FX活化方法及其在FXa组合物制备中的用途

摘要

本发明涉及高纯度凝血因子Xa(FXa或活化凝血因子X)的制备以及用于获得所述高纯度和高活化度的FXa的活化和纯化方法，其无需在制备过程中添加蛋白质活化剂。

说明书

技术领域

本发明涉及高纯度凝血因子Xa(FXa或活化凝血因子X)的制备以及用于获得所述高纯度和高活化程度的FXa的活化和纯化方法，其无需在生产过程中添加蛋白质活化剂。

背景技术

凝血因子Xa(FXa)是在整个凝血过程中通过其维生素K依赖性酶原凝血因子X(FX)的活化而生成的双链糖蛋白。体内FXa可以通过外部途径(即通过因子VIIa活化)或通过内在途径(即通过活化的凝血因子IX(FIXa)和VIII(FVIIIa))活化而产生。该分子经历Arg15-Ile16键的酶促断开，释放出52个氨基酸的活化肽。在存在其辅因子、凝血因子Va(FVa)、钙(Ca)离子和带负电荷的磷脂膜的情况下，FXa与它们结合在一起形成凝血酶原(FII)活化复合物(Toso等人2008)。

除了这些天然活化途径外，还有几种利用胰蛋白酶(Bajaj等，1973)或非人类活化剂的体外方法，其中所述非人类活化剂来源于山蝰毒液(Fujikawa等，1974)或真菌(Rüchel等，1983)、细菌(Imamura等，1997)或植物(Richter等，2002)。WO 2008/145989A1教导了两种技术，其通过将毒液、特别是山蝰毒液作为FX活化剂与钙离子联合起来使用以将FX活化为FXa。山蝰毒液含有物质RVV-V和RVV-X，它们直接激活因子V和FX。RVV-X是Zn2+依赖性丝氨酸蛋白酶。在第一种技术中，在含有25mM氯化钙和0.01U/ml(RVV-X)的溶液中温育FX。相比之下，在第二种技术中，RVV-X被固定在活化的

WO 2016/025601A1描述了一种FX活化方法，该方法不依赖毒液活化剂，而是利用与AEX树脂

因此，使用合成制备的药品级质量的活化剂得到高度重复性的转化率的活化方法将是该领域的重大突破。

FXa是在靠近凝血级联末端处生理地产生的，其表现为一种对于将凝血酶原(FII)转化为凝血酶(FIIa)所必须的蛋白酶，并因此该蛋白酶对于纤维蛋白原转化为纤维蛋白也是必须的，其作用在于伤口闭合及止血：在级联反应中位于FVIII下游，因而FXa原则上也可以在不存在FVIII或FVIII被抑制的情况下驱动凝血，因此可以认为具有“因子八旁路活性(factor eight bypassing activity)”。

基于其因子八旁路活性，FXa可以用于治疗A型血友病患者。血友病A是一种x染色体连环遗传性疾病，其由于凝血因子VIII的缺乏或功能异常而导致严重的出血。在血友病患者的治疗中，中和性同种抗体的进行性发展屡有报告(Kempton 2009)。这种高滴度抑制剂患者不能用凝血因子VIII(FVIII)替代来有效地治疗，原因在于所施加的FVIII被这些抑制剂中和了。患者会经受出血事件，可以使用活化的凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)进行治疗(Kempton 2009)。aPCC包括凝血因子(部分被活化)和其他血浆蛋白的复杂混合物(complex mixture)。另一种治疗方法是应用重组产生的活化凝血因子(rFVIIa)。rFVIIa能够直接将血小板表面的FX活化(Kempton 2009)。通过通常与免疫调节物质和/或旁路产品(by-passing product)进行组合来施加FVIII，可以在70％的接受常规和长期治疗的患者中实现免疫耐受诱导(ITI)(Kempton 2009)。

由于血友病A和血友病B患者的放大途径(amplification pathway)受损，因此血液凝固时间延长，并且失血量急剧增加。由于FXa在凝血中的核心作用，FXa可能会暂时恢复正常的凝血功能。此外，苦于所补充的凝血FVIII为中和抗体所抵消的血友病患者尤其容易接受FXa治疗。吉尔斯等(1988年)发现磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和FXa的组合具有FVIII旁路的潜力，但给药剂量对于净止血效果(net hemostatic outcome)至关重要。

鉴于近来常用新型口服抗凝剂(NOAC)或直接口服抗凝剂(DOAC)，FXa的另一潜在用途是逆转这些化合物。此类化合物的一个实例是利伐沙班。利伐沙班是FXa的直接可逆抑制剂，用于患有非瓣膜性房颤和静脉血栓栓塞的患者的抗凝治疗。接受利伐沙班等DOAC治疗的患者在手术的情况下必须接受系统性的DOAC逆转(Lindhoff-Last2017)。

发明内容

发明人惊讶地发现，衍生自血浆的FX在组合物中外在和内在活化剂(即FVIIa、FIXa和FVIIIa)的浓度低于检测限时可以在体外转化为FXa，而无需添加蛋白质活化剂，如RVV-X。因此消除了将这种蛋白质活化剂带入成品的风险。通过使含FX的组合物与合成的磷脂酰丝氨酸(PS)和钙接触来实现活化。

根据第一方面，本发明提供了一种将FX活化为FXa的方法，其中该方法在体外进行，并且包括以下步骤：

a.提供含有FX的组合物；和

b.使所述FX与PS特别是合成PS(sPS)以及钙接触以形成活化组合物；和

c.温育所述活化组合物以使得FX转化为FXa。

根据第一方面的所述活化方法尤其可以是FXa组合物的制备方法的一部分。因此，根据第二方面，本发明提供了一种制备FXa组合物的方法，该方法包括根据第一方面的将FX活化为FXa的方法，并且进一步包括至少一个纯化步骤。

此外，发明人已经发现，通过使用肝素亲和柱，特别是使用

a.在适合于结合FXa的条件下，特别是pH在5.8至9.0的范围内时，使含有FX和FXa的溶液与肝素亲和树脂、特别是

b.从所述溶液中分离出所述肝素亲和树脂；

c.可选地，洗涤所述肝素亲和树脂；以及

d.可选地，在适合洗脱的条件下从所述肝素亲和树脂中洗脱FXa。

根据第四方面，本发明涉及

最后，根据第五方面，本发明涉及根据第二方面的方法制备的FXa组合物。

附图说明

图1描绘了在非还原条件下的SDS-Page(考马斯蓝染色)和蛋白免疫印迹试验(用针对FXa的多克隆抗体探测；Abcam#111171)。

泳道1+10：分子量标记

泳道2：商购FX产品

泳道3：衍生自血浆的商购FXa标准品(Coachrom)–α-FXa和β-FXa的混合物。

泳道4：加载到Heparin

泳道5：穿过(通过)Heparin

泳道6-8：Heparin

泳道9：Heparin

凝血因子FXa的免疫反应条带被检测到在泳道4至9中为约50kDa(与泳道3中的α-FXa/β-FXa标准品比较)。尤其是描绘Heparin

图2描绘了通过本专利中所述方法纯化的FXa与市售活化凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)的比较，该浓缩物由衍生自血浆的FX制造，并用山蝰毒液(RVV)活化并纯化。该图显示了作为FXa浓度的函数的因子VIII抑制剂血浆中aPTT的降低[％]。与该市售FXa相比，通过本专利中所述方法纯化的FXa在该aPTT测试系统中显示出非常相似的剂量依赖性特性。

图3描绘了通过本专利中描述的方法纯化的FXa与由衍生自血浆的FX制造、用RVV活化并纯化的市售制成品的比较。该图将因子VIII抑制剂血浆中的TGA介导显示为FXa浓度的函数。与市售FXa相比，通过本专利中所述方法纯化的FXa在该TGA测试系统中显示出非常相似的剂量依赖性特性。

图4描述了与市售并许可的活化凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)产品相比，通过本专利中描述的方法制备的FXa在致血栓性不良反应安全性测试中的结果。与aPCC产品中剂量依赖性的致血栓潜力增大相反，纯FXa不会引起任何致血栓的问题。

本发明的第一方面是一种将FX活化为FXa的方法，其中该方法在体外进行，并包括以下步骤：

a.提供含有FX的组合物；和

b.使所述FX与(PS)和钙接触以形成活化组合物；和

c.温育所述活化组合物以使得FX转化为FXa。

将FX活化为FXa的方法也称为“活化方法”。该方法具体为体外方法。含有FX的组合物也称为FX组合物。如本文所用，“接触”是指将组分引入同一组合物中以允许组分彼此接触。为了使FX与PS和钙接触并形成活化组合物，可以使用任何已知的混合组分的方法。此外，可以以任何可能的顺序添加组分FX、合成的磷脂酰丝氨酸和钙。例如，可以将PS和钙混合成组合物，并且可以将该组合物加入到含有FX的组合物中以形成活化组合物。备选地，PS和钙都可以制备成溶液。在这方面，在一个实施方案中，首先将钙，然后将PS加入到含有FX的组合物中。根据一个备选实施方案，首先将PS，然后将钙加入到含有FX的组合物中。根据另一备选实施方案，将活化组合物的除FX组合物以外的所有组分预混合，并将FX组合物加入该混合物中。

如本文所用，术语“包含”除了其字面含义外，还包括“基本上由...组成”和“由...组成”这些表述。因此，该表述“包含”不仅指其中“包括”具体列出的要素的主题不包括其他要素的实施例，还指其中“包含”具体列出的要素的主题可以和/或确实包括其他要素的实施例。同样，表述“具有”应如同表述“包含”来理解，还包括表述“基本上由...组成”和“由...组成”。

根据一个实施方案，含有FX的组合物是制造中间体，特别是血液蛋白产品的制造过程的中间体。FX组合物优选是FX或FXa产品的制造过程的中间体。凝血因子的制造基于从血浆或重组产物来源开始的纯化工艺。因此，FX组合物优选为纯化中间体。根据一个实施例，FX衍生自血浆。根据一个实施方案，FX组合物是血浆分级分离产物。含有FX的组合物可以源自血浆的侧级份(side-fraction)，其可以用作活化工艺的起始物料。这种血浆分级分离的侧级份可以来自于如Hoffer等人(1995)或Roemisch and Pock(2012)所述的方法。经病毒灭活的侧级份特别有益于病原体安全性，并且溶剂/去污剂(S/D)处理可以被提出作为病毒灭活的一个实例。

如上所述，该方法不需要向活化组合物中加入蛋白酶或其他蛋白质。因此，根据活化方法的一个实施方案，不加入蛋白质活化剂。特别地，在活化组合物温育之前和期间，组合物中不添加蛋白质活化剂。更优选地，在温育之后也不添加蛋白质活化剂。如本文所用，“蛋白质活化剂”是任何肽，特别是可以活化FX的多肽。蛋白质活化剂优选是FX特异性丝氨酸蛋白酶，诸如FVIIa、FVIIIa和FIXa，或源于蛇毒的丝氨酸蛋白酶，如RVV-X。

通常，活化组合物中FX的起始浓度不限于特定范围。在活化方法中，由于FX会转化为FXa，所以它的浓度随着时间的变化而变化。因此，将各成分混合时的FX浓度称为“起始浓度”。为了有效地转化，FX的起始浓度优选在2至80IU/ml的范围内。活化组合物中的FX起始浓度可以是2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、12IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、IU/ml或40IU/ml、45IU/ml、50IU/ml、55IU/ml或60IU/ml。优选地，活化组合物中FX的起始浓度在2至40IU/ml的范围内。更优选地，活化组合物中FX的起始浓度在5至25IU/ml的范围内。

磷脂酰丝氨酸(缩写为Ptd-L-Ser或PS)是一种磷脂并且是细胞膜的成分之一。合成PS(sPS)是使用化学合成或生物技术在体外合成的PS。所使用的PS优选是合成PS。根据一个实施方案，活化组合物中PS的浓度在0.1至100mg/ml的范围内。根据另一实施方案，活化组合物中PS的浓度在0.1至50mg/ml的范围内。PS浓度可以是0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml、17mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml或40mg/ml或45mg/ml。此外，活化组合物中PS的浓度可以在0.2至10mg/ml的范围内。优选地，活化组合物中PS的浓度在0.2至1mg/ml的范围内。

根据一个实施方案，在活化方法中使用的钙为离子形式，特别是Ca

根据一个实施方案，活化组合物中钙离子的浓度在1至100mM的范围内。浓度可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7mM、10mM、12mM、15mM、17mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或80mM。根据一个实施方案，活化组合物中钙离子的浓度在2.5至50mM的范围内。根据一个实施方案，活化组合物中钙离子的浓度在5至40mM的范围内。根据一个优选的实施方案，活化组合物中钙离子的浓度在10至35mM的范围内。

根据将FX活化为FXa的方法的一个实施方案，活化组合物的pH在5.0至9.0的范围内。pH可以为5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。根据一个实施方案，活化组合物中的pH在6.0至8.0的范围内。优选地，pH在7.3至7.7的范围内。

根据将FX活化为FXa的方法的一个实施方案，在温育期间，活化组合物的温度在15至40℃的范围内。温度可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、15℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。优选地，温育温度在15至35℃的范围内。更优选地，温育温度约为室温。

在活化方法中，FX被转化为FXa。因此，活化组合物的组分随时间变化直至达到平衡或该方法结束。关于FX和FXa，术语“转化”和“活化”可互换使用。根据一个实施方案，活化方法在限定的时间即“温育时间”或“活化时间”之后结束。根据一个实施方案，活化方法尤其可以通过添加EDTA而结束。

根据第一方面的另一实施方案，温育时间在1至48小时的范围内。温育时间可以是1小时、2小时、3、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时或46小时。优选地，温育时间在4至20小时的范围内。

如利用根据第一方面的方法的实施例所示，从FX转化为FXa的产率为至少10％。如本文所用，从FX转化为FXa的产率或“FX转化率”显示了转化为FXa的FX分子的百分比，即，活化方法结束时的FXa分子数相对于活化方法开始时的FXa分子数的百分比。取决于条件，利用该活化方法可以达到高达100％的转化率。转化率可以为至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。根据第一方面的一个实施方案，它们的FX转化率在20％至100％的范围内。

根据一个实施方案，含有FX的组合物还含有FII。如实施例中所示，当活化组合物中存在FII时，其被转化为FIIa。这表明根据第一个方面确定的条件适合于利用FXa将FII(凝血酶原)转化为FIIa(凝血酶)。根据一个实施方案，活化组合物中FII的起始浓度在0.01至80IU/ml的范围内。活化组合物中的FII起始浓度可以为0.01IU/ml、0.05IU/ml、0.1IU/ml、0.5IU/ml、1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、10IU/ml、12IU/ml、15IU/ml、17IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、35IU/ml、40IU/ml、45IU/ml、50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml或75IU/ml。优选地，活化组合物中FII的起始浓度在0.01至40IU/ml的范围内。更优选地，活化组合物中FII的起始浓度在2至25IU/ml的范围内。根据另一实施方案，FII的起始浓度在0.01至2IU/ml的范围内。根据又一实施方案，FII的起始浓度在0.1至0.8IU/ml的范围内。

根据第一方面的一个实施方案，在含有FX的组合物中，FX的内在活化剂和外在活化剂的浓度低于检测限。特别地，在含有FX的组合物中FVII/FVIIa、FVIII/FVIIIa和FIX/FIXa的浓度低于如通过显色测定法确定的检测限。

含有FX的组合物可以是初始蛋白质混合物，该混合物包含pH值在6-8范围内的生物学上可接受的缓冲液中的1-80IU/ml(特别是1-60IU/ml)的FX和0.03-80IU/ml(特别是0.03-60IU/ml)的FII，且其总蛋白含量高于0至60mg/ml。总蛋白也可以在1至50mg/ml的范围内。总蛋白可以进一步在2至25mg/ml的范围内。这样的初始蛋白质混合物可以从亲和色谱法例如肝素亲和色谱法获得。本领域技术人员熟知生物学上可接受的缓冲剂，可以提出基于柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS或咪唑的缓冲液作为实例。可接受的缓冲液的一个示例是pH为7.5±0.2的含有20mM TRIS和150mM NaCl的缓冲液。具有上述总蛋白质、FX和FII含量的初始蛋白质混合物可以用作活化方法中的起始物料。

根据本发明的第一方面的另一实施方案，所述初始蛋白质混合物来源于血浆分级分离或生物技术方式的FX制造，其是通过重组或转基因表达和免疫亲和色谱法获得的。

用于生成初始蛋白质混合物的血浆级份优选是冷上清血浆(cryo-poor plasma)。

初始蛋白质混合物可以包含pH＝7.5且由20mM TRIS和150mM NaCl组成的缓冲液中的约40IU/ml的FX和0.01-80IU/ml的FII，且其总蛋白含量为1-60mg/ml。

可以通过对血液级份进行DEAE-Sepharose或肝素亲和色谱法和缓冲液置换来获得初始蛋白质混合物。

冷上清血浆可以用肝素稳定并使其吸附到阴离子交换树脂QAE-Sephadex上。洗涤后，用较高离子强度的缓冲液洗脱维生素K依赖性因子。例如，离子强度可以是1600-2200mosmol/kg。通过加入3IU肝素/ml使洗脱液中的维生素K依赖性因子稳定化。可以通过0.3％TnBP/1％聚山梨酯80温育使稳定化的洗脱液进一步接受S/D处理。如果这样，可以通过吸附在DEAE-Sepharose上并用260-310mosmol/kg的缓冲液洗涤来除去S/D试剂。随后可以以700-780mosmol/kg的缓冲液洗脱蛋白质。然后可以通过超滤/渗滤例如用10kDa的膜对洗脱液进行缓冲液置换。新缓冲液可以具有约330-400mosmol/kg。缓冲液置换后可浓缩至30IU IX因子/ml。

备选地，可以将冷上清血浆吸附在阴离子交换树脂(如DEAE-Sephadex A50)上，然后洗涤树脂。通过用约中性pH的2M氯化钠和15mM柠檬酸钠的高离子强度缓冲液洗脱，可以获得洗脱液。可以将洗脱液浓缩至380-420mosmol/kg。可以在DEAE树脂如DEAE-SepharoseFF上对(浓缩的)洗脱液进行阴离子交换纯化。洗涤后，利用360mM氯化钠、5mM柠檬酸钠和5mM磷酸氢二钠的缓冲液，可以获得DEAE洗脱液。可以通过0.3％TnBP/1％聚山梨酯80温育对DEAE洗脱液进行病毒灭活。之后，可以在Heparin-Sepharose CL 6B上对经S/D处理的洗脱液进行亲和色谱法。用pH值为7.0-8.0的由20mM柠檬酸钠组成的缓冲液洗涤后，通过用具有相同pH值的由250mM氯化钠、20mM柠檬酸钠组成的缓冲液进行洗脱，可以获得洗脱液。

为了获得初始蛋白质混合物，每一道纯化工艺之后都可以通过利用截止值为10kDa的膜的超滤/渗滤进行缓冲液置换，以置换为pH＝7.5的由20mM TRIS和150mM NaCl组成的缓冲液。

当从重组表达产物开始时，尤其可以使用免疫重组亲和色谱法来获得初始蛋白质混合物。具体而言，对FX和/或FXa具有特异性的抗体，例如：针对凝血因子X和Xa的

因此消除了将这些化合物带入成品的风险。可以在存在磷脂酰丝氨酸分散体(PS分散体)、特别是合成磷脂酰丝氨酸分散体的情况下以各种条件来活化初始蛋白质混合物。该PS分散体可以在生物学上可接受的缓冲液中以0.1-100mg/mL浓度的合成磷脂酰丝氨酸来制备，所述缓冲液包含5-100mM缓冲化合物(例如马来酸盐，咪唑，碳酸盐或TRIS)以及5-500mM NaCl且其pH范围为6.0-8.0。pH值为7.5±0.2且含有10-40mM TRIS和130-170mMNaCl的缓冲液特别适用并被用作反应缓冲液。PS可以通过在20-60℃高剪切混合(例如，使用

在第一方面的一个实施方案中，可以将初始蛋白质混合物与PS分散体和Ca离子溶液混合以获得包含1-25mg/ml总蛋白质、1-30IU/ml FX、0.003-0.3U/ml FII、0.1-2mg/mlPS和2.5-50mM Ca离子的混合物，并且可以将pH值调节到5.0-9.0的范围，特别是将pH值调节为7.4至7.6。可以将混合物在15-40℃温育1-48小时，特别是4-16小时，甚至更特别地是在15-35℃温育4-10小时，并缓慢搅拌，然后加入缓冲液，该缓冲液还含有螯合剂如EDTA或任何其他能够有效阻止Ca离子进一步将FX活化为FXa的螯合剂。例如，50mM EDTA足以有效阻止25mM Ca离子进一步将FX活化为FXa。温育并加入EDTA后，通过加入0.01-10％的表面活性剂(例如Triton X-100、脱氧胆酸钠或CHAPS使分散的PS溶解，从而获得澄清或几乎澄清的溶液，该溶液可以经由0.2–1.0μm的过滤器(特别是0.45μm的过滤器)进行过滤，以回收含FXa的中间体。在该方法的此阶段执行FXa分析。

如此制备的混合物，如测定描述中所定义，具有1-30IU/ml的FXa特异性活性，凝血酶水平<50IU/ml，基于用PS和Ca离子进行活化的FX含量，FXa产率约为25-100％，特别是30-75％。

在第一方面的一个实施方案中，将包含1-50mg/ml总蛋白、1-60IU/ml FX和0.03-60U/ml FII的初始蛋白质混合物用反应缓冲液稀释。反应缓冲液的量约为初始蛋白质混合物量的90％，并且另外混合的则为含有约75mM Ca离子的反应缓冲液。含有Ca离子的反应缓冲液的量与未稀释的初始蛋白质混合物的量相同。以连续操作(steering)方式小心地将PS分散体(其量为未稀释的初始蛋白质混合物的约10％)加入到上述混合物中，并且可以将pH调节至5.0-9.0的范围，特别是将pH调节为7.4-7.6。所获得的含有PS的混合物可以在15-40℃(特别是在15-35℃)温育1-48小时(特别是4-20小时)，同时温和搅拌，然后加入另外的含有螯合剂的反应缓冲液。可以如第一实施方案中所述那样进行如下步骤：停止将FX活化为FXa、溶解PS分散体并过滤以回收含有FXa的中间体。

如此制备的混合物具有1-60IU/ml的FXa特异性活性，小于10000IU/ml的FIIa和约9.9mg/ml的总蛋白质含量，基于用PS和Ca离子进行活化的FX含量，FXa的产率约为30-75％。

根据第二方面，本发明提供了一种生产FXa组合物的方法，该方法包括根据第一方面将FX活化为FXa的方法，并且进一步包括至少一个纯化步骤。

根据第二方面的一个实施方案，所述至少一个纯化步骤选自固定化金属亲和色谱法(IMAC)、阴离子交换色谱法(AEX)和亲和色谱法(AF)。AF具体可以是免疫亲和色谱法或肝素亲和色谱法。

根据第二方面的制备方法可以包括各种纯化步骤。用于蛋白质纯化步骤的合适方法为例如IMAC、AEX、阳离子交换色谱法(CEX)、AF特别是免疫亲和色谱法或肝素亲和色谱法、尺寸排阻色谱法(SEC)。所述方法可以任何组合或任意顺序来使用。在纯化步骤之间，可以包括例如用于缓冲液置换的步骤，比如渗滤或超滤/渗滤(UDF)。所述活化处理可以在纯化步骤之前、在两个纯化步骤之间或在纯化步骤之后(即，针对纯化产物)进行。

根据一个实施方案，生产工艺从根据第一方面的活化方法开始，然后是AEX。在第二方面的一个实施方案中，用pH在5.8-8.0范围内的生物学上可接受的平衡缓冲液预处理以阴离子交换树脂填充的柱，该树脂可以选自弱或强阴离子交换树脂，值得一提的例子是

随后，可以将阴离子交换洗脱液稀释成pH范围为5.8-9.0(优选为7.4±0.2)并且包含1-30mM(优选1-3mM)的咪唑和0.4-4M(优选0.5-1M)的NaCl的稀释的洗脱液。

然后，AEX之后可以进行IMAC。在第二方面的一个实施方案中，将来自阴离子交换柱的稀释的洗脱液加载到带有铜离子的固定化金属亲和色谱(IMAC)树脂上。在这些条件下，可以在IMAC流通级份中发现FXa，并可以从中获得FXa，其纯度为20-45U/mg蛋白质，而杂质如α2巨球蛋白、间α胰蛋白酶抑制剂、蛋白C或玻连蛋白等则与树脂结合。

可选地，在IMAC之后可以进行肝素亲和色谱法，特别是使用

在第二方面的一个备选实施方案中，AEX之后，利用FX/FXa特异性免疫亲和树脂进行免疫亲和色谱法。就这一点而言，使用pH值为7.0-8.0且电导率为1-250mS/cm并含有5-100mM TRIS、1-250mM NaCl、10-25mM Ca离子和0.005-1％的非离子表面活性剂的平衡缓冲液对(之前描述的)装有FX/FXa特异性免疫亲和树脂的柱子进行预处理。可接受的平衡缓冲液可以包含10-40mM TRIS、100-150mM NaCl、5-20mM Ca离子和0.01-0.2％的聚山梨酯，其pH值为7.4±0.2且电导率约为10至20mS/cm。在加载到免疫亲和柱上之前，对阴离子交换色谱法的洗脱液进行缓冲液置换，以置换为平衡缓冲液。在用平衡缓冲液彻底洗涤后，丢弃含有未结合杂质的流通/洗涤级份，并用pH为7.4±0.2和电导率为1-250mS/cm并含有5-100mMTRIS、1-250mM NaCl、5-40mM EDTA和0.005-1％聚山梨酯的洗脱缓冲液从柱中洗脱结合的FXa。特别地，这种洗脱缓冲液可以包含10-40mM TRIS、100-150mM NaCl、10-40mM EDTA和0.05％聚山梨酯，并且pH为7.4±0.2且电导率为19±2mS/cm。从FX/FXa特异性免疫亲和树脂洗脱的FXa的纯度超过95％。

可选地，免疫亲和色谱法之后可以进行肝素亲和色谱法，特别是使用

在本发明第二方面的一个实施方案中，用pH值为7.0-8.0且电导率为1-250mS/cm并含有5-100mM TRIS、1-250mM NaCl、10-25mM的Ca离子和0.005-1％的非离子表面活性剂的平衡缓冲液对(之前描述的)装有FX/FXa-特异性免疫亲和树脂的柱子进行预处理。可接受的平衡缓冲液可以包含10-40mM TRIS、100-150mM NaCl、5-20mM Ca离子和0.01-0.2％的聚山梨酯，并且其pH值为7.4±0.2，电导率约为10至25mS/cm。在加载到免疫亲和柱之前，对初始蛋白质混合物进行缓冲液置换，以置换为平衡缓冲液。用平衡缓冲液彻底洗涤后，丢弃含有未结合杂质的流通/洗涤级份，并用pH值为7.4±0.2且电导率为1-50mS/cm并含有5-100mM TRIS、1-250mM NaCl、5-40mM EDTA和0.005-1％的聚山梨酯的洗脱缓冲液从柱中洗脱结合的FX。特别地，这种洗脱缓冲液可以包含10-40mM TRIS、100-150mM NaCl、10-40mMEDTA和0.05％聚山梨酯，并且pH为7.4±0.2且电导率为19±2mS/cm。在进行缓冲液置换后，可以通过先前描述的活化方法之一将从免疫亲和柱洗脱的FX活化，从而获得FX和FXa的混合物，其比例取决于活化产率。

在第二方面的一个实施方案中，从免疫亲和树脂中洗脱FX，并用根据第一方面的方法活化，并用

根据第三方面，本发明涉及一种从含有FX和FXa的溶液中除去FX的方法，其包括以下步骤：

a.在适合于结合FXa的条件下，特别是pH在5.8至9.0的范围内，使含有FX和FXa的溶液与肝素亲和树脂(特别是

b.从所述溶液中分离出所述肝素亲和树脂；

c.可选地，洗涤所述肝素亲和树脂；以及

d.可选地，在适合洗脱的条件下从所述肝素亲和树脂中洗脱该FXa。

该方法可以与第一方面的活化方法组合使用。但是，该方法可以用于包含FXa和FX的任何组合物。该方法也可以用于从含有FX和FXa的溶液中除去FXa。因此，根据第三方面的备选实施例，本发明涉及一种用于从包含FX和FXa的溶液中去除FX的方法，该方法包括以下步骤：

a.在适合于结合FXa的条件下，特别是pH在5.8至9.0的范围内时，使含有FX和FXa的溶液与肝素亲和树脂(特别是

b.从所述溶液中分离出所述肝素亲和树脂；

c.收集含有FX的溶液；

d.可选地，从所述肝素亲和树脂上洗去残留量的FX；以及

e.可选地，使用在步骤c)和(可选)d)中获得的含FX溶液进行进一步处理。

如本文所用，“去除”或“除去”是指降低组合物中要被除去的组分的浓度。去除不限于但特别包括从组合物中将该组分完全消除的可能性。

接触步骤的pH在5.8至9.0的范围内。该pH可以是5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。优选地，pH在6.8至8.0的范围内。

使肝素与FX/FXa接触的组合物优选还包含0.0005-1％的非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的百分比可以是例如0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％。优选地，非离子表面活性剂可以是例如聚山梨酯。

该组合物优选包含1-100mM TRIS。TRIS可以例如以以下浓度存在：1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7mM、10mM、12mM、15mM、17mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM。优选地，非离子表面活性剂可以是例如聚山梨酯。

在这些条件下，FXa与树脂结合，而酶原FX和杂质(如F1.2，它是FII的活化片段)未结合而通过色谱柱。

为了从柱中洗脱FXa，可以使用更高的盐浓度。根据一个实施方案，洗脱缓冲液包含浓度为0.01至0.30M的盐。所述盐优选为NaCl。洗脱缓冲液可以包含以下浓度的NaCl：例如0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.07M、0.1M、0.12M、0.15M、0.17M、0.2M、0.22M、0.25M、0.27M或0.3M。

例如，将含有FXa和FX的组合物溶解在pH为5.8-9.0、特别是6.8-8.0的1-100mMTRIS缓冲液中。可以在

根据第三方面的方法也可以用于从FX组合物中除去FXa。根据第四方面，本发明涉及

根据第二方面的一个实施方案，制备方法包含根据第三方面定义的肝素亲和色谱法和根据第一方面的活化工艺。

根据第五方面，本发明提供了根据第二方面的方法制备的FXa组合物。

根据一个实施方案，在第五方面的FXa组合物中，FXa与FX的比率大于10:1。优选地，FXa与FX的比率大于20:1。更优选地，FXa与FX的比率大于50:1。根据第五方面的一个实施方案，所述组合物还包含FIIa。优选地，FIIa与FXa的比率在1:30至1:5000的范围内。

包含FXa的制剂的病原体安全性是通过在生产工艺中的适当位置处并入病原体去除或灭活步骤来实现的，所述步骤诸如溶剂/去污剂处理，纳米过滤，或本领域技术人员已知的其他手段，或它们的组合。通过本发明第三方面描述的方法之一获得的FXa中间体通过超滤/渗滤(UDF)利用配制缓冲液来配制，该配方缓冲液基于5-100mM的生物学和药学上可接受的缓冲物质例如组氨酸、柠檬酸盐、柠檬酸盐-磷酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐或其他，10-300mM NaCl或其他盐，最后还有0.001-0.5％

最终，用选自糖、糖醇、多元醇、氨基酸、聚合物或其他生物相容性化合物中的一种或多种赋形剂和稳定剂，如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖醇、甘露醇、甘氨酸、L-精氨酸或PVP(聚乙烯吡咯烷酮，例如

FXa组合物的pH范围优选在6.0-7.5的范围内。配制的FXa组合物冷冻保存，或可在冻干前达到FXa最终浓度0.05-10IU/ml。表1列出了这种配方的示例。

特别地，可以配制第五方面的FXa组合物，并最终冻干以固定在载体材料之中或之上使用，其可用于局部治疗出血性疾病或用于局部引发凝血。因此，根据第五方面的一个实施方案，FXa组合物是冻干的组合物。根据一个实施方案，FXa组合物在重构(reconstitution)后稳定至少48小时。备选地，将FXa组合物冷冻储存。

根据第五方面的一个实施方案，FXa组合物用于治疗出血性疾病。出血性疾病可以是A型血友病、B型血友病、血管性血友病(von Willebrand disease)、具有抑制剂的先天性血友病A或具有针对FVIII的抑制性自身抗体的获得性血友病A、具有抑制剂的先天性血友病B或具有针对FIX的抑制性自身抗体的获得性血友病B、创伤失血、FVII缺乏症、FV缺乏症、FX缺乏症、FXI缺乏症、FXIII缺乏症、纤维蛋白原缺乏症、凝血酶原缺乏症、稀释性凝血障碍、血小板减少症、高危手术失血、脑内出血、具有针对血管性血友病因子抑制剂的血管性血友病(von Willebrand disease)，或它们的组合。

根据第五方面的一个实施方案，出血性疾病是由新型口服抗凝剂(NOAC)或直接口服抗凝剂(DOAC)的施用所导致。

本发明使得能够以经济的和避免病原体的工艺来生产FXa，以管控在接受口服抗凝剂的患者的手术或受伤期间的NOAC-/DOAC引发的出血性事件。由于FXa在对先天性和后天获得性出血缺陷的凝血治疗中的作用，也可以用包含FXa和FIIa的混合物的制剂(其也可以通过本发明的方法获得)来管控由属于直接凝血酶抑制剂类的NOAC/DOAC引发的出血。

通常优选使用生物学上可接受的缓冲剂，如基于柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS、咪唑及更多的缓冲剂。

为了证实重构的本发明FXa制剂的稳定性和活性，将冻干的组合物重构(reconstitute)至其初始体积，并进行分析测试，特别是测定FVIII-抑制剂血浆中的FXa特异性活性和凝血酶生成(TGA)。FXa特异性活性测试表明冻干后保留了超过75％的初始活性，TGA测试则表明保留了超过85％的初始活性。结果列于表2。

将所选择的配方1、2和6重构，并在室温特别是20-25℃下以及在2-8℃下以液体形式储存48小时，以确定液体储存后的残留活性。在室温下液态储存48小时后，FXa特异性活性测试表明保留了重构制剂的超过90％的在液态储存之前的活性，TGA测试则表明保留了超过85％的活性。结果总结在表3中。

根据一个实施方案，所述用途包括通过肠胃外施用方法诸如静脉内注射或输注来施用FXa组合物。通过本发明方法获得的组合物可以静脉内施用，但是也可以局部施用及表面施用。

在使用直接口服抗凝剂治疗的患者中，固定化且局部施用的Fxa，即，非静脉内施用的Fxa，或含有FXa和FIIa的混合物可以使得正常凝血功能的恢复局限于治疗部位。由于FXa和FIIa是直接口服抗凝剂的靶标分子，因此局部施用的固定化FIIa和/或FXa将清除过量的抑制剂并恢复内部FXa和FIIa的局部作用。此外，固定化的FIIa会在受伤部位引发血液凝结并形成原发性血凝块。可以将含有FXa的组合物固定在经涂覆或浸泡的海绵、贴片、薄膜、绷带或其他常用的载体材料(如粉末或颗粒)之上或之中，以局部施用。

根据第五方面的一个实施方案，所述用途包括经由经涂覆或浸泡的海绵、贴片、薄膜、绷带或其他常用的载体材料，如粉末或颗粒，来局部施用所述组合物。对于局部施用，止血工具如用本发明的组合物浸泡或在其上沉积有该组合物的薄膜、贴片、绷带或海绵适用于局部止血。所述止血工具还适用于在用DOAC进行抗凝治疗的患者的局部止血，特别是如果附加地将凝血酶沉积在所述工具之上或之中。

如通过aPTT测定、凝血酶生成测定(TGA)以及用于确定Wessler测试(Wessler等人1959)结果的相关动物研究所证明的，通过本发明方法获得的组合物具有较低的致血栓可能性，且如表4所示。

对获得的产物和中间体进行分析测试，即FX ELISA、TGA(凝血酶生成测定)、Fxa特异性活性测定和FIIa特异性显色测定。尽管用于测定FXa和FIIa的显色底物对每种蛋白酶都极具特异性，但并非100％，特别是在高的蛋白酶浓度下，会发生少部分的其他潜在靶标的裂解。为了确定FXa/FIIa的特异性活性，使用FXa的高度特异性抑制剂(即：利伐沙班)和FIIa的高度特异性抑制剂(即：达比加群)来确定相应蛋白酶的可抑制量，其代表蛋白酶特异性活性。计算活化效力，并表示为从添加到反应中的总FX所产生的FXa的百分比。

将预稀释的样品(稀释缓冲液：20mM TRIS，130mM NaCl，0.5％人血清白蛋白(HSA)；pH 7.4)与FVIII抑制剂血浆(Technoclone；物料编号5159008)以1份预稀释的样品+4份抑制剂血浆的比例混合，并立即进行测量。使用Technothrombin TGA试剂盒(Technoclone；Technothrombin RC high试剂盒；物料编号：5006010)，根据制造商的说明进行测量。读出的参数是峰值凝血酶浓度(PTC)，单位为nM。

使用FXa特异性活性测定法在存在交叉反应蛋白的情况下测量FXa。用稀释缓冲液(50mM TRIS，0.2％BSA(牛血清白蛋白)；pH 8.4)稀释含有FXa的样品和标准品。在添加10mM利伐沙班和无添加的情况下，在温控的酶标仪(micro plate reader)(405nm)上，测量5分钟内稀释样品中显色底物CS11(32)

使用FIIa特异性活性测定法在存在相当高的浓度的蛋白质的情况下测量FIIa，其也可能会使凝血酶显色底物裂解，尽管速率相对较低。用稀释缓冲液(50mM TRIS，100mMNaCl，1％PEG 6000；pH 8.3)稀释含凝血酶的样品和标准品。在添加和不添加10μM达比加群的情况下(在37℃下温育30分钟)，在温控的酶标仪(405nm)上，测量5分钟内稀释样品中显色底物CS01(38)

根据制造商的说明，使用

根据ACL仪器制造商的说明，使用Instrumentation Laboratories(IL)测定对未活化混合物中的FII和FX进行了测量。

根据制造商的说明，使用

根据制造商对

在非还原条件下根据制造商对

初始蛋白质混合物包含在pH＝7.5且由20mM TRIS和150mM NaCl组成的缓冲液中的约40IU/ml FX和0.01-80IU/ml FII，且其总蛋白质含量为1-60mg/ml。

从来自凝血因子纯化的DEAE琼脂糖或肝素亲和色谱侧级份并利用超滤/渗滤的缓冲液置换来获得初始蛋白质混合物。

具体地，使经肝素稳定化的冷上清血浆吸附到阴离子交换树脂QAE-Sephadex上，接着洗涤该树脂。然后用离子强度提高至1600-2200mosmol/kg的缓冲液洗脱维生素K依赖性因子，并通过添加3IU肝素/ml使其稳定化。通过0.3％TnBP/1％聚山梨酯80温育对稳定化的洗脱液进行S/D处理，并通过在DEAE-Sepharose上吸附并用260-310mosmol/kg的缓冲液洗涤以除去S/D试剂。用700-780mosmol/kg的缓冲液洗脱蛋白质。最后，使用超滤/渗滤在10kDa膜上利用约330-400mosmol/kg的缓冲液进行缓冲液置换并浓缩至30IU因子IX/ml，获得了初始蛋白质混合物。

备选地，使冷上清血浆吸附至DEAE-Sephadex A50，接着洗涤该树脂。通过用约中性pH的2M氯化钠和15mM柠檬酸钠的高离子强度缓冲液洗脱获得洗脱液，浓缩至380-420mosmol/kg，并使用DEAE-Sepharose FF对浓缩的洗脱液进行阴离子交换纯化。洗涤后，用360mM氯化钠、5mM柠檬酸钠和5mM磷酸氢二钠的缓冲液获得DEAE-洗脱液，并通过0.3％TnBP/1％聚山梨酯80温育对DEAE-洗脱液进行病毒灭活。之后，在肝素-Sepharose CL 6B上对经S/D处理的洗脱液进行亲和色谱法。在用pH 7.0-8.0的由20mM柠檬酸钠组成的缓冲液洗涤后，用具有相同pH值的由250mM氯化钠、20mM柠檬酸钠组成的缓冲液洗脱，得到洗脱液。

为了获得初始蛋白质混合物，在每个纯化工艺之后，利用超滤/渗滤使用截止值为10kDa的膜进行缓冲液置换，以将其置换为pH＝7.5的由20mM TRIS和150mM NaCl组成的缓冲液。

对FX和FXa特异性的抗体被固定到活化的色谱树脂上，如

将40mg合成磷脂酰丝氨酸(SPS)与10ml反应缓冲液(pH＝7.5的20mM TRIS和150mMNaCl)混合，在50℃用

将包含2mg/ml总蛋白、约40IU/ml FX和约0.5U/ml FII的55ml初始蛋白质混合物与27.5ml SPS分散体、27.5ml反应缓冲液和含有75mM钙离子的55ml反应缓冲液进行混合。将pH为7.5的混合物在室温下温育6小时并温和搅拌，然后加入55ml具有200mM EDTA的反应缓冲液。通过添加1.5mM Triton X-100使分散的PS溶解，获得的澄清溶液经由0.45μm PES膜滤器过滤，以回收含FXa的中间体。

如此制备的混合物，如测定说明中所定义，具有约9.6IU/ml的FXa特异性活性，凝血酶水平低于50IU/ml，基于利用PS和钙离子进行活化的FX含量，FXa产率约为69％。

将含有40mg/ml总蛋白、约60IU/ml FX和约60U/ml FII的100ml初始蛋白质混合物与90ml反应缓冲液和100ml含有75mM Ca离子的反应缓冲液混合。以连续操作方式逐滴加入10ml PS分散体。将该pH为7.0的混合物在22℃下温育16小时同时温和搅拌，然后加入100ml具有200mM EDTA的反应缓冲液。通过添加1.5mM Triton X-100使分散的PS溶解，获得的澄清溶液通过0.45μm PES膜滤器过滤，以回收含FXa的中间体。

这样制得的混合物的FXa特异性活性为8.2IU/ml，FIIa特异性活性为619IU/ml，总蛋白质含量为9.9mg/ml。基于利用PS和Ca离子进行活化的FX含量，FXa的收率为33％。

初始蛋白质混合物用反应缓冲液稀释，与PS分散体和Ca离子混合，以获得含有40IU/ml FX、0.33mg/ml PS和25mM Ca离子的溶液。将该混合物在15℃温育10小时同时温和搅拌，然后用50mM EDTA终止反应。通过添加1.5mM Triton X-100使分散的PS溶解，获得的澄清溶液通过0.45μm PES膜滤器过滤，以回收含FXa的中间体。

如此制备的混合物FXa特异性活性为4.1IU/ml，FIIa特异性活性为3.1IU/ml，总蛋白质含量为0.4mg/ml，基于利用PS和钙离子进行活化的FX含量，FXa产率为41％。

取出示例3中在温育之前的部分反应混合物，并用于在33℃温育10小时。该活化处理的结果是：2.8IU/mL FXa，16.4IU/mL FIIa，0.6mg/mL的蛋白质含量，以及基于利用PS和Ca离子进行活化的FX含量，FX/FXa转化产率为27％。

用pH值为6.3且电导率为1.0mS/cm并含有10mM咪唑的平衡缓冲液对填装有强离子交换树脂

阴离子交换洗脱液用pH值7.4且含有20mM TRIS和4mM咪唑的缓冲液稀释，以将NaCl的含量从1M降至0.5M，并将咪唑浓度调节为2mM。将该稀释的洗脱液加载至带有铜离子的固定化金属亲和色谱(IMAC)树脂，存在于IMAC流通级份中的FXa纯度为43U/mg蛋白。

对IMAC流通级份的缓冲液进行置换以获得溶解在pH值为7.4且电导率为1.6mS/cm的20mM TRIS缓冲液中的FXa，并在

用pH值为7.4且电导率为16.8mS/cm并含有20mM TRIS、130mM NaCl、10mM Ca离子和0.05％聚山梨酯80的平衡缓冲液预处理含有FX/FXa特异性免疫亲和树脂的柱子，该树脂具有共价结合的抗凝血因子X和Xa的

FXa中间体通过超滤/渗滤(UDF)利用基础配方缓冲液(basic formulationbuffer)加以调配，该缓冲液包含10mM组氨酸，100mM NaCl和0.005％

配制了若干种纯化的FXa制剂，以用表1所示的缓冲液冻干，并装在小瓶中。使小瓶中的FXa制剂经受冻干循环，以确保通过卡尔费休(Karl Fischer 1935)法测定的残留水含量小于1.5％。

表1

表2

表3

表4：Wessle致血栓安全性测试结果

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