在反义链的5’末端具有乙烯基膦酸酯的siRNA

摘要

本发明涉及用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，其包含至少一个双链体区域，该区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从所述要抑制的靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补。所述核酸的第一链具有末端5’(E)‑乙烯基膦酸酯核苷酸，其通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸。

说明书

发明领域

本发明涉及在反义链的5’末端具有乙烯基膦酸酯的siRNA。它进一步涉及这样的siRNA用于治疗疾病、病症和综合征的治疗用途。

背景

能够互补结合表达的mRNA的双链RNA（dsRNA）已显示能够通过一种已被称为RNA干扰（RNAi）的机制阻断基因表达(Fire

但是，在体内维持核酸（诸如RNA）的稳定性和活性已经被证实对于开发用于治疗用途的核酸分子的领域中的技术人员而言是挑战性的，特别是因为降解核酸并限制它们的活性的细胞代谢酶。

siRNA介导的基因沉默要求装载进RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的siRNA。已知在siRNA上的5’磷酸酯对于有效的RISC装载而言是关键性的。酶诸如磷酸酶会除去siRNA的5’磷酸酯从而产生去磷酸化的siRNA，其更低效率地掺入RISC且因此具有降低的沉默活性。

因而，在体内提高寡核苷酸（特别是双链siRNA）的稳定性和活性的方式变得越来越重要。在本发明中，已经意外地发现，根据本发明的核酸具有增加的活性。

发明内容

本发明提供了一种用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，其包含至少一个双链体区域，该区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从所述要抑制的靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，其中所述第一链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，

其特征在于，所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸。

在本发明的核酸中，所述第一链可以包括超过1个磷酸二酯键。

在本发明的核酸中，所述第一链可以包含在至少末端三个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

在本发明的核酸中，所述第一链可以包含在至少末端四个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

在本发明的核酸中，所述第一链可以包括至少一个硫代磷酸酯(ps)键。

在本发明的核酸中，所述第一链可以进一步包含在末端两个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键或在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。所述第一链中的其它核苷酸之间的键可以是磷酸二酯键。

在本发明的核酸中，所述第一链可以包括超过1个硫代磷酸酯键。

在本发明的核酸中，所述第二链可以包含在末端两个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键或在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在本发明的核酸中，所述第二链可以包含在末端两个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键或在末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在本发明的核酸中，所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸可以是RNA核苷酸。

优选地，所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是RNA核苷酸，更优选(vp)-U。

在本发明的核酸中，所述核酸的第一链可以具有在15-30个核苷酸的范围内的长度。优选地，所述核酸的第一链具有在19-25个核苷酸的范围内的长度。

在本发明的核酸中，所述核酸的第二链可以具有在15-30个核苷酸的范围内的长度。优选地，所述核酸的第二链具有在19-25个核苷酸的范围内的长度。

本发明的核酸可以在两个末端具有平头末端。

本发明进一步提供了一种用于抑制细胞中靶基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含如本文任何地方所定义的核酸。

在本发明的缀合物中，所述核酸的第二链可以缀合至所述配体部分。

在本发明的缀合物中，所述配体部分可以包含一个或多个GalNAc配体及其衍生物，诸如包含在所述核酸的第二链的5’末端处的GalNAc部分。

在本发明的缀合物中，所述配体部分可以包含接头部分和靶向配体，且其中所述接头部分将所述靶向配体连接至所述核酸部分。

本发明进一步提供了一种用于抑制细胞中TMPRSS6基因的表达的缀合物。

本发明进一步提供了一种组合物，其包含如本文任何地方所定义的核酸和生理上可接受的赋形剂。

本发明进一步提供了一种组合物，其包含如本文任何地方所定义的缀合物和生理上可接受的赋形剂。

本发明进一步提供了用于治疗疾病或病症的如本文任何地方所定义的核酸。

本发明进一步提供了用于治疗疾病或病症的如本文任何地方所定义的缀合物。

本发明进一步提供了用于治疗疾病或病症的如本文任何地方所定义的组合物。

发明的详细描述

本发明涉及双链的并针对靶基因的表达的RNA转录物的核酸及其组合物。这些核酸可用于治疗需要降低靶基因产物的表达的多种疾病和病症。

本发明的第一方面涉及一种用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，其包含至少一个双链体区域，该区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从所述要抑制的靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，其中所述第一链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，其中所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸。

末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是其中在5’末端处的天然磷酸酯基团已经被(E)-乙烯基膦酸酯替换的核苷酸。5’-(E)-乙烯基膦酸酯是在核苷酸链的5’末端处的磷酸酯，其中桥连5’-氧原子被甲炔基(-CH=)基团替换：

5’-(E)-乙烯基膦酸酯是5’磷酸酯模拟物。生物学模拟物是一种分子，其能够实现与被模拟的原始分子相同的功能并且在结构上非常相似。在本发明的上下文中，5’-(E)-乙烯基膦酸酯模拟正常的5’磷酸酯的功能，例如实现有效的RISC装载。此外，由于其结构略有变化，因此5’-(E)-乙烯基膦酸酯能够通过保护其免受酶（如磷酸酶）的去磷酸化作用来稳定5’末端核苷酸。

本发明的发明人已经令人惊讶地发现，与具有末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸（其中所述末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过硫代磷酸酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸）的siRNA相比，具有末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸（其中所述末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸）的siRNA具有更好的基因沉默活性，即导致靶mRNA表达的降低。还已经与以下siRNA对比了活性：不包含末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸且在第一链的5’末端处不包含硫代磷酸酯键(即在5’末端处包含磷酸二酯键)的siRNA，和不包含末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸但在第一链的5’末端处具有硫代磷酸酯键的siRNA (参见图1-4、9-11和14)。

核酸是指包含两条包含核苷酸的链的核酸，其能够干扰基因表达。抑制可能是完全的或部分的，并以靶向方式导致基因表达的下调。核酸包含两条单独的多核苷酸链；第一链，其也可以是指导链或反义链；和第二链，其也可以是乘客链或有义链。第一链和第二链可以是自互补的同一多核苷酸分子的一部分，该多核苷酸分子“折叠”以形成双链分子。核酸可以是siRNA分子。

核酸可以包含核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物。核酸可以进一步包含由第一链的全部或部分（本领域中也称为指导链或反义链）和第二链的全部或部分（本领域中也称为乘客链或有义链）形成的双链核酸部分或双链体区域。双链体区域定义为以在第一链和第二链之间形成的第一个碱基对开始，并以在第一链和第二链之间形成的最后一个碱基对结束，包括第一个碱基对和最后一个碱基对。

在本发明中，5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸可以是5’-(E)-乙烯基膦酸酯RNA核苷酸。

双链体区域是指在两个互补的或基本上互补的寡核苷酸中的区域，其通过沃森-克里克碱基配对或允许在互补的或基本上互补的寡核苷酸链之间形成双链体的任何其它方式彼此形成碱基对。进一步，在双链体区域内，不需要100％的互补性；在双链体区域内允许实质的互补性。实质的互补性表示这样的链之间的互补性：使得它们能够在生物条件下退火。用于根据经验确定两条链是否能够在生物条件下退火的技术是本领域众所周知的。可替换地，可以合成两条链并在生物条件下一起添加以确定它们是否彼此退火。

形成至少一个双链体区域的第一链和第二链的部分可以是完全互补的并且彼此至少部分互补。

取决于核酸的长度，不一定需要在第一链和第二链之间的碱基互补性方面的完美匹配。但是，第一链和第二链必须能够在生理条件下杂交。

由于在任一链中都没有核苷酸错配或额外的/缺失的核苷酸，至少一个双链体区域中的第一链和第二链之间的互补性可以是完美的。可替换地，互补性可能不是完美的。互补性可以是至少70%、75%、80%、85%、90%或95%。

第一链和第二链可以各自包含互补性区域，其包含至少15个、优选地至少16个、更优选地至少17个、更优选地至少18个和最优选地至少19个邻接核苷酸。

核酸涉及在第一链的全部或部分与靶核酸的部分之间形成双链体区域。靶核酸的与第一链形成双链体区域的部分是靶核酸序列或简称靶序列，其定义为以在第一链和靶序列之间形成的第一个碱基对开始并且以在第一链和靶序列之间形成的最后一个碱基对结束，包括第一个碱基对和最后一个碱基对。在第一链和第二链之间形成的双链体区域不需要与在第一链和靶序列之间形成的双链体区域相同。也就是说，第二链可以具有与靶序列不同的序列。但是，至少在生理条件下第一链必须能够与第二链和靶序列两者形成双链体结构。

第一链和靶序列之间的互补性可以是完美的（在每一种核酸中都没有核苷酸错配或额外的/缺失的核苷酸）。

第一链和靶序列之间的互补性可能不是完美的。互补性可以为约70%至约100%。更具体地，互补性可以是至少70%、80%、85%、90%或95%或中间值。

第一链和靶序列的互补序列之间的同一性可以为约75%至约100%。更具体地，互补性可以是至少75%、80%、85%、90%或95%或中间值，只要核酸能够降低或抑制靶基因的表达，优选地通过RNAi。

第一链和靶序列之间具有小于100%互补性的核酸可能能够将靶基因的表达降低至与第一链和靶序列之间具有完美互补性的核酸相同的水平。可替换地，它可能能够将靶基因的表达降低至通过具有完美互补性的核酸实现的表达水平的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的水平。

在另一个方面，与在没有抑制剂（其可以是核酸）存在下观察到的水平相比，如本文中所述的核酸可以将细胞中靶基因的表达降低至少10%。任何前述方面的所有优选特征也适用于这个方面。具体地，与在没有抑制剂（其可以是核酸）存在下观察到的水平相比，细胞中靶基因的表达可以降低至90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%以及中间值。

核酸可以包含第一链和第二链，其各自的长度为19-25个核苷酸。第一链和第二链可以具有相同的长度或不同的长度。

在一个实施方案中，所述核酸可以包含各自长度为15-30、15-25、17-25、17-23、23-24、19-21、21-23个核苷酸的第一链和第二链。优选地，核酸可以包含各自长度为19-21个核苷酸的第一链和第二链。第一链和第二链可以具有在这些范围内的相同的长度或不同的长度。

在一个实施方案中，所述核酸可以包含各自长度为19个核苷酸的第一链和第二链。

在另一个实施方案中，所述核酸可以包含各自长度为20个核苷酸的第一链和第二链。

在另一个实施方案中，所述核酸可以包含各自长度为21个核苷酸的第一链和第二链。

核酸可以包含由19-25个核苷酸碱基对组成的双链体区域。双链体区域可以由17、18、19、20、21、22、23、24或25个可能连续的碱基对组成。

第一链的末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸可以是任何核苷酸(即A、G、C或U)。优选地，它可以是U。

核酸可以在两个末端具有平头末端。

在核酸的包含第一链的5’末端的末端处，核酸可以：a)是平头末端，或b)具有至少一个核苷酸的3’突出端。

在本发明的核酸中，所述末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸。所述第一链可以包含超过一个磷酸二酯核苷酸(即超过一个核苷酸间磷酸二酯键)。

在一个实施方案中，所述第一链包含在至少末端三个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。在另一个实施方案中，所述第一链包含在至少末端四个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

在一个实施方案中，所述第一链包含式(Ia)：

(vp)-N(po)[N(po)]

其中‘(vp)’是5’-(E)-乙烯基膦酸酯，‘N’是核苷酸，‘po’是磷酸二酯键，且n是从1至(第一链中核苷酸的总数- 2)，优选地其中n是从1至(第一链中核苷酸的总数-3)，更优选地其中n是从1至(第一链中核苷酸的总数-4)。

因而，在一个实施方案中，其中核酸包含长度为19个核苷酸的第一链，n是从1至(19-2)，优选地(19-3)，更优选地(19-4)，即n是从1至17，优选1至16，更优选1至15。

因而，在另一个实施方案中，其中核酸包含长度为20个核苷酸的第一链，n是从1至(20-2)，优选地(20-3)，更优选地(20-4)，即n是从1至18，优选1至17，更优选1至16。

因而，在另一个实施方案中，其中核酸包含长度为21个核苷酸的第一链，n是从1至(21-2)，优选地(21-3)，更优选地(21-4)，即n是从1至19，优选1至18，更优选1至17。

在一个实施方案中，所述第一链包含式(Ib)：

(vp)-N(po)[N(po)]

其中‘(vp)’是5’-(E)-乙烯基膦酸酯，‘N’独立地是任何核苷酸，诸如天然的或经修饰的核糖核苷酸，‘po’是磷酸二酯键，n是至少1，n+m+1是链中核苷酸的总数，且x独立地是2个核苷酸之间的任何键，诸如磷酸二酯键、硫代磷酸酯键和二硫代磷酸酯键。

本发明的核酸还可以在第一链中包含至少一个硫代磷酸酯键。

在本领域中通常认为硫代磷酸酯必须是在siRNA链的末端以保护siRNA免于降解，特别是如果将siRNA用于治疗时。发明人已经令人惊讶地发现，当在链的5’末端存在5’乙烯基膦酸酯时，siRNA的活性比在链的5’末端没有硫代磷酸酯时更好。这是令人惊讶的，因为在本领域中通常认为这样的磷酸酯（phosphorotiate）键会增加稳定性。因此可能用5’乙烯基膦酸酯代替在反义链的5’处的硫代磷酸酯键并从而增加活性。这是合乎需要的，因为与磷酸二酯键相反，硫代磷酸酯键是立体中心。

本发明的核酸可以在第一链中包含超过1个硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，所述第一链包含在末端两个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，所述第一链包含在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键(即限定两个硫代磷酸酯键)。在这些实施方案中，所述第一链中的其它核苷酸之间的键优选地是磷酸二酯键。

本发明的核酸的第二链还可以包含在末端2个、3个或4个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，所述第二链包含在末端2个、3个或4个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，所述第二链包含在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键和在末端三个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

在一个实施方案中，所述第二链包含在末端四个3’核苷酸之间和在末端四个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，所述第二链包含在末端三个3’核苷酸之间和在末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，所述第一链包含在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，且所述第二链包含在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在该实施方案中，所述第一链和第二链中的其它核苷酸之间的键优选地是磷酸二酯键。

在一个实施方案中，所述第一链包含在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，且所述第二链包含在末端四个3’核苷酸之间和在末端四个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在该实施方案中，所述第一链和第二链中的其它核苷酸之间的键优选地是磷酸二酯键。

在一个实施方案中，所述第一链包含在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，且所述第二链包含在末端三个3’核苷酸之间和在末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在该实施方案中，所述第一链和第二链中的其它核苷酸之间的键优选地是磷酸二酯键。

在一个实施方案中，所述核酸：

(i) 具有在第一链的5’末端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；

(ii) 具有在第一链和第二链上的末端三个3’核苷酸之间和在第二链上的末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和

(iii) 第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键是磷酸二酯键。

在一个实施方案中，所述核酸是通过RNAi抑制靶基因的表达的siRNA。

未修饰的多核苷酸，特别是核糖核苷酸，可能易于被细胞核酸酶降解，且因此，修饰/经修饰的核苷酸可以被包括在本发明的核酸中。

本文中对本发明的核酸的修饰的提及是除了第一链的5’末端核苷酸上的(E)-乙烯基膦酸酯之外的。

本发明的核酸的修饰通常提供克服潜在限制的有力工具，所述潜在限制包括、但不限于天然RNA分子固有的体外和体内稳定性和生物利用度。可以通过化学修饰来修饰根据本发明的核酸。经修饰的核酸还可以使在人类中诱导干扰素活性的可能性最小化。修饰可以进一步增强核酸向靶细胞的功能递送。本发明的经修饰的核酸可以包含第一链或第二链中的任一条或两条的一种或多种化学修饰的核糖核苷酸。核糖核苷酸可以包含碱基、糖或磷酸酯部分的化学修饰。通过用核苷酸或碱基的类似物置换或插入，可以修饰核糖核酸。

可以修饰本发明的核酸的第二链和/或第一链上的一个或多个核苷酸。经修饰的核苷酸可以包括糖基、特别是2’-羟基(OH)基团的修饰。2’-OH可以被许多不同的“氧基”或“脱氧”取代基修饰或替换。

“氧基”-2’羟基修饰的例子包括：烷氧基或芳氧基(OR，例如，R═H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH

“脱氧”修饰包括：氢卤素；氨基(例如，NH

在本发明的核酸中，第一链可以被修饰以形成经修饰的核苷酸。具体地，第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰的核苷酸。在本发明的核酸中，修饰可以是在核糖的2’-OH基团处的修饰，其任选地选自2'-O-甲基(2’-OMe)或2’-F修饰。

在本发明的核酸中，从5’末端开始编号，第一链的一个或多个或所有奇数核苷酸可以是在核糖的2'-OH基团处具有第一修饰的经修饰的核苷酸，并且也从5’末端开始编号，第一链的一个或多个或所有偶数核苷酸可以是在核糖的2’-OH基团处具有第二修饰的不同地修饰的核苷酸，其中第一个和第二修饰是不同的。优选地，第一修饰是2’-OMe且第二修饰是2’-F，或反之亦然。

优选地，在本发明的核酸中，在第一链中不存在2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸。

本发明的核酸可以具有1个经修饰的核苷酸，或本发明的核酸可以具有约2-4个经修饰的核苷酸，或者核酸可以具有约4-6个经修饰的核苷酸、约6-8个经修饰的核苷酸、约8-10个经修饰的核苷酸、约10-12个经修饰的核苷酸、约12-14个经修饰的核苷酸、约14-16个经修饰的核苷酸、约16-18个经修饰的核苷酸、约18-20个经修饰的核苷酸、约20-22个经修饰的核苷酸、约22-24个经修饰的核苷酸、24-26个经修饰的核苷酸或约26-28个经修饰的核苷酸。在每种情况下，与没有所述经修饰的核苷酸的相同核酸相比，包含所述经修饰的核苷酸的核酸保留其活性的至少50%。与没有所述经修饰的核苷酸的相同核酸相比，所述核酸可以保留其活性的55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%或中间值，或可以具有没有所述经修饰的核苷酸的相同核苷酸的超过100%的活性。

经修饰的核苷酸可以是嘌呤或嘧啶。至少一半的嘌呤可以被修饰。至少一半的嘧啶可以被修饰。可以修饰所有嘌呤。可以修饰所有嘧啶。经修饰的核苷酸选自2'-OMe修饰的核苷酸、2’修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸或2'-烷基-修饰的核苷酸。

核酸可以包含含有经修饰的碱基的核苷酸，其中碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫尿苷、4-硫尿苷、怀丁苷(wybutosine)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧基乙酸和2-硫胞苷。

至少一个修饰可以是2'-OMe和/或至少一个修饰可以是2’-F。如本文中所述的其它修饰可以存在于第一链和/或第二链上。

贯穿本发明的描述，“相同的或共同的修饰”是指对任何核苷酸的相同修饰，即被基团诸如甲基或氟代基团修饰的A、G、C或U。它不是用于指在相同核苷酸上的相同添加。例如，2’-F-dU、2’-F-dA、2’-F-dC、2’-F-dG都被视为相同的或共同的修饰，2'-OMe-rU、2'-OMe-rA；2'-OMe-rC；2'-OMe-rG也是如此。2’-F修饰是与2’-OMe修饰不同的修饰。

优选地，核酸可以包含各自且单独地选自2'-OMe修饰和2’-F修饰的修饰和第二或其它修饰。核酸可以包含为2'-OMe的修饰（其可以是第一修饰）和为2’-F的第二修饰。

如本文所用的，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“降低”是指：基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等价RNA分子(例如，mRNA)的水平，或一种或多种蛋白或蛋白亚基或肽的活性，降低至低于在没有本发明的核酸存在下或关于与人转录物没有已知同源性的siRNA分子（本文称为非沉默对照）观察到的相应值。这样的对照可以以与本发明的分子类似的方式缀合和修饰，并通过相同的途径递送到靶细胞中；例如，表达可以降低至在没有抑制剂（其可以是核酸）存在下或在有非沉默对照（其可以是与靶序列非互补的核酸）存在下观察到的值的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或更小。

核酸可以包含在第二链和/或第一链上的一个或多个核苷酸，其被修饰以形成经修饰的核苷酸，具体地，其中修饰是在核糖的2’-OH基团处的修饰。可以修饰交替核苷酸，以形成经修饰的核苷酸。

如本文所述的交替意味着以有规律的方式一个接一个地发生。换而言之，交替意味着重复依次发生。例如，如果修饰一个核苷酸，则不修饰下一个邻接核苷酸，并修饰后面的邻接核苷酸，以此类推。可以用第一修饰修饰一个核苷酸，可以用第二修饰修饰下一个邻接核苷酸，并且用第一修饰修饰后面的邻接核苷酸，以此类推，其中第一修饰和第二修饰是不同的。

可以修饰本发明的核酸的第一链的一个或多个奇数核苷酸，其中第一链按5'至3'编号。如本文所述的术语“奇数”是指不可被2整除的数字。奇数的例子是1、3、5、7、9、11诸如此类。可以修饰本发明的核酸的第一链的一个或多个偶数核苷酸，其中第一链按5'至3'编号。如本文所述的术语“偶数”是指可被2整除的数字。偶数的例子是2、4、6、8、10、12、14诸如此类。可以修饰本发明的核酸的第二链的一个或多个奇数核苷酸，其中第二链按3'至5'编号。可以修饰本发明的核酸的第二链的一个或多个偶数核苷酸，其中第二链按3'至5'编号。

可以修饰第一链和/或第二链上的一个或多个核苷酸以形成经修饰的核苷酸。可以修饰第一链的一个或多个奇数核苷酸。可以通过至少第二修饰来修饰第一链的一个或多个偶数核苷酸，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个加成核苷酸上的修饰。一个或多个经修饰的偶数核苷酸中的至少一个可以与一个或多个经修饰的奇数核苷酸中的至少一个相邻。

在本发明的核酸中可以修饰第一链中的多个奇数核苷酸。第一链中的多个偶数核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。第一链可以包含通过共同修饰而修饰的相邻核苷酸。第一链还可以包含通过第二不同修饰而修饰的相邻核苷酸。

第二链的一个或多个奇数核苷酸可以通过特定修饰进行修饰，所述特定修饰不同于第一链上的奇数核苷酸的修饰，和/或第二链的一个或多个偶数核苷酸可以通过第一链的奇数核苷酸的相同修饰进行修饰。第二链的一个或多个经修饰的偶数核苷酸中的至少一个可以与一个或多个经修饰的奇数核苷酸相邻。第二链的多个奇数核苷酸可以通过共同修饰进行修饰，和/或多个偶数核苷酸可以通过存在于第一链奇数核苷酸上的相同修饰进行修饰。第二链上的多个奇数核苷酸可以通过第二修饰进行修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数核苷酸的修饰。

第二链可以包含通过共同修饰而修饰的相邻核苷酸，其可以是不同于第一链的奇数核苷酸的修饰的第二修饰。

在本发明的核酸中，第一链中的每个奇数核苷酸和第二链中的每个偶数核苷酸可以用共同修饰进行修饰，并且每个偶数核苷酸可以在第一链中用第二修饰进行修饰，且每个奇数核苷酸可以在第二链中用第二修饰进行修饰。

相对于第二链的未修饰的或不同地修饰的核苷酸，本发明的核酸可以具有移动至少一个核苷酸的第一链的经修饰的核苷酸。

可以在第一链中修饰一个或多个或每个奇数核苷酸，并且可以在第二链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸。可以通过第二修饰而修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。可以在第一链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸，并且可以在第二链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸。可以通过第二修饰而修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。可以在第一链中修饰一个或多个或每个奇数核苷酸，并且可以通过共同修饰在第二链中修饰一个或多个奇数核苷酸。可以通过第二修饰而修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。可以在第一链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸，并且可以通过共同修饰在第二链中修饰一个或多个或每个奇数核苷酸。可以通过第二修饰而修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。

本发明的核酸可以在一条或两条链中包含至少两个交替修饰的区域。这些交替区域可以包含最多达约12个核苷酸，但优选地包含约3至约10个核苷酸。交替核苷酸的区域可以位于本发明核酸的一条或两条链的末端。核酸可以在每个末端（3'和5'）包含4至约10个核苷酸的交替核苷酸，并且这些区域可以被约5至约12个邻接的未修饰的或不同地或共同地修饰的核苷酸隔开。

可以修饰第一链的奇数核苷酸，并且可以用第二修饰修饰偶数核苷酸。第二链可以包含用共同修饰修饰的相邻核苷酸，其可以与第一链的奇数核苷酸的修饰相同。第二链的一个或多个核苷酸也可以用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以彼此相邻并且与具有特定修饰的核苷酸相邻，所述特定修饰与第一链的奇数核苷酸的修饰相同。

本发明的核酸可以包含第一链，所述第一链包含用共同修饰修饰的相邻核苷酸。这样的核苷酸中的一个或多个可以与一个或多个可用第二修饰进行修饰的核苷酸相邻。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以是相邻的。第二链可以包含用共同修饰修饰的相邻核苷酸，其可以与第一链的一个或多个核苷酸的修饰之一相同。第二链的一个或多个核苷酸也可以用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以是相邻的。

在第一链上可以通过修饰而修饰(在第一链上从5'至3'和在第二链上从3'至5')编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸。在第一链上可以通过第二修饰而修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。在第二链上可以通过修饰而修饰编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸。在第二链上可以通过第二修饰而修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。

在第一链上可以通过修饰而修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。在第一链上可以通过第二修饰而修饰编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸。在第二链上可以通过修饰而修饰编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸。在第二链上可以通过第二修饰而修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。

显然，如果第一链和/或第二链的长度短于25个核苷酸，例如长度为19个核苷酸，则没有待修饰的编号为20、21、22、23、24和25的核苷酸。因此，技术人员理解以上描述适用于较短的链。

第一链上的一个或多个经修饰的核苷酸可以与具有共同修饰的第二链上的经修饰的核苷酸配对。第一链上的一个或多个经修饰的核苷酸可以与具有不同修饰的第二链上的经修饰的核苷酸配对。第一链上的一个或多个经修饰的核苷酸可以与第二链上的未修饰的核苷酸配对。第二链上的一个或多个经修饰的核苷酸可以与第一链上的未修饰的核苷酸配对。换而言之，交替核苷酸可以在两条链上对齐，例如，第二链的交替区域中的所有修饰都与第一链中的相同修饰配对，或可替换地，在与另一条链中的不同修饰（即，第二或其它修饰）配对的一条链的交替区域中，修饰可以偏移一个具有共同修饰的核苷酸。另一种选择是在每条链中具有不同的修饰。

第一链上的修饰可以相对于第二链上的经修饰的核苷酸移动一个核苷酸，使得共同的经修饰的核苷酸不彼此配对。

在该实施方案中，可以修饰在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸。

在该实施方案的一个方面，在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置13对应的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰。

在该实施方案的另一个方面，在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11对应的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰。

在该实施方案的另一个方面，在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11和13对应的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰。

在该实施方案的一个方面，可以修饰在第二链上与第一链的5’末端的位置11和/或13对应的核苷酸。

在该实施方案的另一个方面，在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13对应的核苷酸优选地用2'氟修饰进行修饰。

在该实施方案的另一个方面，在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸优选地用2'氟修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13对应的核苷酸优选地不用2’-OMe修饰进行修饰。

在该实施方案的另一个方面，在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸用2'氟修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13对应的核苷酸用2'氟修饰进行修饰。

在本发明的核酸或缀合物中，第一链和/或第二链的大于50%的核苷酸可以包含2’-OMe修饰，诸如第一链和/或第二链的大于55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%或更多包含2’-OMe修饰, 优选地测量为第一链和第二链的总核苷酸的百分比。

本发明的核酸或缀合物可以在第一链和/或第二链上包含不超过20%(诸如不超过15%或不超过10%)的2'氟修饰，作为两条链的总核苷酸的百分比。

在核酸的一个方面，第二链的在与第一链的核苷酸11或核苷酸13、或核苷酸11和13、或核苷酸11-13对应的位置的一个或多个核苷酸通过第四修饰进行修饰。优选地，第二链的除了在与第一链的核苷酸11或核苷酸13、或核苷酸11和13、或核苷酸11-13对应的位置的一个或多个核苷酸以外的所有核苷酸通过第三修饰进行修饰。优选地，第一链的核苷酸2和14或所有偶数核苷酸用在相同核酸中的第一修饰进行修饰。另外，或可替换地，第一链的奇数核苷酸用第二修饰进行修饰。第四修饰优选地不同于第二修饰且优选地不同于第三修饰，并且第四修饰优选地与第一修饰相同。第二修饰和第三修饰优选地是相同的。第一修饰和第四修饰优选地是2’-OMe修饰，且第二修饰和第三修饰优选地是2’-F修饰。第一链上的核苷酸从在第一链的5’末端处的核苷酸编号1开始连续编号。

在核酸的一个方面，第一链的所有偶数核苷酸通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数核苷酸通过第二修饰进行修饰，第二链的在与第一链的偶数核苷酸对应的位置的所有核苷酸通过第三修饰进行修饰，第二链的在与第一链的奇数核苷酸对应的位置的所有核苷酸通过第四修饰进行修饰，其中第一修饰和第四修饰是2’-F且第二修饰和第三修饰是2’-OMe。

在核酸的一个方面，第一链的所有偶数核苷酸通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数核苷酸通过第二修饰进行修饰,第二链的在与第一链的核苷酸11-13对应的位置的所有核苷酸通过第四修饰进行修饰，第二链的除了与第一链的核苷酸11-13对应的核苷酸以外的所有核苷酸通过第三修饰进行修饰，其中第一修饰和第四修饰是2’-F且第二修饰和第三修饰是2’-OMe。优选地在该方面，第二链的3’末端核苷酸是反转的RNA核苷酸(即所述核苷酸通过它的3’碳连接至链的3’末端，而不是象通常的情况那样通过它的5’碳)。当第二链的3’末端核苷酸是反转的RNA核苷酸时，反转的RNA核苷酸优选地是未修饰的核苷酸，其含义是，与天然核苷酸相应物相比，它不包含任何修饰。具体地，反转的RNA核苷酸优选地是2’-OH核苷酸。

在一个方面，所述核酸：

(i)具有在第一链的5’末端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；

(ii)具有在第一链和第二链上的末端三个3’核苷酸之间和在第二链上的末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键；

(iii)第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键是磷酸二酯键；和

(iv)第一链的所有偶数核苷酸通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数核苷酸通过第二修饰进行修饰，第二链的在与第一链的偶数核苷酸对应的位置的所有核苷酸通过第三修饰进行修饰，第二链的在与第一链的奇数核苷酸对应的位置的所有核苷酸通过第四修饰进行修饰，其中优选地第一修饰和第四修饰是2’-F且第二修饰和第三修饰是2’-OMe。

在一个方面，所述核酸：

(i)具有在第一链的5’末端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；

(ii)具有在第一链和第二链上的末端三个3’核苷酸之间和在第二链上的末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键；

(iii)第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键是磷酸二酯键；和

(iv)第一链的所有偶数核苷酸通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数核苷酸通过第二修饰进行修饰，第二链的在与第一链的核苷酸11-13对应的位置的所有核苷酸通过第四修饰进行修饰，第二链的除了与第一链的核苷酸11-13对应的核苷酸以外的所有核苷酸通过第三修饰进行修饰，其中优选地第一修饰和第四修饰是2’-F且第二修饰和第三修饰是2’-OMe。

可以修饰寡核苷酸的3’和5’末端。这样的修饰可以是在分子的3’末端或5’末端或两个末端。它们可以包括整个末端磷酸酯或磷酸酯基团的一个或多个原子的修饰或替换。例如，寡核苷酸的3’和5’末端可以缀合至其它功能性分子实体，诸如标记部分，例如，荧光团(例如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基(基于例如硫、硅、硼或酯)。功能性分子实体可以通过磷酸酯基团和/或接头连接至糖。接头的末端原子可以连接至或替代磷酸酯基团的连接原子或者糖的C-3’或C-5’O、N、S或C基团。可替换地，接头可以连接至或替代核苷酸替代物（例如，PNA）的末端原子。这些间隔物或接头可以包括例如-(CH

末端修饰的其它例子包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、替沙林、Sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶、EDTA、亲脂载体(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如，antennapedia肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG (例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、被取代的烷基、放射性地标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、运输/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu

可以出于多种原因而添加替代性的或额外的末端修饰，包括调节活性或调节对降解的抗性。可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物修饰5’末端。本发明的核酸在第一链或第二链上可以被5’磷酸化，或在5'主末端处包括磷酰基类似物。5’-磷酸修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些。合适的修饰包括：5’-单磷酸((HO)

本发明的核酸包含至少一个在第一链的5’末端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。

末端修饰还可以用于监测分布，并且在这样的情况下，要添加的基团可以包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料。末端修饰也可用于增强摄取，为此有用的修饰包括胆固醇。末端修饰也可用于将RNA试剂交联至另一部分。

腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是在RNA中发现的最常见的碱基。可以修饰或置换这些碱基以提供具有改善的性能的RNA。例如，用这些碱基或用合成的和天然的核苷碱基(例如，肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟嘌呤核苷或杀结核菌素)和上述修饰中的任何一种，可以制备核酸酶抗性的寡核糖核苷酸。可替换地，可以使用上述碱基和“通用碱基”中的任一种的经取代或经修饰的类似物。例子包括：腺嘌呤和鸟嘌呤的2-氨基腺嘌呤、6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-(2-氨基丙基)尿嘧啶，5-氨基烯丙基尿嘧啶，8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，二氢尿嘧啶，3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶，2-氨基嘌呤，5-烷基尿嘧啶，7-烷基鸟嘌呤，5-烷基胞嘧啶，7-脱氮腺嘌呤，N6,N6-二甲基腺嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，5-氨基-烯丙基-尿嘧啶，N3-甲基尿嘧啶，取代1,2,4-三唑，2-吡啶酮，5-硝基吲哚，3-硝基吡咯，5-甲氧基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸，5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶，5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N<4>-乙酰基胞嘧啶，2-硫胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，N6-异戊基腺嘌呤，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，N-甲基鸟嘌呤，或O-烷基化的碱基。

本文中使用的术语“非配对核苷酸类似物”是指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物，包括、但不限于：6脱氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me ribo U、N3-Me riboT、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在某些实施方案中，所述非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其它实施方案中，它是脱氧核糖核苷酸。

本文中使用的术语“末端官能团”包括、但不限于卤素、醇、胺、羧酸（carboxylic）、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。

某些部分可以连接至第一链或第二链的5'末端，并且包括脱碱基的核糖部分、脱碱基的脱氧核糖部分、修饰脱碱基的核糖和脱碱基的脱氧核糖部分，包括2’O烷基修饰；反转的脱碱基的核糖和脱碱基的脱氧核糖部分及其修饰、C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA; 5’-OMe核苷酸；和核苷酸类似物，包括4’,5’-亚甲基核苷酸; 1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸; 4’-硫核苷酸，碳环核苷酸; 5’-氨基-烷基磷酸酯；磷酸-1,3-二氨基-2-丙酯、磷酸-3-氨基丙酯；磷酸-6-氨基己酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；磷酸羟丙酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏式-呋喃型戊糖基核苷酸；无环的3’,4’-断裂核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸，5’-5’-反转的脱碱基的部分; 1,4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；和桥连或非桥连甲基膦酸酯和5’-巯基部分。

除了5’(E)-乙烯基膦酸酯、在核糖的2’-OH基团处的修饰和上述的其它末端修饰以外，本发明的核酸可以包含选自以下的其它修饰：3'-端脱氧-胸腺嘧啶、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基修饰、5' 磷酸酯或5' 磷酸酯模拟物修饰和胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸基酰胺基团修饰，和/或所述经修饰的核苷酸可以是锁核苷酸、脱碱基的核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一种。

所述核酸可以包含核苷酸，其包含经修饰的核苷酸，其中碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫尿苷、4-硫尿苷、怀丁苷(wybutosine)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧基乙酸和2-硫胞苷。

可以替换磷酸酯基团的部分的例子包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧基甲基亚氨基。在某些实施方案中，替换可以包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。

磷酸酯接头和核糖可以用核酸酶抗性的核苷酸替换。

例子包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。在某些实施方案中，可以使用PNA替代物。

糖基团还可以含有一个或多个碳，所述碳具有与核糖中的对应碳相反的立体化学构型。因而，经修饰的核苷酸可以含有糖诸如阿拉伯糖。

经修饰的核苷酸还可以包括“脱碱基的”糖，其缺少在C - 1’处的核苷碱基。这些脱碱基的糖可以进一步含有在一个或多个组分糖原子处的修饰。

本发明的核酸可以包含脱碱基的核苷酸。本文中使用的术语“脱碱基的”表示在1'位处的碱基的地方缺少碱基或具有其它化学基团的部分，例如3',3'-连接的或5',5'-连接的脱氧脱碱基的核糖衍生物。

如本文中所述的其它修饰可以存在于第一链和/或第二链上。

在实施例中显示了本发明的一些代表性的经修饰的核酸序列。这些实施例意图是代表性的和非限制性的。

本发明的核酸可以缀合至靶向配体以形成缀合物。

本发明进一步提供了一种用于抑制细胞中靶基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含如本文任何地方所定义的核酸。

在本发明的缀合物中，所述核酸的第二链可以缀合至所述配体部分。

在本发明的缀合物中，所述配体部分可以包含一个或多个GalNAc配体及其衍生物，诸如在所述核酸的第二链的5’末端处包含一个GalNAc部分或几个GalNAc部分。

一些配体可以具有内体裂解（endosomolytic）性能。内体裂解配体会促进内体的裂解和/或本发明的组合物或其组分从细胞的内体到细胞质的转运。内体裂解配体可以是聚阴离子的肽或肽模拟物，其显示pH依赖性的膜活性和促融性（fusogenicity）。内体裂解组分可含有化学基团，该化学基团响应于pH的变化而经历电荷的变化或质子化。内体裂解组分可以是直链的或支链的。

配体可以包括：治疗调节物，例如用于增强摄取；诊断化合物或报告基团，例如用于监测分布；交联剂；和赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白、肽、多胺和肽模拟物。配体可以包括天然存在的物质，诸如蛋白、碳水化合物或脂质。配体可以是重组的或合成的分子。

配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向试剂。靶向配体可以是凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白。

配体的其它例子包括染料、嵌入剂、交联剂、卟啉、多环芳烃、人工内切核酸酶或螯合剂、亲脂分子、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG、MPEG、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原、运输/吸收促进剂、合成的核糖核酸酶或咪唑簇。

配体可以是蛋白，例如糖蛋白或肽。配体也可以是激素或激素受体。它们还可以包括非肽种类，诸如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素或辅因子。

配体可以是诸如药物的物质，其可以增加核酸向细胞内的摄取，例如，通过破坏细胞的细胞骨架。

配体可以通过激活炎症应答来增加核酸向细胞内的摄取。这样的配体包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β或γ干扰素。

配体可以是脂质或基于脂质的分子。脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白。优选地，基于脂质的配体结合人血清白蛋白（HSA）。脂质或基于脂质的分子可以增加对缀合物降解的抗性，增加向靶细胞中的靶向或转运，和/或可以调节与血清蛋白的结合。基于脂质的配体可用于调节缀合物与靶组织的结合。

配体可以是类固醇。优选地，配体是胆固醇或胆固醇衍生物。

配体可以是例如维生素的部分，其被靶细胞吸收。示例性的维生素包括维生素A、E、K和B族维生素。维生素可被增殖细胞吸收，其可用于将核酸递送至细胞，诸如恶性的或非恶性的肿瘤细胞。

配体可以是细胞渗透剂（cell-permeation agent），例如螺旋细胞渗透剂。优选地，这样的试剂是两亲性的。

配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物是能够折叠成类似于天然肽的确定三维结构的分子。肽或肽模拟物配体可以包括天然存在的或经修饰的肽，或两者。肽或肽模拟物可以是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽。肽部分可以是树枝状聚合物肽、受约束的肽（constrained peptide）或交联的肽。肽部分可以包括疏水膜易位序列。肽部分可以是能够携带大的极性分子（诸如肽、寡核苷酸和蛋白）穿过细胞膜的肽，例如来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ)和Drosophila Antennapedia蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK)的序列。优选地，肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽。

配体可以是能够渗透例如微生物细胞或哺乳动物细胞的细胞渗透肽。

配体可以是药物代谢动力学调节剂。药物代谢动力学调节剂可以是亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白粘合剂、PEG、维生素等。

当存在两个或更多个配体时，配体可以全部具有相同的性能，全部具有不同的性能，或者一些配体具有相同的性能，而其它配体具有不同的性能。例如，配体可具有靶向性能、具有内体裂解活性或具有PK调节性能。在一个优选的实施方案中，所有配体具有不同的性能。

配体可以在3’末端、5’末端和/或在内部位置偶联至核酸。优选地，配体通过插入系链（tether）或接头偶联至核酸。

在某些实施方案中，所述核酸是双链核酸。在双链核酸中，配体可以附着到一条或两条链。在某些实施方案中，双链核酸含有与有义链缀合的配体。在其它实施方案中，双链核酸含有与反义链缀合的配体。

配体可以缀合至核酸分子的核苷碱基、糖部分或核苷间键。与嘌呤核苷碱基或其衍生物的缀合可发生在包括环内和环外原子的任何位置处。与嘧啶核苷酸或其衍生物的缀合也可以发生在任何位置处。与核苷的糖部分的缀合可以发生在任何碳原子处。与核苷间键的缀合可以发生在含磷键的磷原子处，或与磷原子键合的氧、氮或硫原子处。对于含胺或酰胺的核苷间键，缀合可以发生在胺或酰胺的氮原子处或邻近的碳原子处。

配体一般是碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖或多糖。配体可以通过接头部分缀合至核酸。接头部分可以是单价、二价或三价支链接头。

将寡核苷酸、特别是本发明的双链核酸有效递送至体内细胞的方式是重要的，并且需要特异性靶向和免受细胞外环境特别是血清蛋白的实质保护。实现特异性靶向的一种方法是将靶向部分或配体与核酸缀合。靶向部分帮助将核酸靶向所需的靶位点，并且对于所期望的受体位点需要缀合适当的靶向部分，以便缀合的分子被靶细胞吸收，诸如通过胞吞作用。靶向部分或配体可以是能够靶向特定受体的任何部分或配体。

例如，无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)是高容量受体，其在肝细胞上高度丰富。三触角簇糖苷的首次公开之一是在美国专利号US 5,885,968中。具有三个GalNAc配体并包含磷酸酯基团的缀合物是已知的并且描述在Dubber等人(2003)中。ASGP-R显示出的对N-乙酰基-D-半乳糖基胺(GalNAc)的亲和力为对D-Gal的50倍。

表达凝集素(无唾液酸糖蛋白受体; ASGPR)的肝细胞可以用于通过半乳糖或半乳糖胺与药用物质的共价偶联(S.Ishibashi, 等人. 1994)将药物靶向肝脏，所述凝集素特异性地识别糖基化的蛋白或其它寡糖的末端β-半乳糖基亚基(P. H. Weigel等人. ,2002)。此外，通过靶向单元的重复实现的多价效应可以显著提高结合亲和力(E. A. L.Biessen等人,1995)。

ASGPR是含有末端β-半乳糖基的糖蛋白的主动胞内体运输的介质，因此ASGPR高度适合于药物候选物如核酸的靶向递送，其必须被递送到细胞中(Akinc等人)。

可以选择糖（其也可以称为配体）以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。具体地，受体是在哺乳动物肝细胞的表面上，例如，肝无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。

糖可以选自N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和岩藻糖。糖可以是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。

因此，用于本发明中的配体可以包含：（i）一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分及其衍生物，和（ii）接头，其中所述接头将所述GalNAc部分缀合至如在任何前面的方面中定义的核酸或序列。所述接头可以是单价或二价或三价或四价支链结构。可以如本文所定义修饰核苷酸。

“GalNAc”表示2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D- 吡喃型半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰基半乳糖胺。对“GalNAc”或“N-乙酰基半乳糖胺”的提及包括β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖和α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D- 吡喃型半乳糖。β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖和α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃型半乳糖可以互换使用。优选地，本发明的化合物包含β-形式, 2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖。

所述配体可以包含GalNAc。

所述配体可以包含式(II)的化合物：

[S-X

其中：

S代表糖，优选地其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；

X

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；

X

A是分支单元；

X

其中根据本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯、优选硫代磷酸酯（优选地在有义链的5’末端处）缀合至X

在式(II)中，分支单元“A”优选地分支为三个以便容纳三个糖配体。分支单元共价地附着于配体和核酸。分支单元可以包含支链脂族基团，其包含选自烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基的基团。分支单元可以包含选自烷基和醚基的基团。

分支单元A可以具有选自以下的结构：

其中每个A

分支单元可以具有选自以下的结构：

其中每个A

分支单元可以具有选自以下的结构：

其中A

分支单元可以具有结构：

分支单元可以具有结构：

分支单元可以具有结构：

任选地，分支单元仅由碳原子组成。

“X

X

X

所述配体可以包含式(III)的化合物：

[S-X

其中：

S代表糖，优选GalNAc；

X

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；

X

A是选自以下的分支单元：

X

其中根据本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯、优选硫代磷酸酯缀合至X

分支单元A可以具有结构：

分支单元A可以具有结构：

X

所述配体可以包含式(IV)的化合物：

[S-X

其中：

S代表糖，优选GalNAc；

X

P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；

X

A是分支单元；

X

其中根据本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯、优选硫代磷酸酯缀合至X

分支单元可以包含碳。优选地，分支单元是碳。

X

关于配体的以上方面中的任一个，P代表经修饰的磷酸酯基团。P可以由下式表示：

其中Y

经修饰的磷酸酯是指其中一个或多个氧被替换的磷酸酯基团。经修饰的磷酸酯基团的例子包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐（borano phosphates）、硼代磷酸酯酯（borano phosphate esters）、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有被硫替换的两个非连接氧。磷酸酯基团中的一个、每个或两个非连接氧可以独立地是S、Se、B、C、H、N或OR (R是烷基或芳基)中的任何一个。

通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替换连接氧，也可以修饰磷酸酯接头。所述替换可以发生在末端氧处。用氮替换非连接氧是可能的。

例如，Y

Y

Y

Y

技术人员会理解，在某些情况下，在Y

优选地，经修饰的磷酸酯基团是硫代磷酸酯基团。硫代磷酸酯基团包括二硫代磷酸酯(即其中Y

P也可以是乙基磷酸酯(即其中Y

可以选择糖（其还可以被称作配体）以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。具体地，受体是在哺乳动物肝细胞的表面上，例如肝无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。

关于以上方面中的任一个，糖可以选自具有半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和果糖中的一种或多种的N-乙酰基。优选地，糖是两分子的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。本发明的化合物可以具有3个配体，其各自优选为N-乙酰基半乳糖胺。

“GalNAc”表示2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D- 吡喃型半乳糖，通常在文献中被称作N-乙酰基半乳糖胺。对“GalNAc”或“N-乙酰基半乳糖胺”的提及包括β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖和α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D- 吡喃型半乳糖。在某些实施方案中，β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖和α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃型半乳糖可以互换使用。优选地，本发明的化合物包含β-形式, 2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖。

2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃型半乳糖

2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型半乳糖

2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃型半乳糖

关于式(IV)的以上化合物中的任一种，X

关于式(IV)的化合物，X

因此，本发明另外提供了具有下述结构之一的缀合的核酸：

其中Z代表如前文中定义的核酸。

优选地，核酸是缀合的核酸，其中所述核酸缀合至具有下述结构的三触角配体：

其中Z代表如前文中定义的核酸。

在一个方面，所述核酸缀合至具有下述结构的三触角配体：

其中所述核酸通过配体的磷酸酯基团缀合至配体：a)至在第二链的5’末端处的最后一个核苷酸；b)至在第二链的3’末端处的最后一个核苷酸；或c)至在第一链的3’末端处的最后一个核苷酸。

式(II)、(III)或(IV)的配体或本文中公开的三触角配体中的任一种可以附着于第一(反义)链的3’末端处和/或第二(有义)链的3’和/或5’末端中的任一个处。所述核酸可以包含超过一个式(II)、(III)或(IV)的配体或本文中公开的三触角配体中的任一种。但是，单个式(II)、(III)或(IV)的配体或本文中公开的三触角配体中的任一种是优选的，因为单个这样的配体足以将核酸有效地靶向至靶细胞。优选地在该情况下，在配体所附着的核酸的末端处的至少最后两个、优选地至少最后三个和更优选地至少最后四个核苷酸通过磷酸二酯键连接。

优选地，第一(反义)链的5’末端没有附着于式(II)、(III)或(IV)的配体或本文中公开的三触角配体中的任一种，因为在该位置的配体可以潜在地干扰核酸的生物活性。

与在3’末端具有相同配体的相同核酸相比，在链的5’末端处具有单个式(II)、(III)或(IV)的配体或本文中公开的三触角配体中的任一种的核酸更容易且因此更廉价地合成。优选地因此，单个式(II)、(III)或(IV)中的任一个的配体或本文中公开的三触角配体中的任一种共价地附着于(缀合至)所述核酸的第二链的5’末端。

一个实施方案是用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，其包含至少一个双链体区域，该区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从所述要抑制的靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，其中所述第一链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，其中

i) 所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至第一链中的第二个核苷酸，优选地其中所述第一链包含在至少末端三个5’核苷酸之间的磷酸二酯键；

ii) 所述第一链包含至少一个硫代磷酸酯键，优选地所述第一链包含在末端两个3’核苷酸之间和更优选地在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键；

iii) 所述第二链在5’末端处缀合至式(II)、(III)或(IV)的配体，优选地缀合至如在图13a、13b或13c、更优选地图13c中所示配体，且所述第二链优选地包含仅在末端2个、3个或4个3’核苷酸之间、优选地仅在3个3’末端核苷酸之间的硫代磷酸酯键；

iv) 所述核酸的至少一个、几个或所有核苷酸是2’修饰的核苷酸；

v) 两条链的非硫代磷酸酯键的核苷酸间键优选地是磷酸二酯键。

作为另一个方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，其包含至少一个双链体区域，该区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从所述要抑制的靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，且其中所述第一链具有末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，其中所述末端5’-(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸，且其中所述核酸分子缀合至配体。

所述核酸可以缀合至如本文所述的配体。如本文所述，可以修饰第一链和/或第二链的核苷酸。

所述配体可以包含GalNAc且可以具有在图13a或13b或13c、优选地图13c中所示的结构。

在本发明的缀合物中，所述配体部分可以包含接头部分和靶向配体，且其中所述接头部分将所述靶向配体连接至所述核酸部分。

本发明也涉及一种用于抑制细胞中靶基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含根据本文任何地方定义的发明的核酸，所述配体部分包含接头部分，诸如丝氨醇-衍生的接头部分，和用于细胞的体内靶向并且排它地缀合至一条或两条RNA链的3’和/或5’末端的靶向配体，其中第一条RNA链的5’末端没有发生缀合，其中：

(i) 第二条RNA链在5’末端处缀合至靶向配体，且其中(a)第二条RNA链也在3’末端处缀合至靶向配体并且第一条RNA链的3’末端没有发生缀合；或(b)第一条RNA链在3’末端处缀合至靶向配体并且第二条RNA链的3’末端没有发生缀合；或(c)第二条RNA链和第一条RNA链也在3’末端处缀合至靶向配体；或

(ii) 第二条RNA链和第一条RNA链在3’末端处缀合至靶向配体并且第二条RNA链的5’末端没有发生缀合。

本发明还包括一种用于抑制细胞中的TMPRSS6基因表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含根据本文任何地方定义的发明的核酸，其中所述核酸的第一链与从所述TMPRSS6基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，所述配体部分包含接头部分，诸如丝氨醇-衍生的接头部分，和用于细胞的体内靶向并且排它地缀合至一条或两条RNA链的3’和/或5’末端的靶向配体，其中第一条RNA链的5’末端没有发生缀合，其中：

(i) 所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体，且其中(a)所述第二链也在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第一链的3’末端没有发生缀合；和

(ii) 其中所述第一链在多个位置处包括经修饰的核苷酸，且其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰，并且与第一链位置11、12和13 (对应于19-聚体中从5’末端的第二链位置7、8和9)相对的第二链位置没有用2’-OMe修饰进行修饰。

任选地，第一链可以包含核苷酸序列：

(vp)- mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA(SEQ ID NO: 9)

和/或(优选地并且)第二链可以包含核苷酸序列：

Ser(GN) (ps) fU (ps) mC (ps) fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps) mU (ps) fA (ps) Ser(GN) (SEQ ID NO: 10)。

接头部分可以例如是丝氨醇-衍生的接头部分或本文描述的其它接头类型之一。

在本发明的一个实施方案中，第二条RNA链(即有义链)在5’末端处缀合至靶向配体，第一条RNA链(即反义链)在3’末端处缀合至靶向配体并且第二条RNA链的3’末端(即有义链)没有发生缀合，使得形成具有以下示意结构的缀合物：

在本发明的一个实施方案中，第二条RNA链(即有义链)在5’末端处缀合至靶向配体，第二条RNA链(即有义链)也在3’末端处缀合至靶向配体并且第一条RNA链(即反义链)的3’末端没有发生缀合，使得形成具有以下示意结构的缀合物：

在本发明的一个实施方案中，第二条RNA链(即有义链)和第一条RNA链(即反义链)在3’末端处缀合至靶向配体并且第二条RNA链的5’末端(即有义链)没有发生缀合，使得形成具有以下示意结构的缀合物：

在本发明的一个实施方案中，第二条RNA链(即有义链)在5’末端处缀合至靶向配体并且第二条RNA链(即有义链)和第一条RNA链(即反义链)也在3’末端处缀合至靶向配体，使得形成具有以下示意结构的缀合物：

在以上实施方案中的任一个中，

其中

这些示意图无意限制第一链或第二链中的核苷酸的数目，所述示意图也不代表对碱基的互补性的任何种类的限制或任意其它限制。

配体可以是单体的或多聚体的(例如二聚体的、三聚体的等)。

适当地，配体是单体的，因而含有单个靶向配体部分，例如单个GalNAc部分。

可替换地，配体可以是二聚体配体，其中配体部分包含两个接头部分，诸如丝氨醇-衍生的接头部分，每个连接至单个靶向配体部分。

配体可以是三聚体配体，其中配体部分包含三个接头部分，诸如丝氨醇-衍生的接头部分，每个连接至单个靶向配体部分。

两个或三个接头部分（诸如丝氨醇-衍生的接头部分）可以串联连接，例如如下所示：

其中n是1或2且Y是S或O。

优选地，配体是单体的。

适当地，缀合的RNA链通过接头部分、优选丝氨醇-衍生的接头部分缀合至靶向配体，所述接头部分包括其它接头，其中所述其它接头是或包含饱和的直链或支链C

适当地，接头部分是丝氨醇-衍生的接头部分。术语“丝氨醇-衍生的接头部分”是指包含下述结构的接头部分：

所述结构的O原子通常连接至RNA链且N原子通常连接至靶向配体。

更适当地，所述其它接头包含饱和的、无分支的C1-15烷基链，其中一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适当地1或2个，特别是1个)被氧原子替换。

更适当地，所述其它接头包含PEG-链。

更适当地，所述其它接头包含饱和的、无分支的C

更适当地，所述其它接头包含饱和的、无分支的C

更适当地，所述其它接头包含饱和的、无分支的C

在一个实施方案中，

其中n、Y和L

因而，在一个实施方案中，靶向配体部分是式(VI)的连接部分：

其中n、Y和L

适当地，

其中n、Y、R

适当地，靶向配体部分是式(VIII)的连接部分：

其中n、Y、R

适当地，

其中n、Y和L

适当地，靶向配体部分是式(X)的连接部分：

其中n、Y和L

适当地，

其中F、Y和L如下面所定义，且磷酰基团的O附着于RNA链的末端寡核苷。

适当地，靶向配体部分是式(XII)的连接部分：

其中F、Y和L如下面所定义，且磷酰基团的O附着于RNA链的末端寡核苷。

在以上结构中的任一种中，适当地配体选自GalNAc和半乳糖部分，特别是GalNAc部分。可替换地，GalNac可以被另一种靶向配体（例如糖）替换。

在本发明的一个实施方案中，第一条RNA链是式(XIII)的化合物：

其中b优选地是0或1；且

第二条RNA链是式(XIV)的化合物：

其中：

c和d独立地优选地是0或1；

Z

Y是O或S；

n是0、1、2或3；且

L

且其中b + c + d优选地是2或3。

优选地，在式(XIII)和(XIV)中的L

其中：

L选自包含以下成员的集合，或优选地由以下成员组成的集合：

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

其中末端C(O)如果存在的话则附着于式(XV)的X，或者如果X不存在，则附着于式(XV)的W

W

-(CH

-(CH

-(CH

X不存在或者选自包含以下成员的集合，或优选地选自由以下成员组成的集合：NH,NCH

V选自包含以下成员的集合，或优选地由以下成员组成的集合：

其中B如果存在的话，是修饰的或天然的核苷碱基。

适当地，第一条RNA链是式(XVI)的化合物：

其中b是0或1；且

第二条RNA链是式(XVII)的化合物：

其中c和d独立地是0或1；

其中：

Z

Y是O或S；

R

n是0、1、2或3；且

L在式(XVI)和(XVII)中是相同的或不同的且选自：

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

其中末端C(O) (如果存在的话)附着于NH基团；

且其中b + c + d是2或3。

在一个例子中，b是0，c是1且d是1。在另一个例子中，b是1，c是0且d是1。在另一个例子中，b是1，c是1且d是0。在另一个例子中，b是1，c是1且d是1。

在一个例子中，Y是O。在另一个例子中，Y是S。

在一个例子中，R

在一个例子中，n是0。

在一个例子中，L是-(CH

在一个方面，第一链是式(XVIII)的化合物

其中b优选地是0或1；且

第二链是式(XIX)的化合物：

其中c和d独立地优选地是0或1；

其中：

Z

Y独立地是O或S；

R

n独立地优选地是0、1、2或3；且

L在式(XVIII)和(XIX)中是相同的或不同的，且当L在同一个式内出现超过一次时在式(XVIII)和(XIX)内是相同的或不同的，并且选自包含以下成员的集合，或优选地选自由以下成员组成的集合：

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

其中末端C(O)如果存在的话，附着于NH基团(接头的NH基团，而不是靶向配体的NH基团)；

且其中b + c + d优选地是2或3。

适当地，第一条RNA链是式(XX)的化合物：

其中b优选地是0或1；且

第二条RNA链是式(XXI)的化合物：

其中：

c和d独立地优选地是0或1；

Z

Y是O或S；

n是0、1、2或3；且

L

n是0且L

并且末端OH基团不存在从而形成以下部分：

其中

F是饱和的分支的或未分支的(诸如未分支的) C

L在式(XX)和(XXI)中是相同的或不同的并且选自：

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

其中末端C(O) (如果存在的话)附着于NH基团；

且其中b + c + d优选地是2或3。

在任一个上式中，在GalNAc存在的情况下，GalNAc可以替代任意其它靶向配体，诸如本文提及的那些。

适当地，b是0，c是1且d是1；b是1，c是0且d是1；b是1，c是1且d是0；或b是1，c是1且d是1。

更适当地，b是0，c是1且d是1；b是1，c是0且d是1；或b是1，c是1且d是1。

最适当地，b是0，c是1且d是1。

在一个实施方案中，Y是O。在另一个实施方案中，Y是S。

在一个实施方案中，R

在一个实施方案中，n是0、1、2或3。适当地，n是0。

在一个实施方案中，L选自：

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

其中末端C(O)附着于NH基团。

适当地，L是-(CH

适当地，L是：

实施例F部分包括(CH

适当地，L

适当地，L

适当地，L

适当地，L

适当地，n是0且L

并且末端OH基团不存在从而形成以下部分：

其中Y是如本文别处所定义。

在b、c和d所扩入的部分中，L

丝氨醇-衍生的接头部分可以是基于任何立体化学的丝氨醇，即衍生自L-丝氨酸异构体、D-丝氨酸异构体、外消旋的丝氨酸或异构体的其它组合。在本发明的一个优选方面，所述丝氨醇-GalNAc部分(SerGN)具有以下立体化学：

即是基于(S)-丝氨醇-酰胺化物或(S)-丝氨醇琥珀酸酯固体支持的从L-丝氨酸异构体衍生出的结构单元。

在一个优选方面，所述核酸的第一链是式(XVIII)的化合物且所述核酸的第二链是式(XIX)的化合物，其中：

b是0；

c和d是1；

n是0；

Z

Y是S；

R

L是-(CH

在另一个优选的方面，所述核酸的第一链是式(XIII)的化合物且所述核酸的第二链是式(XIV)的化合物，其中：

b是0；

c和d是1；

n是0；

Z

Y是S；且

L

W

W

W

V是CH；

X是NH；且

L是-(CH

在另一个优选的方面，所述核酸的第一链是式(XIII)的化合物且所述核酸的第二链是式(XIV)的化合物，其中：

b是0；

c和d是1；

n是0；

Z

Y是S；

L

W

V是

X不存在；且

L是-(CH

在一个实施方案中，所述靶向的细胞是肝细胞。

在一个实施方案中，所述接头部分是丝氨醇-衍生的接头部分，并且靶向配体排它地缀合至核酸的第一链和第二链中的一个或两个的3’和/或5’末端，其中第一链的5’末端没有发生缀合，其中：

(i) 所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体，且其中(a)所述第二链也在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第一链的3’末端没有发生缀合；或(b)所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体且第二链的3’末端没有发生缀合；或(c)所述第二链和所述第一链也在3’末端处缀合至靶向配体；或

(ii) 所述第二链和所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体且第二链的5’末端没有发生缀合；和

(iii) 其中所述第一链在多个位置处包括经修饰的核苷酸，且其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰(即它们具有除了2’-OMe以外的修饰或是未修饰的)。

在本发明的缀合物的一个实施方案中，所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体,所述第二链也在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第一链的3’末端没有发生缀合。

在本发明的缀合物的一个实施方案中，所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体，所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第二链的3’末端没有发生缀合。

在本发明的缀合物的一个实施方案中，所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体并且所述第二链和所述第一链也在3’末端处缀合至靶向配体。

在本发明的缀合物的一个实施方案中，所述第二链和所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体且第二链的5’末端没有发生缀合。

在本发明的核酸或缀合物的一个实施方案中，在第一链和第二链中的至少一个的3’末端处的末端核苷酸是反转的核苷酸并且通过所述末端核苷酸的3’碳和邻近核苷酸的3’碳附着于邻近核苷酸，和/或在第一链和第二链中的至少一个的5’末端处的末端核苷酸是反转的核苷酸并且通过所述末端核苷酸的5’碳和邻近核苷酸的5’碳附着于邻近核苷酸，或其中所述核酸包含二硫代磷酸酯键。

本发明的核酸可以在一个或几个链末端处包含反转的RNA核苷酸。这样的反转的核苷酸为核酸提供稳定性。优选地，所述核酸至少在第一链和/或第二链的3’末端处和/或在第二链的5’末端处包含反转的核苷酸。更优选地，所述核酸在第二链的3’末端处包含反转的核苷酸。最优选地，所述核酸在第二链的3’末端处包含反转的RNA核苷酸，并且该核苷酸优选地是反转的A。反转的核苷酸是通过它的3’碳（而不是象通常的情况那样通过它的5’碳）连接至核酸的3’末端的核苷酸，或者通过它的5’碳（而不是象通常的情况那样通过它的3’碳）连接至核酸的5’末端。反转的核苷酸优选地存在于链的末端处，不是作为突出端，而是与另一条链中的对应核苷酸相对。因此，所述核酸优选地在包含反转的RNA核苷酸的末端处是平端。存在于链的末端处的反转的RNA核苷酸优选地是指，在链的该末端处的最后一个核苷酸是反转的RNA核苷酸。具有这样的核苷酸的核酸是稳定的且易于合成。反转的RNA核苷酸优选地是未修饰的核苷酸，其含义是，与天然核苷酸相应物相比，它不包含任何修饰。具体地，反转的RNA核苷酸优选地是2’-OH核苷酸。

可切割的连接基团是在细胞外稳定但在进入靶细胞后被切割的接头。切割会释放被接头保持在一起的两个部分。

在一个优选的实施方案中，本发明的核酸包含可切割的连接基团，其在靶细胞中或在第一参考条件（其例如可以被选择以模拟或代表细胞内条件）下的切割速度为在受试者的血液中或在第二参考条件（其例如可以被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件）下的切割速度的至少10倍或更多，优选至少100倍。

可切割的连接基团对切割剂敏感，例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在。降解分子包括氧化或还原酶、还原剂（如硫醇）、酯酶、内体或可以产生酸性环境的试剂、可以通过充当普通酸而水解或降解酸可切割的连接基团的酶、肽酶和磷酸酶。

可切割的连接基团可以是二硫键，其对pH敏感。

接头可以包括可被特定酶切割的可切割的连接基团。掺入接头中的可切割的连接基团的类型可取决于靶细胞。例如，当肝细胞是靶标时，包含酯基团的接头是优选的。当靶向富含肽酶的细胞（诸如肝细胞和滑膜细胞）时，可以使用含有肽键的接头。

一般而言，通过测试降解剂（或条件）切割候选连接基团的能力，可以评价候选可切割的连接基团的适合性。还将合乎需要的是，也测试候选可切割的连接基团在血液中或当与其它非靶组织接触时的抗切割能力。在优选的实施方案中，与血液或血清（或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下）相比，有用的候选化合物在细胞中（或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下）的切割速度为至少2倍、4倍、10倍或100倍。

在一个方面，可切割的连接基团可以是氧化还原可切割的连接基团。所述氧化还原可切割的连接基团可以是二硫键连接基团。

在一个方面，连接基团可以是基于磷酸酯的可切割的连接基团。优选的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-Ρ(O)(Η)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选实施方案是-O-P(O)(OH)-O-。

在一个方面，可切割的连接基团可以是酸可切割的连接基团。优选地，酸可切割的连接基团在pH为6.5或更低的环境中被切割，或者被试剂诸如可以充当普通酸的酶切割。酸可切割的连接基团的例子包括、但不限于腙、酯和氨基酸酯。酸可切割的基团可具有通式-C=NN-；C(O)O或-OC(O)。一个优选实施方案是这样的连接基团，其中与酯的氧（烷氧基）附着的碳是芳基、被取代的烷基或叔烷基诸如二甲基戊基或叔丁基。

在一个实施方案中，所述可切割的连接基团可以是基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团的例子包括、但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。

在一个实施方案中，所述可切割的连接基团可以是基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成的肽键，以产生寡肽（例如，二肽、三肽等）和多肽。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白的氨基酸之间形成的肽键（即，酰胺键），并且不包括完整的酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-NHCHR

如本文中所述的核酸可以与脂质一起以脂质体形式配制。这样的制剂可以在本领域中描述为脂质体复合物（lipoplex）。具有脂质/脂质体的组合物可用于帮助将本发明的核酸递送至靶细胞。本文所述的脂质递送系统可用作缀合的配体的替代物。当将本发明的核酸与脂质递送系统或与配体缀合物递送系统一起使用时，可以存在本文所述的修饰。

这样的脂质体复合物可以包含脂质组合物，其包含：

i)阳离子脂质或其药学上可接受的盐；

ii)类固醇；

iii)磷脂酰乙醇胺磷脂；

iv)聚乙二醇化的脂质。

所述阳离子脂质可以是氨基阳离子脂质。

所述阳离子脂质可以具有式(XXII)：

或其药学上可接受的盐，其中：

X代表O、S或NH；

R

当X代表S或NH时，R

当X代表O时，R

所述阳离子脂质可以具有式(XXIII)：

或其药学上可接受的盐。

所述阳离子脂质可以具有式(XXIV)：

或其药学上可接受的盐。

阳离子脂质组分的含量可以是制剂的总脂质含量的约55摩尔%至约65摩尔%。具体地，阳离子脂质组分是制剂的总脂质含量的约59摩尔%。

制剂进一步包含类固醇。类固醇可以是胆固醇。类固醇的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约26摩尔%至约35摩尔%。更具体地，类固醇的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约30摩尔%。

磷脂酰乙醇胺磷脂可以选自l,2-二植烷酰基-

聚乙二醇化的脂质可以选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)和C16-神经酰胺-PEG。聚乙二醇化的脂质的含量可以是制剂的总脂质含量的约1-5摩尔%。

组合物中的阳离子脂质组分的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约55摩尔%至约65摩尔%，优选脂质制剂的总脂质含量的约59摩尔%。

组合物可以具有选自以下的组分i):ii):iii):iv)的摩尔比：55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1；和65:24:10:1。

该组合物可以包含具有以下结构的阳离子脂质

具有以下结构的类固醇

具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂

和具有以下结构的聚乙二醇化的脂质

中性脂质体组合物可以由例如二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体可以主要由二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物可以由磷脂酰胆碱(PC) (例如，大豆PC和蛋PC)形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。

带正电荷的合成的阳离子脂质N-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-Ν,Ν,Ν-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成小脂质体，其与核酸自发地相互作用以形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合。DOTMA类似物也可以用于形成脂质体。

本文描述的脂质的衍生物和类似物也可用于形成脂质体。

含有核酸的脂质体可通过多种方法制备。在一个实施例中，将脂质体的脂质组分溶解在去污剂中，使得脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲的阳离子脂质或脂质缀合物。去污剂可具有高临界胶束浓度并且可以是非离子型的。示例性的去污剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡萄糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰基肌氨酸。然后将核酸制剂添加到包含脂质组分的胶束中。在脂质上的阳离子基团与核酸相互作用并在核酸周围缩合以形成脂质体。缩合后，除去去污剂（例如通过透析）以产生核酸的脂质体制剂。

如果必要的话，可以在缩合反应过程中添加帮助缩合的载体化合物，例如通过受控添加。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物（例如，精胺或精脒）。还可以调节pH以有利于缩合。

核酸制剂可以包含表面活性剂。在一个实施方案中，将核酸配制为包含表面活性剂的乳剂。

未离子化的表面活性剂是非离子型表面活性剂。实例包括非离子型酯，诸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油基酯等，非离子型烷醇酰胺，和醚诸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化的醇和乙氧基化的/丙氧基化的嵌段聚合物。

当溶解或分散在水中时带有负电荷的表面活性剂是阴离子表面活性剂。实例包括羧酸酯，诸如肥皂，酰基乳酰乳酸酯，氨基酸的酰基酰胺，硫酸的酯诸如硫酸烷基酯和乙氧基化的硫酸烷基酯，磺酸盐诸如烷基苯磺酸盐，酰基羟乙基磺酸盐，酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐，和磷酸盐。

当溶解或分散在水中时带有正电荷的表面活性剂是阳离子表面活性剂。实例包括季铵盐和乙氧基化的胺。

具有带正电荷或负电荷的能力的表面活性剂是两性表面活性剂。实例包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。

“胶束”在本文中被定义为特定类型的分子组合，其中两亲分子以球形结构排列，使得分子的所有疏水部分朝向内部，从而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的排列。通过混合核酸的水溶液、碱金属烷基硫酸盐和至少一种形成胶束的化合物，可以形成胶束。

示例性的形成胶束的化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、羟乙酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、甘油单油酸酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸（trihydroxy oxocholanyl glycine）及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐及其混合物。

可以将酚和/或间甲酚添加到混合的胶束组合物中以充当稳定剂和防腐剂。可以添加等渗剂诸如甘油。

可以将核酸制剂掺入颗粒诸如微粒中。通过喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些方法的组合，可以生产微粒。

本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的核酸或缀合的核酸。药物组合物可单独地或与其它试剂组合用作药物或诊断剂。例如，本发明的核酸或缀合的核酸可以与递送媒介物（例如，脂质体）和赋形剂（诸如载体、稀释剂）组合。还可以添加其它试剂诸如防腐剂和稳定剂。用于递送核酸或缀合的核酸的方法是本领域已知的并且在本领域技术人员的知识范围内。

本发明的核酸或缀合的核酸也可以与其它治疗性化合物组合施用，单独施用或者同时施用，例如作为组合的单位剂量。本发明还包括药物组合物，其包含在生理学上/药学上可接受的赋形剂（诸如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等）中的根据本发明的核酸或缀合的核酸。

药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用。组合物可以配制用于口服施用，胃肠外施用（包括，例如，皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射），局部应用，阴道内或直肠内施用，舌下施用，眼施用，透皮施用或鼻施用。使用皮下或静脉内方法的递送是优选的。

本发明的药物和药物组合物的剂量水平可以由本领域技术人员通过例行实验确定。在一个实施方案中，单位剂量可含有约0.01 mg/kg体重至约100 mg/kg体重的核酸。可替换地，剂量可以是10 mg/kg至25 mg/kg体重、或1 mg/kg至10 mg/kg体重、或0.05 mg/kg至5mg/kg体重、或0.1 mg/kg至5 mg/kg体重、或0.1 mg/kg至1 mg/kg体重、或0.1 mg/kg至0.5mg/kg体重、或0.5 mg/kg至1 mg/kg体重。也可以通过其它参数（例如，体表面积）计算剂量水平。

药物组合物可以是无菌的可注射的水性悬浮液或溶液，或者是低压冻干形式。在一个实施方案中，药物组合物可以包含低压冻干的脂质体复合物或脂质体复合物的水性悬浮液。脂质体复合物优选包含本发明的核酸。这样的脂质体复合物可用于将本发明的核酸递送至在体外或在体内的靶细胞。

本发明的药物组合物和药物可以以药学有效剂量施用给哺乳动物受试者。哺乳动物可以选自人类、狗、猫、马、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。

本发明的另一个方面涉及用于治疗或预防疾病或病症的本发明的核酸或缀合的核酸或包含本发明的核酸或缀合的核酸的药物组合物。本发明包括药物组合物，其包含在生理学上/药学上可接受的赋形剂（诸如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等）中的一种或多种根据本发明的RNAi分子。本发明的核酸或缀合的核酸或包含本发明的核酸或缀合的核酸的药物组合物优选地用于治疗或预防这样的疾病或病症：其需要降低被本发明的核酸靶向的靶基因的表达水平。

药物组合物可以是无菌的可注射的水性悬浮液或溶液，或呈低压冻干形式。

药学上可接受的组合物可以包含治疗有效量的在根据本发明的任何实施方案中的一种或多种核酸，其单独施用或与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂一起配制。

可充当药学上可接受的载体的材料的例子包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉末；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如镁态（magnesium state）、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20) pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；和(22)在药物制剂中采用的其它无毒的相容物质。

稳定剂可以是稳定核酸试剂的试剂，例如可以与核酸形成复合物的蛋白、螯合剂（例如EDTA）、盐、RNA酶抑制剂和DNA酶抑制剂。

在某些情况下， 合乎需要的是，减慢来自皮下或肌内注射的药物的吸收，以延长药物的作用。这可以通过使用具有差水溶性的结晶或无定形物的液体混悬液来完成。药物的吸收速率然后取决于其溶出速率，所述溶出速率又可以取决于晶体大小和晶型。可替换地，通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中，实现胃肠外施用的药物形式的延迟吸收。

本文描述的核酸可能能够抑制细胞中靶基因的表达。本文描述的核酸可能能够部分地抑制细胞中靶基因的表达。抑制可以是完全的，即，在没有本发明的核酸存在下靶基因表达的表达水平的0％。靶基因表达的抑制可能是部分的，即，它可能是在没有本发明的核酸存在下靶基因表达的15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%。当用于受试者（诸如人受试者）中时，抑制可持续4周、5周、6周、7周、8周、10周、11周、12周、13周、14周或最多到3个月。所述核酸或包含核酸组合物的组合物可用于以下使用：每周1次、每两周1次、每三周1次、每四周1次、每五周1次、每六周1次，每七周1次或每八周1次。所述核酸可以用于皮下、静脉内使用或使用任何其它应用途径诸如口服、直肠或腹膜内的使用。

可以在所述核酸向其应用的细胞中测量表达。可替换地，特别如果将所述核酸施用给受试者，可以在细胞或组织的不同组或器官或体液（诸如血液或血浆或淋巴）中测量水平。优选地在已经选择的条件下测量抑制水平，因为它们在用体外核酸处理过的细胞中表现出核酸对靶mRNA水平的最大作用。例如可以在用0.038 nM - 10µM之间、优选地1 nm、10nm或100 nm的浓度的本发明的核酸处理的24小时或48小时以后测量抑制水平。对于不同的核酸序列或不同类型的核酸，诸如对于未修饰的或修饰的或缀合至或未缀合至配体的核酸，这些条件可以是不同的。在实施例中描述了用于确定抑制水平的合适条件的例子。

在用本发明的核酸处理或接受本发明的核酸的细胞和/或受试者中，与未处理的细胞和/或受试者相比，靶基因表达可以抑制至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%。抑制水平可以允许治疗与靶基因表达或过表达有关的疾病，或可以允许进一步研究靶基因产物的功能。

靶基因可以是TMPRSS6、ALDH2、LPA、因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erkl/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JU基因、FOS基因、BCL-2基因、海帕西啶、活化的蛋白C、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、在p73基因中的突变、在p21(WAF l/CIPl)基因中的突变、在p27(KIPl)基因中的突变、在PPM ID基因中的突变、在RAS基因中的突变、在窖蛋白I基因中的突变、在MIB I基因中的突变、在MTAI基因中的突变、在M68基因中的突变、在肿瘤抑制基因中的突变和在p53肿瘤抑制基因中的突变。

在一个实施方案中，所述靶基因是TMPRSS6。

在一个实施方案中，所述靶基因是TMPRSS6且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

在另一个实施方案中，所述靶基因是TMPRSS6且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

其中mA、mU、mC和mG各自代表2‘-OMe RNA; fA、fU、fC和fG各自代表2’-脱氧-2’-F RNA；(ps)代表硫代磷酸酯键；和(vp)-mU代表(E)-乙烯基膦酸酯mU。

在另一个实施方案中，所述靶基因不是TMPRSS6。

在一个实施方案中，所述靶基因是TTR。

在一个实施方案中，所述靶基因是TTR且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

在另一个实施方案中，所述靶基因是TTR且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

其中mA、mU、mC和mG各自代表2‘-OMe RNA; fA、fU、fC和fG各自代表2’-脱氧-2’-F RNA；(ps)代表硫代磷酸酯键；和(vp)-mU代表(E)-乙烯基膦酸酯mU。

在一个实施方案中，所述靶基因是ALDH2。

在一个实施方案中，所述靶基因是ALDH2且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

在另一个实施方案中，所述靶基因是ALDH2且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

其中mA、mU、mC和mG各自代表2‘-OMe RNA; fA、fU、fC和fG各自代表2’-脱氧-2’-F RNA；(ps)代表硫代磷酸酯键；和(vp)-mU代表(E)-乙烯基膦酸酯mU。

在另一个实施方案中，所述靶基因是ALDH2且所述第一链包含：

和/或(优选地并且)所述第二链包含

其中mA、mU、mC和mG各自代表2‘-OMe RNA; fA、fU、fC和fG各自代表2’-脱氧-2’-F RNA；(ps)代表硫代磷酸酯键；和(vp)-mU代表(E)-乙烯基膦酸酯mU。

在一个实施方案中，所述靶基因是以下基因以外的基因：LPA和/或补体组分基因(编码免疫系统的补体系统或途径的蛋白的基因)和/或ALDH2和/或TMPRSS6和/或TTR。

本发明的另一个方面涉及本发明的核酸在药物制备中的用途，所述药物用于治疗或预防疾病或病症。

本发明还包括治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向需要治疗的个体施用药物组合物，其包含如本文中所述的核酸或缀合的核酸。所述核酸组合物可以如下施用：每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次。可以将核酸或缀合的核酸皮下地、静脉内地或使用任意其它应用途径（诸如口服的、直肠的或腹膜内的）施用给受试者。

在一个实施方案中，向受试者施用核酸试剂的初始剂量和一个或多个维持剂量。维持剂量可以与初始剂量相同或更低，例如，少于初始剂量的一半。例如每2、5、10或30天施用不多于一次维持剂量。治疗方案可持续一段时间，该时间段将依赖于特定疾病的性质、其严重程度和患者的总体状况而变化。

在一个实施方案中，所述组合物包含多种核酸试剂种类。在另一个实施方案中，核酸试剂种类具有就天然存在的靶序列而言与另一种类非重叠且非相邻的序列。在另一个实施方案中，所述多种核酸试剂种类对不同的天然存在的靶基因是特异性的。在另一个实施方案中，核酸试剂是等位基因特异性的。

本发明的核酸或缀合的核酸也可以与其它治疗性化合物组合施用或用于与其它治疗性化合物组合，分开施用或者同时施用，例如作为组合的单位剂量。

本发明的核酸或缀合的核酸可以使用本领域的常规方法产生，包括化学合成或在体外（例如，失控转录）或在体内表达核酸。例如，使用固相化学合成或使用表达载体。在一个实施方案中，表达载体可以在靶细胞内产生本发明的核酸。用于合成本文所述核酸的方法是本领域技术人员已知的。

本发明的一些方面由以下声明限定：

1. 用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，其包含至少一个双链体区域，该区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从所述要抑制的靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，其中所述第一链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，其特征在于，所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸。

2. 根据声明1的核酸，其中所述第一链包括超过1个磷酸二酯键。

3. 根据声明2的核酸，其中所述第一链包含在至少末端三个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

4. 根据声明3的核酸，其中所述第一链包含在至少末端四个5’核苷酸之间的磷酸二酯键。

5. 根据声明3的核酸，其中所述第一链包含式(Ia)：

(vp)-N(po)[N(po)]

其中‘(vp)-’是5’(E)-乙烯基膦酸酯，‘N’是核苷酸，‘po’是磷酸二酯键，且n是从1至(第一链中核苷酸的总数- 2)，优选地其中n是从1至(第一链中核苷酸的总数-3)，更优选地其中n是从1至(第一链中核苷酸的总数-4)。

6. 根据声明1-5中的任一项的核酸，其中所述第一链包括至少一个硫代磷酸酯(ps)键。

7. 根据声明6的核酸，其中所述第一链进一步包含在末端两个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键或在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

8. 根据声明7的核酸，其中所述第一链中的其它核苷酸之间的键是磷酸二酯键。

9. 根据声明6的核酸，其中所述第一链包括超过1个硫代磷酸酯键。

10. 根据声明1-9的核酸，其中所述第二链包含在末端两个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键或在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

11. 根据声明1-10的核酸，其中所述第二链包含在末端两个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键或在末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

12. 根据上述声明中的任一项的核酸，其中所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是RNA核苷酸。

13. 任何前述声明的核酸，其中所述核酸的第一链具有在15-30个核苷酸的范围内的长度。

14. 根据声明13的核酸，其中所述核酸的第一链具有在19-25个核苷酸的范围内的长度。

15. 任何前述声明的核酸，其中所述核酸的第二链具有在15-30个核苷酸的范围内的长度。

16. 根据声明15的核酸，其中所述核酸的第二链具有在19-25个核苷酸的范围内的长度。

17.任何前述声明的核酸，其在两个末端是平头末端。

18. 根据任何前述声明的核酸，其中在第一链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰的核苷酸。

19. 根据声明18的核酸，其中在第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰的核苷酸。

20. 根据声明18或19的核酸，其中所述修饰是在核糖的2’-OH基团处的修饰，任选地选自2'-OMe或2’-F修饰。

21. 根据声明18-20的核酸，其中所述第一链的一个或多个奇数核苷酸是具有在核糖的2’OH基团处的第一修饰的经修饰的核苷酸，且所述第一链的一个或多个偶数核苷酸是具有在核糖的2’OH基团处的第二修饰的不同地修饰的核苷酸，其中所述第一修饰和第二修饰是不同的。

22. 根据声明21的核酸，其中所述第一修饰是2’-OMe且所述第二修饰是2’-F，或反之亦然。

23. 根据任何前述声明的核酸，其中在所述第一链中不存在2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸。

24. 根据任何前述声明的核酸，其中所述靶基因是TMPRSS6。

25. 根据声明24的核酸，其中所述第一链包含

和/或(优选地并且)所述第二链包含

26. 根据声明25的核酸，其中所述第一链包含

和/或(优选地并且)所述第二链包含

其中mA、mU、mC和mG各自代表2‘-OMe RNA; fA、fU、fC和fG各自代表2’-脱氧-2’-F RNA；(ps)代表硫代磷酸酯键；和(vp)-mU代表(E)-乙烯基膦酸酯mU。

27. 一种用于抑制细胞中靶基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含在声明1-26中的任一项中定义的核酸。

28. 根据声明27的缀合物，其中所述核酸的第二链缀合至所述配体部分。

29. 根据声明27或28中的任一项的缀合物，其中所述配体部分包含一个或多个GalNAc配体及其衍生物，诸如包含在所述核酸的第二链的5’末端处的GalNAc部分。

30. 根据声明27-29中的任一项的缀合物，其中所述配体部分包含接头部分和靶向配体，且其中所述接头部分将所述靶向配体连接至所述核酸部分。

31. 根据声明30的缀合物，其中所述接头部分是丝氨醇-衍生的接头部分，且所述靶向配体排它地缀合至核酸的第一链和第二链中的一个或两个的3’和/或5’末端，其中所述第一链的5’末端没有发生缀合，其中：

(i) 所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体，且其中(a)所述第二链也在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第一链的3’末端没有发生缀合；或(b)所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第二链的3’末端没有发生缀合；或(c)所述第二链和所述第一链也在3’末端处缀合至靶向配体；或

(ii) 所述第二链和所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体且第二链的5’末端没有发生缀合；和

(iii) 其中所述第一链在多个位置处包括经修饰的核苷酸，且其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰。

32. 声明31的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸被修饰。

33. 根据声明32的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置13对应的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰。

34. 根据声明32的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11对应的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰。

35. 根据声明32-34的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11和13对应的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰。

36. 任何声明31-35的缀合物，其中在第二链上与第一链的5’末端的位置11和/或13对应的核苷酸被修饰。

37. 根据声明32-36的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13对应的核苷酸用2'氟修饰进行修饰。

38. 根据声明32-37中的任一项的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸用2'氟修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13对应的核苷酸没有用2’-OMe修饰进行修饰。

39. 根据声明32-38中的任一项的缀合物，其中在第一链的5’末端的位置2和14处的核苷酸用2'氟修饰进行修饰，且在第二链上与第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13对应的核苷酸用2'氟修饰进行修饰。

40. 根据声明31-39中的任一项的缀合物，其中第一链和/或第二链的大于50%的核苷酸包含2’-OMe修饰，诸如第一链和/或第二链的大于55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%或更多的核苷酸包含2’-OMe修饰，优选地测量为第一链和第二链的总核苷酸的百分比。

41. 根据声明31-40中的任一项的缀合物，其在第一链和/或第二链上包含不超过20%(诸如不超过15%或不超过10%)的2'氟修饰，作为两条链的总核苷酸的百分比。

42. 根据声明31-42中的任一项的缀合物，其中在第一链和第二链中的至少一个的3’末端处的末端核苷酸是反转的核苷酸并且通过所述末端核苷酸的3’碳和邻近核苷酸的3’碳附着于邻近核苷酸，和/或在第一链和第二链中的至少一个的5’末端处的末端核苷酸是反转的核苷酸并且通过所述末端核苷酸的5’碳和邻近核苷酸的5’碳附着于邻近核苷酸，或其中所述核酸包含二硫代磷酸酯键。

43. 根据声明31-42的缀合物，其中所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体, 所述第二链也在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第一链的3’末端没有发生缀合。

44. 根据声明31-42的缀合物，其中所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体，所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体并且所述第二链的3’末端没有发生缀合。

45. 根据声明31-42的缀合物，其中所述第二链在5’末端处缀合至靶向配体并且所述第二链和所述第一链也在3’末端处缀合至靶向配体。

46. 根据声明31-42的缀合物，其中所述第二链和所述第一链在3’末端处缀合至靶向配体且第二链的5’末端没有发生缀合。

47. 根据声明31-46中的任一项的缀合物，其中所述配体是单体配体。

48. 根据声明31-47中的任一项的缀合物，其中所述缀合的链通过包括其它接头在内的丝氨醇-衍生的接头部分缀合至靶向配体，其中所述其它接头是或包含饱和的直链或支链C

49. 根据声明48的缀合物，其中所述其它接头包含饱和的、无分支的C

50. 根据声明49的缀合物，其中所述其它接头包含PEG-链。

51. 根据声明48的缀合物，其中所述其它接头包含饱和的、无分支的C

52. 根据声明51的缀合物，其中所述其它接头包含饱和的、无分支的C

53. 根据声明52的缀合物，其中所述其它接头包含饱和的、无分支的C

54. 根据声明31-42的缀合物，其中所述第一链是式(XXV)的化合物：

其中b是0或1；且

所述第二链是式(XXVI)的化合物：

其中c和d独立地是0或1；

其中：

Z

Y是O或S；

R

n是0、1、2或3；且

L在式(XXV)和(XXVI)中是相同的或不同的并且选自：

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

-(CH

其中末端C(O) (如果存在的话)附着于NH基团；

且其中b + c + d是2或3。

55. 根据声明54的缀合物，其中b是0，c是1且d是1。

56. 根据声明54的缀合物，其中b是1，c是0且d是1。

57. 根据声明54的缀合物，其中b是1，c是1且d是0。

58. 根据声明54的缀合物，其中b是1，c是1且d是1。

59. 根据声明54-58中的任一项的缀合物，其中Y是O。

60. 根据声明54-58中的任一项的缀合物，其中Y是S。

61. 根据声明54-60中的任一项的缀合物，其中R

62. 根据声明54-60中的任一项的缀合物，其中R

63. 根据声明54-62中的任一项的缀合物，其中n是0。

64. 根据声明51-63中的任一项的缀合物，其中L是-(CH

65. 根据声明64的缀合物，其中r = 2-6。

66. 根据声明65的缀合物，其中r = 4或6例如4。

67. 一种用于抑制细胞中TMPRSS6基因的表达的缀合物，其包含第一链，其包含

和/或(优选地并且)第二链，其包含

其中mA、mU、mC和mG各自代表2‘-OMe RNA; fA、fU、fC和fG各自代表2’-脱氧-2’-F RNA；(ps)代表硫代磷酸酯键；(vp)-mU代表(E)-乙烯基膦酸酯mU和Ser(GN)代表附着于丝氨醇-衍生的接头部分的GalNAc-C4靶向配体。

68. 一种组合物，其包含声明1-26中的任一项的核酸或声明27-67中的任一项的缀合物和生理上可接受的赋形剂。

69. 用于治疗疾病或病症的声明1-26中的任一项的核酸或声明27-67中的任一项的缀合物或根据声明68的组合物。

附图说明

图1–具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体外TTR靶mRNA水平的降低。

图2 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体外TMPRSS6靶mRNA水平的降低。

图3 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现体外ALDH2靶mRNA水平的降低。

图4 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体外ALDH2靶mRNA水平的降低。

图5 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

图6 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

图7 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

图8 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

图9 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体内TMPRSS6靶mRNA水平的降低。

图10 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物经6周实现改善的体内TMPRSS6靶mRNA水平的降低。

图11 - 具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现体外ALDH2靶mRNA水平的降低。

图12 - 3’和5’GalNAc缀合的寡核苷酸前体的寡核苷酸合成。

图13a, 13b和13c–寡核苷酸与其缀合的在本文中分别被称作GN、GN2和GN3的GalNAc配体的结构。

图14 -显示了在用所示浓度的TMPRSS6-siRNA或树样三聚体GalNAc-Cluster(X0004)或非靶向GalNAc-siRNA (X0028)处理后24h或保持不处理(UT)的原代鼠肝细胞中的TMPRSS6基因表达的抑制，所述TMPRSS6-siRNA携带在反义链的5’-位置处的乙烯基-(E)-膦酸酯2’-OMe-尿嘧啶和在前三个核苷酸(X0204)之间的两个硫代磷酸酯键、在反义链的5’-位置处的乙烯基-(E)-膦酸酯2’-OMe-尿嘧啶和在前三个核苷酸(X0205)、(X0139)或四聚体(X0140)之间的磷酸二酯键)。

图15 -显示了siRNA-缀合物相对于不太稳定的阳性对照关于核酸酶降解的血清稳定性。

图16 -显示了A0268的合成，其为3’单-GalNAc缀合的单链寡核苷酸并且为本发明的一种示例性缀合物的合成中的第二链起始原料。

图17 -显示了A0006的合成，其为5’三触角GalNAc缀合的单链寡核苷酸，并且为本发明的一种示例性缀合物的合成中的第二链起始原料。

实施例

在本文中，我们显示了GalNAc siRNA缀合物的实施例，所述缀合物在第一链的5’末端处用(E)-乙烯基膦酸酯(VP)修饰，此外，在第一链的5’末端处的第一、第二和第三核苷酸之间还包含硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键或磷酸二酯核苷酸间键。在siRNA缀合物（一个丝氨醇-连接的GalNAc部分在第二链的5’末端处和在3’末端处与每个连接）的上下文中，在第一链的5’末端处(I)具有PS、或(II)具有VP但没有PS、或(III)具有VP且具有PS的siRNA缀合物当与酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物一起温育时是同样稳定的。但是，我们证实了在第一链的5’末端处具有VP且没有PS的GalNAc siRNA缀合物用于靶基因敲低的更好剂量响应。

材料和方法

引物：

细胞培养

将原代鼠肝细胞(Thermo Scientific: GIBCO批号: #MC798)融化并冷冻保存，将培养基以Williams E培养基代替，该Williams E培养基补充了5%FBS、1µM地塞米松、2 mMGlutaMax、1%PenStrep、4 mg/ml人重组胰岛素、15 mM Hepes。将细胞密度调节为每1ml250,000个细胞。将100µl/孔的该细胞悬浮液接种到胶原预包被的96孔板中。对于每种浓度，将测试物在相同的培养基中预先稀释（5倍浓缩），然后将25µl的这种预先稀释的siRNA或仅培养基添加给细胞。在37℃和5%CO

TaqMan分析

关于mTTR和ApoB MultiPlex TaqMan分析，将每个处理组的10µl分离的RNA与10µl PCR主混合物(TAKYON low Rox)混合，所述PCR主混合物含有600 nM mTTR-引物、400 nM ApoB-引物和200 nM每种探针以及0.5单位Euroscript II RT聚合酶和0.2单位RNA酶抑制剂。如下在384-孔板中进行TaqMan分析：10 min在48℃的RT步骤，3 min在95℃的最初变性，以及40个95℃保持10 s和60℃保持1 min的循环。

关于TMPRSS6和ApoB MultiPlex TaqMan分析，将每个处理组的10µl分离的RNA与10µl PCR主混合物(TAKYON low Rox)混合，所述PCR主混合物含有800 nM TMPRSS6引物、100 nM ApoB引物和200 nM任一种探针以及0.5单位Euroscript II RT聚合酶和0.2单位RNA酶抑制剂。如下在384-孔板中进行TaqMan分析：10 min在48℃的反转录步骤，3 min在95℃的最初变性，以及40个95℃保持10 s和60℃保持1 min的循环。

去污溶酶体（tritosome）稳定性测定

为了探测体外肝细胞的胞内体/溶酶体隔室中的RNA酶稳定性，将siRNA在SpragueDawley大鼠肝去污溶酶体（tritosomes）(Tebu-Bio, 目录号: R0610.LT, 批号: 1610405,pH: 7.4, 2.827单位/ml)中温育0h、4h、24h或72h。为了模拟酸化的环境，将去污溶酶体（tritosomes）与低pH缓冲液(1.5 M乙酸, 1.5 M醋酸钠pH 4.75)以1:10混合。将30µl该酸化的去污溶酶体（tritosomes）与10µl siRNA (20µM)混合，并在37℃温育指示的时间。温育后，根据生产商的关于生物流体的方案用Clarity OTX Starter Kit-Cartridges(Phenomenex目录号: KSO-8494)分离RNA。将低压冻干的RNA在30µl H

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体外TTR靶mRNA水平的降低。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0181在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0430含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰和在第一链的5’末端处的2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0349含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。与X0181和X0430相比，X0349显示出改善的体外TTR靶基因水平的降低。“ut”指示其它样品向它归一化的未处理的样品。“Luc”指示靶向萤光素酶的siRNA (X0028)，其被用作非靶向对照且不会降低靶mRNA水平。

在小鼠原代肝细胞中进行实验。给每96-孔接种25,000个细胞并在铺板后直接用0.001 - 10 nM GalNAc-缀合的siRNA处理。在24 h后裂解细胞，提取总RNA，并通过TaqmanqRT-PCR确定TTR和ApoB mRNA水平。每个条代表来自三个技术重复的平均值±SD。

数据显示在图1中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体外TMPRSS6靶mRNA水平的降低。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0322在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0431含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰和在第一链的5’末端处的2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0365含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。与X0322和X0431相比，X0365显示出改善的体外TMPRSS6靶基因水平的降低。“ut”指示其它样品向它归一化的未处理的样品。“Luc”指示靶向萤光素酶的siRNA (X0028)，其被用作非靶向对照且不会降低靶mRNA水平。

在小鼠原代肝细胞中进行实验。给每96-孔接种25,000个细胞并在铺板后直接用0.01 - 100 nM GalNAc-缀合的siRNA处理。在24 h后裂解细胞，提取总RNA，并通过TaqmanqRT-PCR确定TMPRSS6和ApoB mRNA水平。每个条代表来自三个技术重复的平均值±SD。

数据显示在图2中。

从实施例1和2显而易见，乙烯基膦酸酯在反义链的5’末端处的存在增加了siRNA的活性。当在第一链的5’末端处的前三个核苷酸之间的键是磷酸二酯键而不是硫代磷酸酯键时，该活性进一步增加。该效应独立于siRNA的核苷酸序列。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现体外ALDH2靶mRNA水平的降低。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0319在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0362含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。两种siRNA缀合物都降低了体外ALDH2靶基因水平。“ut”指示其它样品向它归一化的未处理的样品。“Luc”指示靶向萤光素酶的siRNA (X0028)，其被用作非靶向对照且不会降低靶mRNA水平。

在小鼠原代肝细胞中进行实验。给每96-孔接种25,000个细胞并在铺板后直接用0.1 - 100 nM GalNAc-缀合的siRNA处理。在24 h后裂解细胞，提取总RNA，并通过TaqmanqRT-PCR确定ALDH2和ApoB mRNA水平。每个条代表来自三个技术重复的平均值±SD。

数据显示在图3中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体外ALDH2靶mRNA水平的降低。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0320在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0363含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。与X0320相比，X0363显示出改善的体外ALDH2靶基因水平的降低。“ut”指示其它样品向它归一化的未处理的样品。“Luc”指示靶向萤光素酶的siRNA(X0028)，其被用作非靶向对照且不会降低靶mRNA水平。

在小鼠原代肝细胞中进行实验。给每96-孔接种25,000个细胞并在铺板后直接用0.1 - 100 nM GalNAc-缀合的siRNA处理。在24 h后裂解细胞，提取总RNA，并通过TaqmanqRT-PCR确定ALDH2和ApoB mRNA水平。每个条代表来自三个技术重复的平均值±SD。

数据显示在图4中。

实施例3和4的抗-ALDH2 siRNA具有不同的序列。这些实施例表明，乙烯基膦酸酯和硫代磷酸酯键在第一链的5’末端处的存在提高了siRNA的活性，与siRNA的序列无关。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0181在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0430含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰(“vp-mU”)和在第一链的5’末端处的2个硫代磷酸酯(“PS”)核苷酸间键。X0349含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。所有GalNAc siRNA缀合物都稳定至少72小时。这是惊人的，因为在本领域中通常认为，硫代磷酸酯核苷酸间键需要在siRNA的末端才是稳定的。发明人已经令人惊讶地发现，在有乙烯基膦酸酯存在下，在乙烯基膦酸酯所在的末端处不需要硫代磷酸酯核苷酸间键。因此可以意外地减少硫代磷酸酯核苷酸间键的数目，而不会产生不稳定的分子。这是一个优点，因为这样的分子具有更少的立体中心(硫代磷酸酯是立体性的)。

为了评估稳定性，将5µM siRNA缀合物与酸性的大鼠去污溶酶体（tritosome）提取物(pH 5)一起在37℃温育0、4、24和72小时。温育以后，将RNA纯化，在20%TBE聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过溴化乙锭染色显影。

数据显示在图5中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0322在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0431含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰(“vp-mU”)和在第一链的5’末端处的2个硫代磷酸酯(“PS”)核苷酸间键。X0365含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。所有GalNAc siRNA缀合物都稳定至少72小时。

为了评估稳定性，将5µM siRNA缀合物与酸性的大鼠去污溶酶体（tritosome）提取物(pH 5)一起在37℃温育0、4、24和72小时。温育以后，将RNA纯化，在20%TBE聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过溴化乙锭染色显影。

数据显示在图6中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

两种测试的siRNA缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0319在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0362含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。两种GalNAc siRNA缀合物稳定至少72小时。

为了评估稳定性，将5µM siRNA缀合物与酸性的大鼠去污溶酶体（tritosome）提取物(pH 5)一起在37℃温育0、4和72小时。温育以后，将RNA纯化，在20%TBE聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过溴化乙锭染色显影。

数据显示在图7中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物在酸性去污溶酶体（tritosome）裂解物中是稳定的。

两种测试的siRNA缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在它们的5’和3’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0320在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0363含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。两种GalNAc siRNA缀合物稳定至少72小时。

为了评估稳定性，将5µM siRNA缀合物与酸性的大鼠去污溶酶体（tritosome）提取物(pH 5)一起在37℃温育0、4和72小时。温育以后，将RNA纯化，在20%TBE聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过溴化乙锭染色显影。

数据显示在图8中。

实施例5-8共同地表明，在有义链的5’末端处缺乏硫代磷酸酯核苷酸间键的siRNA的稳定性不随siRNA的序列而变化，因为用具有四种完全不同的序列的siRNA得到了相同的结果。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现改善的体内TMPRSS6靶mRNA水平的降低。

所有测试的缀合物在第二链的5’末端处含有三触角GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在所有非缀合的末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0027和X0207含有在第一链的5’末端处的2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0204含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰和在第一链的5’末端处的2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0205含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。与X0027、X0207和X0204相比，X0205显示出改善的体内TMPRSS6转录物水平的降低。“PBS”指示用PBS处理的动物组。

用0.3 mg/kg和1 mg/kg GalNAc缀合物皮下地处理C57BL/6雄性小鼠(n = 6)。在处理后7天制备肝切片，从组织提取总RNA，并通过TaqMan qRT-PCR确定TMPRSS6和PTENmRNA水平。

数据显示在图9中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物经6周中实现改善的体内TMPRSS6靶mRNA水平的降低。

测试的缀合物在第二链的5’末端处含有三触角GalNAc部分。siRNA用交替的2’-OMe/2’-F修饰且各自在所有非缀合的末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0027在第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0205含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。X0027和X0205含有在第一链的位置1处和在第二链的位置19处的不同核苷碱基，而剩余的核苷碱基序列是相同的。与X0027相比，X0205显示出改善的体内TMPRSS6靶基因水平的最初下降和改善的体内作用持续时间。“PBS”指示用PBS处理的动物组。

用1 mg/kg GalNAc缀合物皮下地处理C57BL/6雄性小鼠(n = 6)。在处理后10、20和41天制备肝切片，从组织提取总RNA，并通过Taqman qRT-PCR确定TMPRSS6和ACTB mRNA水平。

数据显示在图10中。

具有在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯和在第一链的5’末端处的磷酸二酯核苷酸间键的GalNAc siRNA缀合物实现体外ALDH2靶mRNA水平的降低。

所有测试的缀合物各自在第二链的5’末端处和在3’末端处含有一个丝氨醇-连接的GalNAc部分。所述siRNA各自含有在它们的5’和3’末端处的2个硫代磷酸酯核苷酸间键（如果没有不同说明）。X0320和X363用交替2’-OMe/2’-F修饰。X0477和X0478在第一链中用交替2’-OMe/2’-F修饰并在第二链的位置1-6和10-19处用2’-OMe修饰和在第二链的位置7-9处用2’-F修饰。X0320和X0477在它们的第一链的5’末端处含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。X0363和X0478含有在第一个核苷酸处的乙烯基膦酸酯修饰且在第一链的5’末端处不含硫代磷酸酯核苷酸间键。与X0320相比，X0363更多地降低ALDH2 mRNA水平。与X0477相比，X0478更多地降低ALDH2 mRNA水平。“ut”指示其它样品向它归一化的未处理的样品。“Luc”指示靶向萤光素酶的siRNA (X0028)，其被用作非靶向对照且不会降低靶mRNA水平。

在小鼠原代肝细胞中进行实验。给每个96-孔接种20,000个细胞并在铺板后直接用1 - 100 nM GalNAc-缀合的siRNA处理。在24 h后裂解细胞，提取总RNA，并通过TaqmanqRT-PCR确定ALDH2和ACTB mRNA水平。每个条代表来自三个技术重复的平均值±SD。

数据显示在图11中。

实施例11表明，X0478的在反义链的5’末端处的乙烯基膦酸酯与的第二链的2’核苷酸修饰模式的组合导致靶基因的意外较高的下调。

一般合成方案

根据以下描述的方法和本领域技术人员已知的方法，可以合成实施例化合物。尽管所述方案说明了特定缀合物的合成，但应该理解，其它要求保护的缀合物可以通过类似方法制备。寡核苷酸链和接头结构单元的组装可以例如通过应用亚磷酰胺（phosphoramidte）方法的固相合成来进行。固相合成可以从碱基或负载了lcaa CPG的经修饰的结构单元开始。亚磷酰胺合成偶联循环由以下步骤组成：1）去除DMT，2）使用所需的DMT掩蔽的亚磷酰胺和活化剂（其可以是苄基硫代四唑（BTT））进行链延长，3）对未延长的寡核苷酸链进行加帽，然后用碘(如果需要磷酸二酯键)或EDITH (如果需要硫代磷酸酯键)将P(III)氧化成P(V)，并再次加帽(Cap/Ox/Cap或Cap/Thio/Cap)。GalNAc缀合可以通过将GalNAc-甲酸结构单元与先前组装和纯化的寡核苷酸进行肽键形成而实现，所述寡核苷酸具有连接的必需数量的氨基修饰的接头结构单元。必要的结构单元是商购可得的，或如下所述合成。通过AEX-HPLC分析所有最终的单链产物以证明其纯度。纯度以%FLP（全长产物的百分比）给出，它是最终产物的AEX-HPLC分析的UV迹线中指定产物信号下的UV面积的百分比。通过LC-MS分析证明了各个单链产物的身份。

合成子的合成

方案1: DMT-丝氨醇(TFA)接头合成子的合成

i)三氟乙酸乙酯, NEt

根据文献公开的方法(Hoevelmann等人. Chem. Sci., 2016,7, 128-135)，可以从(L)-丝氨酸甲基酯衍生物1合成(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7。

通过在有催化剂诸如DMAP存在下用琥珀酸酐转化中间体5，可以制备(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-琥珀酸酯6。

通过使用偶联剂诸如HBTU将肽键形成到固体支持物诸如氨基修饰的天然CPG支持物（500A）上，可以实现6向固体支持物诸如可控孔度玻璃(CPG)支持物的装载。将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-琥珀酸酯6和偶联剂诸如HBTU溶解于溶剂诸如CH

方案2: GalNAc合成子9的合成

(vii) TMSOTf, DCM, 己烯醇, viii) RuCl

单链的丝氨醇-衍生的GalNAc缀合物的合成

方案3: 用于丝氨醇-衍生的接头的寡核苷酸合成的一般规程

3’单-GalNAc缀合的寡核苷酸(诸如化合物A0264)的寡核苷酸合成描绘在图16中并总结在方案3中。如在实施例化合物A0264中，使用(S)-DMT-丝氨醇(TFA) -琥珀酸酯-lcaa-CPG 10开始合成。在需要额外丝氨醇结构单元的情况下，将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)酰胺化物(7)用在适当的固相合成循环中。例如，为了制备化合物A0329，在完全组装基本序列后，用额外的丝氨醇酰胺化物偶联完成链组装。此外，可以从装载了其有关序列的适当核苷的固体支持物开始5’单-GalNAc缀合的寡核苷酸的寡核苷酸合成。在实施例化合物A0220中，这可能是2’fA。寡核苷酸链根据其序列进行组装，并在适当时使用结构单元(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-酰胺化物(7)。链延长完成后，如在亚磷酰胺合成循环的步骤1）中，除去最后偶联的酰胺化物结构单元的保护性DMT基团。

在最后的合成仪步骤完成后，通过用胺诸如40%甲胺水溶液处理，可以将单链从固体支持物切下。在该步骤中还除去了所有剩余的保护基，甲胺处理也释放了丝氨醇氨基官能团。然后将粗产物分别通过AEX-HPLC和SEC纯化以产生前体寡核苷酸用于进一步GalNAc偶联。

方案4: 丝氨醇-衍生的前体寡核苷酸的GalNAc缀合合成

固相合成后，通过肽偶联剂诸如HBTU对GalN(Ac4)-C4-酸(9)的预活化实现GalNAc-缀合。然后使预活化的酸9与11(例如A0264)中的氨基反应以形成中间体GalN(Ac4)-缀合物。通过甲胺处理将GalNAc-部分中保护羟基的乙酰基基团裂解掉，以产生期望的实施例化合物12 (例如A0268)，将其通过AEX-HPLC和SEC进一步纯化。

单链的非丝氨醇-衍生的GalNAc缀合物的合成

除丝氨醇以外的氨基修饰的结构单元可从各种供应商处商购获得，并且可以代替丝氨醇用于提供允许GalNAc缀合的反应性氨基基团。例如，通过使用载有氨基修饰剂的CPG诸如10-1-10-3，随后如上所述进行序列组装，并最后偶联氨基修饰剂亚磷酰胺（phosohoramidite）诸如13-1、13-2或13-4，下表1中所示的商购可得的结构单元可用于提供非丝氨醇-衍生的氨基修饰的前体寡核苷酸14 (方案5A)。

例如，为了制备14 (A0653)，将GlyC3Am-CPG (10-2)与GlyC3Am-酰胺化物13-2组合使用。在结构上不同的修饰剂可用于制备14，例如对于A0651，C7Am-CPG与作为第二种氨基修饰剂的C6Am-酰胺化物组合使用。以类似的方式，可以使用商购可得的载有氨基修饰剂的CPG 10-5和氨基修饰的亚磷酰胺13-5来合成氨基修饰的前体分子14 (A0655)。

表1：商购可得的结构单元

方案5: 寡核苷酸合成的一般程序

得到的前体寡核苷酸14然后可以与GalN(Ac4)-C4-酸(9)缀合以产生期望的实施例化合物15 (方案6)。

方案6: 前体寡核苷酸的GalNAc缀合合成

单链的三触角GalNAc缀合物的合成

三触角GalNAc-Cluster缀合的siRNA的寡核苷酸合成概述在图17中。使用装载了碱基的支持物例如5’DMT-2’FdA(bz)-琥珀酸酯-lcaa-CPG（如在实施例化合物A0006中）开始寡核苷酸链组装。亚磷酰胺合成偶联循环由以下步骤组成：1）去除DMT，2）使用所需的DMT掩蔽的亚磷酰胺进行链延长，3）对未延长的寡核苷酸链进行加帽，然后用碘或EDITH (如果需要硫代磷酸酯键)将P(III)氧化成P(V)，并再次加帽(Cap/Ox/Cap或Cap/Thio/Cap)，重复上述循环直到达到产物的全长。对于三价三触角GalNAc簇的柱上缀合，使用必要的三价分支酰胺化物C4XLT-phos进行相同的合成循环，然后使用GalNAc酰胺化物ST23-phos进行另一轮合成循环。在该最后的合成仪步骤完成后，将寡核苷酸从固体支持物切割下来，并且可以通过甲胺处理去除额外的保护基。然后将粗产物分别通过AEX-HPLC和SEC纯化。

双链形成的一般程序

为了获得双链缀合物，将单个单链以60 OD/mL的浓度溶解在H

上述过程（包括方案1-6）可以容易地适于用另一种靶向配体例如糖代替GalNac。

在以上方面中的任一个中，代替固相合成后的缀合，可以制备预形成的丝氨醇(GN)-亚磷酰胺并将其用于柱上缀合。

根据下述方法和本领域技术人员已知的方法合成实施例化合物。通过使用亚磷酰胺方法的固相合成，实现寡核苷酸链和接头结构单元的组装。通过GalNAc-甲酸结构单元与先前组装和纯化的寡核苷酸的肽键形成实现GalNAc缀合，所述寡核苷酸具有连接的必需数量的氨基修饰的接头结构单元。

寡核苷酸合成、去保护和纯化遵循本领域已知的标准程序。

使用标准的亚磷酰胺化学，在AKTA oligopilot合成仪上合成所有寡核苷酸。使用商购可得的固体支持物和2´O-甲基RNA亚磷酰胺, 2´氟, 2´脱氧RNA亚磷酰胺(所有标准保护, ChemGenes, LinkTech)和商购可得的3'-氨基修饰剂TFA氨基C-6 lcaa CPG 500Å(ChemGenes)。全乙酰化的半乳糖胺8是商购可得的。

辅助试剂购自EMP Biotech。使用亚磷酰胺在干燥的乙腈中的0.1 M溶液进行合成，并使用苄基硫代四唑(BTT)作为活化剂(0.3M在乙腈中)。偶联时间为15分钟。应用Cap/OX/Cap或Cap/Thio/Cap循环(帽：Ac

在适当的合成循环中通过使用装载了碱基的(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-琥珀酸酯-lcaa-CPG 10或(S)-DMT-丝氨醇(TFA)亚磷酰胺7 (如在文献Hoevelmann

可以如在WO2017/174657中所述完成C4XLT (C4XLT-phos)、C6XLT (C6XLT-phos)以及ST23 (ST23-phos)的亚磷酰胺衍生物的合成。可以如在Prakash, Nucleic AcidsRes. 2015, 43(6), 2993-3011和Haraszti, Nucleic Acids Res. 2017, 45(13),7581-7592中所述完成(vp)-mU-phos的合成。

通过在最后一个合成循环中使用(vp)-mU-phos (如在Prakash, Nucleic AcidsRes. 2015, 43(6), 2993-3011和Nucleic Acids Res. 2017, 45(13),7581-7592中所述进行合成)，实现乙烯基膦酸酯-mU部分的连接。(vp)-mU-phos不提供适合于进一步合成延伸的羟基，因此不具有DMT-基团。因此，(vp)-mU-phos的偶联导致合成终止。为了除去掩蔽膦酸酯的甲酯，将带有完全组装的寡核苷酸的CPG在减压下干燥，并转移进配备玻璃料盘(Carl Roth GmbH)的用于固相肽合成的20mL PP注射器反应器。然后使CPG在室温与10mL的250µL TMSBr和177µL吡啶在CH

通过40%甲胺水溶液处理将单链从CPG上切下。通过离子交换色谱法（Resource Q，6mL，GE Healthcare）使用氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化得到的粗制的寡核苷酸。合并含有产物的级分，在尺寸排阻柱(Zetadex, EMP Biotech)上脱盐并低压冻干。

将各单链以60 OD/mL的浓度溶解在H

化合物2-10的合成

根据文献公开的方法(Hoevelmann等人. Chem. Sci., 2016,7, 128-135)合成了化合物2-5和(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7。

(S)-4-(3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)丙氧基)-4-氧代丁酸(6)

向5的吡啶溶液中加入琥珀酸酐，然后加入DMAP。将所得混合物在室温搅拌过夜。根据TLC判断，所有起始原料被消耗。将反应物浓缩。将粗制物质在硅胶上色谱分离，其中使用0％至5％的甲醇在DCM(+ 1%三乙胺)中的溶液梯度，得到1.33 g的 6 (收率= 38%)。m/z(ESI-): 588.2 (100%)、(计算值C30H29F3NO8

(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-琥珀酸酯-lcaa-CPG (10)

将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-琥珀酸酯(159 mg, 270 umol)和HBTU (113 mg, 299 umol)溶解在CH

GalNAc合成子(9)

如在Nair等人. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961中所述，执行GalNAc合成子9的合成，经2个步骤为46%收率。

特征数据匹配公开的数据。

寡核苷酸的合成

根据上述以及在图12、16和17中描述的反应条件合成所有单链寡核苷酸。

通过AEX-HPLC分析所有最终的单链产物以证明其纯度。纯度以％FLP（全长产物的百分比）给出，它是最终产物的AEX-HPLC分析的UV迹线中指定产物信号下的UV面积的百分比。通过LC-MS分析证明了各个单链产物(未修饰的、氨基修饰的前体，C4XLT/ST23或C6XLT/ST23 GalNAc缀合的寡核苷酸)的身份。

表2: 单链的未缀合的和在柱上缀合的寡核苷酸

具有丝氨醇-衍生的接头的缀合物的合成

通过使用肽偶联剂偶联至各个寡核苷酸链11的丝氨酸-氨基官能团，实现GalNAc合成子(9)的缀合。因此，将各个氨基修饰的前体分子11溶解在H

表3: 单链的GalNAc-缀合的寡核苷酸

双链形成

根据上述方法进行双链形成。双链纯度以双链百分数给出，它是IP-RP-HPLC分析的UV迹线中指定产物信号下的UV面积的百分比。

表4: 核酸缀合物

在第一链的5’位置处用2’-OMe-尿苷或5’-(E)-乙烯基膦酸酯-2’-OMe-尿苷替换2’-OMe-腺嘌呤的GalNAc siRNA缀合物对原代鼠肝细胞中的TMPRSS6表达的减少。

将鼠原代肝细胞以每孔30,000个细胞的细胞密度接种到胶原预包被的96孔板（Thermo Fisher Scientific, #A1142803）中，并用浓度范围为100nM至0.1nM的siRNA-缀合物处理。在处理后24小时，将细胞裂解，并根据制造商的方案用InviTrap®RNA Cell HTS96 Kit / C24 x 96 preps (Stratec #7061300400)提取RNA。通过TaqMan分析，定量TMPRSS6和持家mRNA (PtenII)的转录物水平。

siRNA缀合物:

TaqMan引物和探针

体外剂量响应

在用所示浓度的TMPRSS6-siRNA或非靶向GalNAc-siRNA (STS18001)处理后24h或保持不处理(UT)后，在原代鼠肝细胞中的靶基因表达，所述特定TMPRSS6-siRNA携带在反义链的5’-位置处的乙烯基-(E)-膦酸酯2’-OMe-尿嘧啶和在前三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键(STS12209V4L4)，在反义链的5’-位置处的乙烯基-(E)-膦酸酯2’-OMe-尿嘧啶和在前三个核苷酸之间的磷酸二酯键(STS12209V5L4)，携带在5’-位置处的2’-OMe-尿嘧啶和前三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键(STS12209L4)，或携带在5’-位置的2’-OMe-尿嘧啶或2’-OMe-腺嘌呤以及在前三个核苷酸之间的两个磷酸二酯键(STS12209V1L4和STS12009L4)作为参照。

结果显示在图14中。该图证实了在第一链的5’末端处的乙烯基膦酸酯，优选地与在第一链的5’末端处的磷酸二酯键组合，导致增强的靶基因表达减少。

血清稳定性

在50%FCS中在37℃温育4小时(4h)或3天(3d)或保持不处理(0h)的siRNA缀合物的血清稳定性。然后通过苯酚/氯仿/异戊醇提取法提取RNA。通过TBE-聚丙烯酰胺-凝胶电泳和用SybrGold染色RNA，观察降解。

结果显示在图15中：siRNA-缀合物相对于不太稳定的阳性对照关于核酸酶降解的血清稳定性。

上面列出的序列可以与接头或配体例如GalNAc或(ps)键一起公开。这些形成序列表的序列的任选但优选的部分。

总结缩写表

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