IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型及构建方法

摘要

本发明公开了IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型及其构建方法，动物模型通过CRISPR/Cas9介导的基因工程，将人类IDOL基因敲入C57BL/6J小鼠H11位点得到。本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因工程，建立人类IDOL基因敲入C57BL/6J小鼠H11位点，从而获得动脉粥样硬化小鼠，该技术在不改变小鼠基因的情况下，插入人类IDOL基因，避免了LDLR缺陷对小鼠其他组织器官产生影响。

说明书

技术领域

本发明属于基础医学科研技术领域，具体涉及一种IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型，还涉及上述动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法。

背景技术

以动脉粥样硬化为病理基础的心血管疾病是危害我国人民健康的一类重大疾病。随着经济高速发展这类疾病也成为近十几年我国人口死亡的主要死亡原因，目前患病率及死亡率仍处于上升阶段，因此，对动脉粥样硬化的研究刻不容缓。

IDOL(degrader of the LDL receptor,IDOL)是在人身体各个组织广泛表达的基因，可以在低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的胞质尾部激发其泛素化。所以，IDOL基因在体内的增加会抑制LDLR表达，促进LDLR降解，进而导致低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的代谢下降，使循环中的LDL等脂蛋白回肝受阻，无法排除体外，从而引起动脉粥样硬化的形成。然而，目前动脉粥样硬化研究的一个主要困难是与人类疾病相似的动物模型的形成。

发明内容

本发明的第一个目的是提供IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型，其在喂养过程中自发形成动脉粥样硬化，解决了现有技术中小鼠因LDLR的缺陷造成对其他组织器官的影响。

本发明的另一目的在于提供上述动脉粥样硬化小鼠动物模型的构建方法。

本发明所采用的第一种技术方案是：IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型，动物模型通过CRISPR/Cas9介导的基因工程，将人类IDOL基因敲入C57BL/6J小鼠H11位点得到。

本发明所采用的第二种技术方案是IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，按照以下步骤进行：

步骤1、基于CRISPR/Cas9技术确定C57BL/6J小鼠H11位点的特异性靶位点gRNA的基因序列，gRNA的基因序列为SEQ ID NO:1所示，再制备Cas9蛋白；

步骤2、以BAC克隆为模板，通过PCR生成同源臂，采用In-Fusion技术构建打靶载体，将“AIb promoter-Human MYLIP cDNA-rBG pA”盒插入C57BL/6J小鼠H11位点，即IDOL基因插入C57BL/6J小鼠H11位点，得到有针对性的等位基因即为敲入小鼠体内的携带IDOL基因的打靶载体；

步骤3、将步骤1得到的gRNA和Cas9蛋白、步骤2得到的线性化的打靶载体共同注射进入代孕小鼠C57BL/6J的受精卵中，繁育获得阳性F0代小鼠；

步骤4、提取F0代小鼠的尾部DNA，进行PCR扩增产物测序鉴定；

步骤5、将步骤4中性成熟的阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配繁殖一代，获得F1代小鼠，即为制备的小鼠模型。

本发明所采用的第二种技术方案的特点还在于，

步骤1中H11位点位于C57BL/6J小鼠11号染色体Eif4enif1和Drg1基因区间。

步骤2中通过人类IDOL基因信息，得知人类IDOL基因位于人类6号染色体上。

将步骤2中IDOL基因插入C57BL/6J小鼠H11位点后，通过PCR及测序对打靶载体进行验证，并通过酶切将该打靶载体质粒线性化。

本发明的有益效果是：本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因工程，建立人类IDOL基因敲入C57BL/6J小鼠H11位点，从而获得动脉粥样硬化小鼠，该技术在不改变小鼠基因的情况下，插入人类IDOL基因，避免了LDLR缺陷对小鼠其他组织器官产生影响。

附图说明

图1是本发明野生型等位基因图；

图2是本发明制备IDOL基因片段的流程图；

图3是本发明IDOL基因的针对向量图；

图4是本发明突变型等位基因图；

图5是本发明肝脏IDOL、LDLR和血浆IDOL的蛋白表达图；

图6是本发明小鼠动脉粥样硬化病变面积图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型，通过CRISPR/Cas9介导的基因工程，建立人类IDOL基因敲入C57BL/6J小鼠H11位点，从而得到本发明的动脉粥样硬化小鼠模型，本发明制备的动物模型具有排除LDLR缺陷造成对其他组织器官影响的优势。

本发明一种IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，具体包括以下步骤：

步骤1、如图1所示，基于CRISPR/Cas9技术确定C57BL/6J小鼠H11位点的特异性靶位点gRNA的基因序列，得到gRNA的目标基因序列为：GAACACTAGTGCACTTATCCTGG，H11位点位于C57BL/6J小鼠11号染色体Eif4enif1和Drg1基因区间，同时制备Cas9蛋白；

步骤2、如图2所示，Alb Promoter为启动子，Human MYLIP cDNA为人类IDOL基因，Exon of mouse Eif4enif1为外显子，Homology arm为同源臂。然后如图3所示，以BAC克隆为模板，通过PCR生成同源臂，采用In-Fusion技术构建如图的打靶载体，将“AIb promoter-Human MYLIP cDNA-rBG pA”盒，即携带IDOL基因的试剂盒插入C57BL/6J小鼠H11位点。如图4所示，通过PCR及测序对打靶载体进行验证，并通过酶切将该打靶载体质粒线性化，得到有针对性的等位基因(突变型等位基因)，即为敲入小鼠体内的携带IDOL基因的打靶载体。

步骤3、将步骤1得到的gRNA、Cas9蛋白，步骤2得到的携带IDOL基因的线性化打靶载体共同用显微注射法注射进入代孕小鼠C57BL/6J的受精卵中，繁育获得阳性F0代小鼠。

步骤4、提取F0代小鼠的尾部DNA，进行PCR扩增产物测序鉴定。

步骤5、将步骤4中性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型小鼠交配繁殖一代，获得F1代小鼠。通过PCR扩增、测序分析以及Southern杂交，对幼崽进行基因分型以及验证。

对本发明的自发动脉粥样硬化的小鼠进行模型验证：

将本发明获得的小鼠模型进行饲料喂养6周之后，我们处死老鼠之后，取出其心脏、肝脏、血浆及主动脉进行实验验证。

将肝脏和血浆进行提取蛋白，经过蛋白质印迹法，结果如图5所示，从图5来看，IDOL组小鼠肝脏IDOL的蛋白表达高于对照组小鼠，相反，LDLR的蛋白表达IDOL组小鼠低于对照组小鼠。对比可知，IDOL的高表达会抑制LDLR的表达。

如图6所示是小鼠动脉粥样硬化模型剥离的主动脉图，图6(A)小鼠主动脉大体动脉粥样硬化病变面积；图6(B)是小鼠心脏流出道动脉粥样硬化病变面积，由图6(A)可知，敲入IDOL基因的小鼠动脉粥样硬化有斑块，说明表达IDOL的小鼠动物模型制作成功，且表型明显。进一步，分离小鼠心脏，对心脏流出道进行冰冻切片，切片后进行油红O染色，染色结果如图6(B)所示，敲入IDOL基因的小鼠心脏流出道有动脉粥样硬化病变，进一步证明敲入IDOL基因的小鼠动物模型制作成功，且表型明显。

现有的动脉粥样硬化模型动物以基因缺陷的小鼠为主，是通过敲除小鼠LDLR、ApoE(apolipoprotein A,ApoE)等特定的基因来形成动脉粥样硬化小鼠，这类小鼠模型基因缺陷，会导致这类基因缺陷对其他组织器官产生影响，进而可能改变身体其他机能。本专利与现有的思路不同，本专利通过将影响动脉粥样硬化形成的IDOL基因敲入小鼠H11位点来构建了小鼠模型，由于将IDOL基因插入小鼠H11位点，形成敲入型小鼠，使得其具有排除因缺陷对小鼠其他组织器官产生影响进而对身体机能造成影响的优势，对研究结果降低影响的优点。

序列表

<110> 西安医学院

<120> IDOL转基因自发动脉粥样硬化小鼠模型及构建方法

<130> 2020

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaacactagt gcacttatcc tgg 23