关节炎、动脉粥样硬化，器官移植的急性排斥反应等，当疾病发生时，受趋化因子、炎性因子等招募作用，该光学成像剂可迅速趋化至疾病部位从而实现早期诊断，由于其长期示踪能力可实现疾病的发病进程评估及预后诊断。

附图说明

图1为本发明实施例1中荧光探针的合成路线图；

图2为本发明实施例1中仿生光学成像剂的zeta电位图；

图3为本发明实施例1中仿生光学成像剂的验证图；

图4为本发明实施例1中仿生光学成像剂的细胞安全性评价示意图；

图5为本发明实施例1中仿生光学成像剂的巨噬细胞吞噬图；

图6为本发明实施例1中仿生光学成像剂在巨噬细胞长期稳定验证图；

图7为本发明实施例1中仿生光学成像剂的动物安全性评价示意图；

图8a为本发明实施例1中仿生光学成像剂的体内靶向性评价效果图；

图8b为本发明实施例1中仿生光学成像剂的体内靶向性评价示意图；

图9a为本发明实施例1仿生光学成像剂的早期诊断移植排斥效果图；

图9b为本发明实施例1仿生光学成像剂的早期诊断移植排斥示意图；

图10a为本发明实施例1仿生光学成像剂的动态评估移植排斥程度效果图；

图10b为本发明实施例1仿生光学成像剂的动态评估移植排斥程度示意图；

图11为本发明实施例1仿生光学成像剂的应用示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1至图3所示，本发明的仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、HBTTPEP的制备：合成一种结构新颖具有激发态分子内质子转移和聚集诱导发光效应的2-(2’-羟基苯基)苯并唑类化合物(AIEgen)；

步骤b、GPs的提取：取安琪酵母13g置于200mL NaOH(1M)溶液中，超声分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h后静置冷却至室温，2000×g离心10min，弃上清，水洗两遍，随后加入200mL pH 4-5的双蒸水(HCl调pH)中，搅拌分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h，离心水洗(2000×g，10min)2遍，弃除上清，分别再用异丙醇(洗4遍)及丙酮(洗2遍)清洗，离心收集沉淀，干燥后即得酵母微囊(GPs)；

步骤c、HBTTPEP/GPs的制备：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，备用，将步骤b中GPs溶于磷酸盐缓冲液(PBS)配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品，即为仿生光学成像剂(AIEgen/GPs)。

如图4至图11所示，仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂的应用具体如下：

步骤d、HBTTPEP/GPs应用于长期示踪巨噬细胞：选用小鼠巨噬细胞系RAW264.7，以巨噬细胞与HBTTPEP/GPs比例为1:50共孵育，通过激光共聚焦显微镜定性分析巨噬细胞吞噬率，采用CCK8试剂盒验证其细胞毒性，利用透射电镜分析巨噬细胞携载HBTTPEP/GPs的7d稳定性。

步骤e、HBTTPEP/GPs应用于皮肤移植排斥反应的早期诊断：构建小鼠皮肤移植模型，C57小鼠作为移植皮肤受体，Balb/c作为移植皮肤供体，分别于移植术后第0，2，4，6d口服灌胃HBTTPEP/GPs，于第1，3，5，7d成像，结果表明HBTTPEP/GPs可以早期诊断其排斥反应的发生。

步骤f、HBTTPEP/GPs应用于皮肤移植排斥反应进程的动态评估：构建小鼠皮肤移植模型，移植术后第0天口服灌胃HBTTPEP/GPs，分别于第1，3，5，7，9，11d进行成像，结果表明随着排斥程度加深，移植皮肤荧光强度逐渐加深，证明HBTTPEP/GPs可以应用于皮肤移植排斥反应进程的动态评估。

步骤g、HBTTPEP/GPs应用于皮肤移植排斥反应的疗效评估：构建小鼠皮肤移植模型，移植术后每天给予3mg/kg的FK506进行治疗，连续给药7次，移植术后第6天给予HBTTPEP/GPs，第7天利用小动物活体成像进行疗效评估，结果显示治疗后移植皮荧光强度显著降低，表明HBTTPEP/GPs能够应用于皮肤移植排斥反应的疗效评估。

实施例2

本发明的仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、HBTTPEP的制备：合成一种结构新颖具有激发态分子内质子转移和聚集诱导发光效应的2-(2’-羟基苯基)苯并唑类化合物(AIEgen)；

步骤b、GPs的提取：取安琪酵母13g置于200mL NaOH(1M)溶液中，超声分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h后静置冷却至室温，2000×g离心10min，弃上清，水洗两遍，随后加入200mL pH 4-5的双蒸水(HCl调pH)中，搅拌分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h，离心水洗(2000×g，10min)2遍，弃除上清，分别再用异丙醇(洗4遍)及丙酮(洗2遍)清洗，离心收集沉淀，干燥后即得酵母微囊(GPs)；

步骤c、HBTTPEP/GPs的制备：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，备用，将步骤b中GPs溶于PBS配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品，即为仿生光学成像剂(AIEgen/GPs)。

该系统在肿瘤的早期诊断及肿瘤切除术中淋巴清扫成像的应用具体如下：

步骤d、HBTTPEP/GPs应用于肿瘤的早期诊断：构建乳腺癌的原位癌模型，荷瘤2周后，口服HBTTPEP/GPs，24h后对小鼠进行成像。

步骤e、HBTTPEP/GPs应用于肿瘤切除术中淋巴清扫成像：构建乳腺癌的原位癌模型，荷瘤2周后，口服HBTTPEP/GPs，24h后剖开小鼠暴露肿瘤及周围淋巴结，利用活体成像仪对其进行成像。

实施例3

本发明的仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、HBTTPEP的制备：合成一种结构新颖具有激发态分子内质子转移和聚集诱导发光效应的2-(2’-羟基苯基)苯并唑类化合物(AIEgen)；

步骤b、GPs的提取：取安琪酵母13g置于200mL NaOH(1M)溶液中，超声分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h后静置冷却至室温，2000×g离心10min，弃上清，水洗两遍，随后加入200mL pH 4-5的双蒸水(HCl调pH)中，搅拌分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h，离心水洗(2000×g，10min)2遍，弃除上清，分别再用异丙醇(洗4遍)及丙酮(洗2遍)清洗，离心收集沉淀，干燥后即得酵母微囊(GPs)；

步骤c、HBTTPEP/GPs的制备：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，备用，将步骤b中GPs溶于PBS配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品，即为仿生光学成像剂(AIEgen/GPs)。

该系统在炎症性疾病如类风湿性关节炎早期诊断应用具体如下：

步骤d、HBTTPEP/GPs应用于类风湿性关节炎的早期诊断：构建类风湿性关节炎模型，造模后口服给予HBTTPEP/GPs，24h后对其进行成像。

实施例4

本发明的仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、HBTTPAP的制备：首先合成HBTTPAQ，称取化合物HBTTPAQ(31.3mg,0.056mmol)和化合物1-乙基-4-甲基吡啶-1-碘化物(36mg,0.14mmol)溶解在6mL无水乙醇中，室温充分搅拌，随后向反应体系中加入10μL哌啶。反应体系在95℃充分回流反应8小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物HBTTPAP。产率为57.4％。HRMS(ESI):m/z662.2457[(M-I)+,calcd for 689.2472]；

步骤b、GPs的提取：取安琪酵母13g置于200mL NaOH(1M)溶液中，超声分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h后静置冷却至室温，2000×g离心10min，弃上清，水洗两遍，随后加入200mL pH 4-5的双蒸水(HCl调pH)中，搅拌分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h，离心水洗(2000×g，10min)2遍，弃除上清，分别再用异丙醇(洗4遍)及丙酮(洗2遍)清洗，离心收集沉淀，干燥后即得酵母微囊(GPs)；

步骤c、HBTTPEP/GPs的制备：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，备用，将步骤b中GPs溶于PBS配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品，即为仿生光学成像剂(AIEgen/GPs)。

该系统在皮肤移植的早期诊断及病程评估的应用具体如下：

步骤d、HBTTPAP/GPs应用于长期示踪巨噬细胞。

步骤e、HBTTPAP/GPs应用于皮肤移植排斥反应的早期诊断。

实施例5

本发明的仿生靶向巨噬细胞的光学成像剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、HBTTPIP的制备：首先合成HBTTPIQ，随后称取化合物HBTTPIQ(21mg,0.031mmol)和化合物1-乙基-4-甲基吡啶-1-碘化物(11.4mg,0.046mmol)溶解在6mL无水乙醇中，室温充分搅拌，随后向反应体系中加入10μL哌啶。反应体系在95℃充分回流反应8小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物HBTTPIP。产率为60.3％。HRMS(ESI):m/2z 395.1478[(M-I)+,calcd for 789.2894]；

步骤b、GPs的提取：取安琪酵母13g置于200mL NaOH(1M)溶液中，超声分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h后静置冷却至室温，2000×g离心10min，弃上清，水洗两遍，随后加入200mL pH 4-5的双蒸水(HCl调pH)中，搅拌分散均匀，于80℃水浴中旋转孵育1h，离心水洗(2000×g，10min)2遍，弃除上清，分别再用异丙醇(洗4遍)及丙酮(洗2遍)清洗，离心收集沉淀，干燥后即得酵母微囊(GPs)；

步骤c、HBTTPIP/GPs的制备：将步骤a中的AIEgen溶于无水乙醇中配置1mM母液，4℃保存，备用，将步骤b中GPs溶于PBS配置成10mg/mL的混悬液，孵育1h，随后，以体积比1:10的比例将AIEgen与GPs混匀，孵育24h，离心，洗涤，收集样品，即为仿生光学成像剂(AIEgen/GPs)。

该系统在皮肤移植的早期诊断及病程评估的应用，具体为：

步骤d、HBTTPIP/GPs应用于长期示踪巨噬细胞。

步骤e、HBTTPIP/GPs应用于皮肤移植排斥反应的早期诊断。

本发明合成的荧光探针具有荧光量子产率高，光稳定性强等优势，可解决传统荧光染料存在聚集诱导淬灭，光稳定性差等缺陷。

本发明基于酵母微囊构建的光学成像剂具有被动及主动的双重靶向性，能够在巨噬细胞内长期稳定存在实现巨噬细胞的长期示踪，本发明有助于推动巨噬细胞示踪的研究与发展，同时为巨噬细胞相关疾病的早期诊断、病程评估及预后提供新方法。此外，本发明提出的仿生光学成像剂制备方法简单，原材料丰富、重现性好、生物安全性好，具有较高的临床转化前景。

本发明适应性广，可广泛应用于各种巨噬细胞相关疾病如肿瘤，炎症性疾病包括肠炎、关节炎、动脉粥样硬化，器官移植的急性排斥反应等，当疾病发生时，受趋化因子、炎性因子等招募作用，该光学成像剂可迅速趋化至疾病部位从而实现早期诊断，由于其长期示踪能力可实现疾病的发病进程评估及预后诊断。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。