Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物及其检测方法与应用

摘要

本发明提供了一种Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物，该特异性引物包括用于第一轮PCR扩增的外引物对和用于第二轮PCR扩增的内引物对，所述外引物对包括外引物F1和外引物R1，所述内引物对包括内引物F2和内引物R2，还提供了巢式PCR检测方法，提取疑似感染Ⅰ群禽腺病毒的禽类的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；建立Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR体系，先用内引物对S1中得到的待检测基因组DNA进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物，再用所述第一轮PCR扩增的扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到感染Ⅰ群禽腺病毒的基因特异性核酸片段。还提供了应用，用于检测禽类是否感染Ⅰ群禽腺病毒。本发明具有良好的特异性、重复性、准确性和通用性。

说明书

技术领域

本发明属于Ⅰ群禽腺病毒检测技术领域，具体涉及一种Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物及其检测方法与应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属成员，根据其群特异性抗原不同可分为三个群(FAdV-Ⅰ、FAdV-Ⅱ、FAdV-Ⅲ)。其中FadV-Ⅰ(Ⅰ群禽腺病毒)可分为5个种(A～E)和12个血清型(1～8a、8b～11)，FAdV-Ⅱ主要包括火鸡出血性肠炎病毒，FAdV-Ⅲ主要包括鸡减蛋综合征病毒。FAdV-Ⅰ的12个血清型均不具有凝集红细胞的特性，病毒可以潜伏感染，也可以垂直传播，家禽感染禽腺病毒后主要有三种典型的临床症状，即包涵体肝炎(IBH)、心包积水综合征(HPS)及肌胃糜烂(AGE)。当前FAdV-Ⅰ呈世界性分布，鸡、火鸡、鸽子、鸭等禽类均普遍易感，对家禽养殖业危害严重，尤其是自2014年以来临床中以心包积液为主要特征的禽腺病毒感染疫情给我国养禽业造成巨大的经济损失。为了减少FAdV-Ⅰ对养禽业的危害，加强FAdV-Ⅰ的病原检测和提高检测方法的敏感性至关重要，当前我国研究学者研究表明我国FAdV-Ⅰ的流行病毒株主要有血清4型、8a型、8b型和11型，因此有必要建立一种针对流行的众多血清型FAdV-Ⅰ的快速检测方法，为开展该病的临床诊断、流行病学监测、疫病综合防控提供技术保障。

FAdV-Ⅰ近几年呈逐渐流行趋势，临床中通过临床症状和病理剖检可以做出初步诊断，但FAdV-Ⅰ引起的临床特征与禽白血病、戊型肝炎等疫病极其相似，临床中很难进行确诊，鉴别诊断需要借助实验室病原学检测方法进行，目前，FAdV-Ⅰ病原学检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫学和分子生物学方法，病毒分离是最可靠的检测方法，但病毒分离的周期较长，不适合临床快速诊断的需要。免疫学检测方法具有一定的滞后性，无法检测出早期感染的病毒；分子生物学方法中应用较多的是常规PCR和荧光定量PCR检测方法，荧光定量PCR检测方法的敏感性非常高，但荧光定量PCR方法需要昂贵的荧光定量PCR仪，检测试剂成本较高、对操作人员技术水平要求较高，不适合基层实验室使用；常规PCR方法不需要昂贵的仪器、检测成本低、操作简单、对操作人员技术水平要求较低，但常规PCR方法的敏感性有限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物及其检测方法与应用，该Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR通过两轮PCR扩增大大提高了检测方法的敏感性，该检测方法的最低检出量为0.28ng核酸DNA，同时具有良好的特异性、重复性、准确性和通用性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物，该特异性引物包括用于第一轮PCR扩增的外引物对和用于第二轮PCR扩增的内引物对，所述外引物对包括外引物F1和外引物R1，所述内引物对包括内引物F2和内引物R2；

所述外引物F1具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；

所述外引物R1具有序列表SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；

所述内引物F2具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；

所述内引物R2具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列。

本发明还提供了一种上述的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物的巢式PCR检测方法，该方法为：

S1、提取疑似感染Ⅰ群禽腺病毒的禽类的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；

S2、Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR体系的建立：先用内引物对S1中得到的待检测基因组DNA进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物，再用所述第一轮PCR扩增的扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到感染Ⅰ群禽腺病毒的基因特异性核酸片段；

所述第一轮PCR扩增的扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、待检测基因组DNA 5μL、浓度为20μM的外引物F10.5μL、浓度为20μM的外引物R1 0.5μL、以重蒸去离子水补足至25μL；

所述第一轮PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；

所述第二轮PCR扩增的扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、第一轮PCR扩增产物5μL、浓度为20μM的内引物F20.5μL、浓度为20μM的内引物R2 0.5μL、以重蒸去离子水补足至25μL；

所述第二轮PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环。

本发明还提供了一种上述的巢式PCR检测方法的应用，所述巢式PCR检测方法用于检测禽类是否感染Ⅰ群禽腺病毒。

优选地，所述Ⅰ群禽腺病毒的流行病毒株为血清4型、8a型、8b型和11型。

优选地，所述巢式PCR检测方法的敏感性为：禽类感染Ⅰ群禽腺病毒的基因组DNA的最低检出量为0.28ng。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)可以水平传播，病毒广泛存在于鸡的粪便、气管及鼻粘膜和肾脏中，病毒通过鸡的各种分泌物和排泄物传播，在粪便中有很高的病毒滴度，健康鸡群通过接触带毒的粪便感染，在短时间内就可以通过空气传播病毒，导致在整个鸡群发生持续扩散传播。FAdV-Ⅰ也可以垂直传播，在公鸡的精液中也存在病毒，人工授精也可以将病毒扩散，蛋鸡在产蛋高峰期受到应激和性激素的影响可以出现排毒期，导致种蛋将病毒传播给下一代。禽腺病毒感染一般在21天后开始排毒，在感染的鸡群中，有时可以分离到多个血清型的病毒。鉴于FAdV-Ⅰ对鸡群的综合危害性较强，防控难度较大，加强FAdV-Ⅰ的病原学监测和提高检测方法的敏感性对本病的防控尤为重要。

2、本发明建立了Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR检测方法，在常规的PCR方法基础上，增加1对检测引物，通过两轮PCR扩增，大大提高PCR扩增的敏感性，其敏感性可与荧光定量PCR方法相当，但只需要与常规PCR一致的仪器、试剂和技术操作，特别适合于基层兽医实验室使用，对处于潜伏期感染的病毒和早期感染的病毒具有很好的检出率，适用于疾病的早期诊断，通过两轮PCR扩增大大提高了检测方法的敏感性，该检测方法的最低检出量为0.28ng核酸DNA，是普通PCR方法敏感性100倍，且同时具有良好的特异性、重复性、准确性和通用性，能够用于FAdV-Ⅰ所有血清型的临床快速诊断，将为Ⅰ群禽腺病毒的临床诊断、流行病学监测、疫病防控和净化提供技术支持，其推广应用将大大提高了基层兽医实验室的FAdV-Ⅰ病原学检测能力和技术水平。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例1的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物巢式PCR扩增电泳图。

图2是本发明实施例1的对照组1的FAdV-Ⅰ的外引物对单重PCR扩增电泳图。

图3是本发明实施例1的对照组2的FAdV-Ⅰ的内引物对单重PCR扩增电泳图。

图4是本发明实施例2的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物巢式PCR扩增的特异性结果图。

图5是本发明实施例3的FAdV-Ⅰ的外引物对单重PCR扩增的敏感性结果图。

图6是本发明实施例3的FAdV-Ⅰ的内引物对单重PCR扩增的敏感性结果图。

图7是本发明实施例3的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物巢式PCR扩增的敏感性结果图。

图8是本发明实施例4的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物巢式PCR扩增的可重复性试验第一次检测结果图。

图9是本发明实施例4的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物巢式PCR扩增的可重复性试验第二次检测结果图。

图10是本发明实施例4的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物巢式PCR扩增的可重复性试验第三次检测结果图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)巢式PCR的特异性引物，该特异性引物包括用于第一轮PCR扩增的外引物对和用于第二轮PCR扩增的内引物对，所述外引物对包括外引物F1和外引物R1，所述内引物对包括内引物F2和内引物R2；

所述外引物F1具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；

所述外引物R1具有序列表SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；

所述内引物F2具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；

所述内引物R2具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列。

本实施例还提供了一种上述的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物的巢式PCR检测方法，该方法为：

S1、提取(Ⅰ群禽腺病毒)FAdV-Ⅰ基因组DNA，得到检测基因组DNA；所述FAdV-Ⅰ基因组DNA为血清4型；

S2、Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR体系的建立：先用内引物对S1中得到的待检测基因组DNA进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物，再用所述第一轮PCR扩增的扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到感染Ⅰ群禽腺病毒的基因特异性核酸片段；

所述第一轮PCR扩增的扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、待检测基因组DNA 5μL、浓度为20μM的外引物F10.5μL、浓度为20μM的外引物R1 0.5μL、以重蒸去离子水补足至25μL；

所述第一轮PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；

所述第二轮PCR扩增的扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、第一轮PCR扩增产物5μL、浓度为20μM的内引物F20.5μL、浓度为20μM的内引物R2 0.5μL、以重蒸去离子水补足至25μL；

所述第二轮PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环。

如图1所示，图1中M为DL-2 000 DNA Marker；1为FAdV-Ⅰ；2为水对照。利用巢式PCR对FAdV-Ⅰ可扩增出约356bp的特异性条带，条带大小与试验预期相符。

本实施例同时设置了Ⅰ群禽腺病毒外引物对单重PCR和Ⅰ群禽腺病毒内引物对单重PCR的对照试验：

对照组1：

本对照组为Ⅰ群禽腺病毒外引物对单重PCR的方法：该方法为：

利用外引物对提取的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)DNA进行PCR扩增；所述Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)DNA同实施例1；

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、待检测基因组DNA 5μL、、浓度为20μM的外引物F10.5μL、浓度为20μM的外引物R1 0.5μL、以重蒸去离子水补足至25μL；所述外引物对即为实施例1的外引物对；

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；扩增产物经核酸电泳观察结果。

如图2所示，图2中M为DL-2 000 DNA Marker；1为FAdV-Ⅰ；2为水对照。FAdV-Ⅰ的外引物对可扩增出约592bp的特异性条带，条带大小与试验预期相符。

对照组2：

本对照组为Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)内引物对单重PCR的方法：该方法为：

利用内引物对提取的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)DNA进行PCR扩增；所述Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)DNA同实施例1；

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、第一轮PCR扩增产物5μL、浓度为20μM的内引物F20.5μL、浓度为20μM的内引物R2 0.5μL、以重蒸去离子水补足至25μL；

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；扩增产物经核酸电泳观察结果。

如图3所示，图3中M为DL-2 000 DNA Marker；1为FAdV-Ⅰ；2为水对照。FAdV-Ⅰ的内引物对可扩增出约356bp的特异性条带，条带大小与试验预期相符。

实施例2

本实施例为实施例1的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)巢式PCR检测方法的特异性试验:

在实施例1的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)DNA的检测同时，设置了减蛋综合征病毒病毒(EDSV)、鸡痘病毒(APV)、马立克病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DEV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的基因组DNA作为对照，同样采用上述巢式PCR方法进行扩增检测，特异性检测结果如图4所示，图1中M为DL2 000 DNA Marker；1为FAdV-Ⅰ；2为EDSV；3为APV；4为MDV；5为ILTV；6为DEV；7为AIV-H9；8为NDV；9为IBV；10为水对照。

结果只有FAdV-Ⅰ扩增出356bp的特异性条带，与预期相符，而减蛋综合征病毒病毒(EDSV)、鸡痘病毒(APV)、马立克病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DEV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)扩增结果均为阴性，巢式PCR方法具有很好的特异性。

实施例3

本实施例为实施例1的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)巢式PCR检测方法的敏感性试验:

将实施例1中的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)DNA进行10

FAdV-Ⅰ基因组DNA进行10

图5-7中各标注均为：M为DL-2 000 DNA Marker；1为FAdV-Ⅰ基因组DNA稀释倍数为10

实施例4

本实施例为实施例1的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)巢式PCR检测方法的可重复性试验:

本实施例按照实施例1的巢式PCR检测方法在三个不同时间依次对FAdV-Ⅰ、EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV、3份阳性病料、3份阴性病料的基因组DNA重复检测3次，确定巢式PCR方法的重复性。

如图8、图9、图10所示，FAdV-Ⅰ、EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV、3份阳性病料、3份阴性病料样品在不同时间重复检测3次的检测结果完全一致，说明实施例1的巢式PCR方法具有很好的可重复性。

图8-10中：M为DL-2 000 DNA Marker；1为FAdV-Ⅰ；2为EDSV；3为APV；4为MDV；5为ILTV；6为DEV；7为AIV-H9；8为NDV；9为IBV；10为FAdV-Ⅰ阳性样品；11为FAdV-Ⅰ阳性样品；12为FAdV-Ⅰ阳性样品；13为FAdV-Ⅰ阴性样品；14为FAdV-Ⅰ阴性样品；15为FAdV-Ⅰ阴性样品；16为水对照。

实施例5

本实施例为实施例1的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR检测方法的符合性试验：

利用实施例1的巢式PCR方法和病毒分离鉴定方法分别对22份临床病料样品进行检测，比较分析二种检测方法的阳性样品数和阴性样品数，计算二种检测方法的符合率，确定巢式PCR方法的准确性。

符合率(％)＝(两种检测方法检测结果相同样品数/样品总数)×100％

如表1所示，22份临床病料样品经巢式PCR方法和病毒分离鉴定方法检测的结果如表2所示，巢式PCR方法共检测出阳性样品14份，而病毒分离鉴定方法共分离鉴定出病毒12株，巢式PCR方法相对于病毒分离鉴定方法的符合率达90.91％(20/22)。将2份病毒分离鉴定方法为阴性，而巢式PCR方法检测为阳性的PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，测序结果表明2份阳性样品均为FAdV-4特异性核苷酸序列，说明巢式PCR方法的敏感性高于病毒分离鉴定方法，巢式PCR方法具有良好的准确性。

表1符合性试验检测结果

注：“+”表示检测结果呈阳性，“-”表示检测结果呈阴性。

实施例6

本实施例为实施例1的Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR巢式PCR检测方法的应用，所述检测方法用于检测禽类是否感染Ⅰ群禽腺病毒。

利用建立的巢式PCR检测方法对2017～2020年采集的西藏部分养殖场的疑似FAdV-感染的临床病死鸡、鸭病料样品91份进行检测，阳性样品PCR扩增产物全部送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定，对测序结果通过Blast进行在线比对分析，通过序列比对分析对阳性样品进行血清型分型鉴定，评估巢式PCR方法对检测FAdV-Ⅰ的通用性，确定巢式PCR方法的临床适用性。

利用建立的巢式PCR检测方法对2017～2020年采集的西藏部分养殖场的疑似FAdV-Ⅰ感染的临床病死鸡、鸭病料样品91份进行检测，结果如表2所示，共检测出阳性样品58份，阳性感染率达63.74％。58阳性样品PCR扩增产物的序列测定比对分析结果表明临床表现为心包积液的28份阳性鸡病料样品均为血清4型FAdV-Ⅰ；临床表现为肝脏肿大、易碎的21份阳性鸡病料样品中有5份为血清4型FAdV-Ⅰ，8份为血清8a型FAdV-Ⅰ，6份为血清8b型FAdV-Ⅰ，2份为血清11型FAdV-Ⅰ；临床表现为肌胃糜烂的6份阳性鸡病料样品中有2份为血清4型FAdV-Ⅰ，1份为血清8b型FAdV-Ⅰ，3份为血清11型FAdV-Ⅰ；临床表现为肝脏肿大、易碎的3份阳性鸭病料样品均为血清4型FAdV-Ⅰ。巢式PCR方法可检测出血清4型、8a型、8b型、11型FAdV-Ⅰ，巢式PCR方法检测FAdV具有良好的通用性和临床适用性。

表2临床样品检测结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 西藏职业技术学院

<120> Ⅰ群禽腺病毒巢式PCR的特异性引物及其检测方法与应用

<130> 2020.11.15

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

tatcgcgtgc gctaca 16

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

tgccggagtt gacttg 16

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

cggcggaacg gctta 15

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

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