一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法

摘要

本发明提供了一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法。所述的转基因甘蔗SCAG5的外源插入片段侧翼序列，其包含核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的左侧翼序列和/或核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的右侧翼序列。本发明还提供了转基因甘蔗SCAG5的品系特异性检测方法，该方法特异性好，灵敏度高，检出极限为100ng/ul DNA模板浓度的0.1％，相当于9个单倍体甘蔗基因组拷贝数，这一检测灵敏度远高于欧盟对转基因植物衍生的食品及饲料标识的0.9％的最低限量，为转基因甘蔗SCAG5的利用及产品检测身份识别提供了技术基础与依据。

说明书

技术领域

本发明涉及转基因甘蔗领域，具体涉及一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法。

背景技术

自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。2018年全球26个国家种植了1.917亿公顷转基因作物，比2017年增长1％，2019年全球共有43项关于转基因作物的批准，有9个新的转基因作物品种获得批准，包括油菜，棉花、豇豆、大豆和甘蔗。而国内农业农村部也公示了192个拟颁发“农业转基因生物安全证书”的植物品种，其中包括189个棉花、2个玉米和1个大豆品种。由此可见转基因作物种植及应用在未来仍然持续保持稳定增长，转基因作物的安全性问题早已成为国际社会关注的热点，因此对转基因作物进行有效的评估与后续的监管是当前亟需的问题。

每一个转化事件中，携带外源基因的T-DNA在受体植物的插入都是随机的，尽管携带相同的外源基因，T-DNA左右两侧与受体植物基因组的连接区域的碱基序列仍然是不同的，因此T-DNA侧翼序列的克隆以及定位是明确转基因作物的分子特征的基础，对于转因植株的身份识别具有重要意义；另一方面T-DNA在受体基因组中的插入位点对外源基因的表达以及受体内源基因的表达均有可能产生互相影响，因此分析T-DNA的插入位点对于研究转基因植物的稳定遗传及表达有重要的意义。所以T-DNA插入位点信息，侧翼序列和拷贝数等转基因作物的分子特征是转基因生物安全评估和后续监测的基础，这些信息将有助于转基因植物的安全性做出充分评估。

目前获取T-DNA侧翼序列最常用的技术之一是染色体步移法(Genome Walking)，染色体步移法是以PCR技术为基础发展而来，大体上分为依赖酶切连接与不依赖酶切连接的两类。依赖酶切连接的染色体步移法(如反向PCR、载体PCR等)由于酶切位点分布随机造成连接效率偏低，从而引起PCR扩增效率下降，导致成功率降低。另一类不依赖酶切连接的染色体步移法(如快速通用的步移方法、高通量染色体步移等)操作简便，不受酶切位点影响的优点，虽然非特异扩增较多，但经过3-4轮的巢式PCR扩增，仍然可以获得满意的实验结果。利用此类技术已经成功分离了转基因水稻、玉米、棉花、小麦和马铃薯等T-DNA侧翼序列，并建立其相应的转化事件特异性检测技术；转基因作物转化事件特异性检测技术是以其转基因T-DNA侧翼序列的部分序列为靶标进行扩增，扩增产物是T-DNA 5’端或3’端序列与受体基因组的拼接序列，因此具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是世界上最重要的一类糖料作物，其产蔗糖产量占世界食糖量的65％。我国甘蔗糖量占全国总糖量的90％。但在各个甘蔗生产区，甘蔗在整个生长发育期内均会受到120余种虫害威胁。抗虫品种的培育一直都是甘蔗育种工作的一个重要目标，目前抗虫转基因育种是甘蔗抗虫育种最有效的途径之一。本研究组前期通过农杆菌介导把Cry1Ac-2A-gna抗虫融合基因转入甘蔗新台糖22号，经过2个无性繁殖世代的抗虫性和遗传稳定性的评价和深入农艺性状鉴定，已获得抗虫性好农艺性状优良的SCAG5株系，正准备进行环境释放试验。为了明确转基因甘蔗SCAG5的分子特征及便于其检测，推进其的生物安全性评价工作，本实验以其无性繁殖T2代为植物材料，首先利用Southern杂交检测外源T-DNA在SCAG5中的插入拷贝数；然后利用染色体步移技术分离其T-DNA侧翼序列，并根据T-DNA左右端序列和左右侧翼序列设计检测引物，建立转基因甘蔗SCAG5的转化事件特异性检测方法，同时检验该方法的特异性与灵敏度，为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法，所述外源插入片段侧翼序列能够特异性地鉴定或辅助鉴定待测甘蔗是否为转基因甘蔗SCAG5。

本发明的第一个方面是提供一种转基因甘蔗SCAG5的外源插入片段侧翼序列，其包含左侧翼序列和/或右侧翼序列，所述左侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述右侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的外源插入片段侧翼序列在鉴定转基因甘蔗SCAG5中的应用。

优选地，根据本发明的第一个方面所述的外源插入片段侧翼序列设计用于检测所述转基因甘蔗SCAG5的PCR引物。

本发明的第三个方面是提供根据本发明的第一个方面所述的外源插入片段侧翼序列设计的PCR引物对，其含有根据左侧翼序列设计的引物对和/或根据右侧翼序列设计的引物对，其中，根据左侧翼序列设计的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示，根据右侧翼序列设计的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明第四个方面是提供一种PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒包括本发明的第三个方面所述的PCR引物对。

本发明第五个方面是提供如本发明的第三个方面所述的PCR引物对或本发明第四个方面所述的PCR检测试剂盒在鉴定转基因甘蔗SCAG5中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种转基因甘蔗SCAG5的品系特异性检测方法，包括以下步骤：

(1)以待测甘蔗样品的DNA为模板，使用本发明的第三个方面所述的引物对或本发明第四个方面所述的PCR检测试剂盒进行PCR扩增；

(2)当本发明的第三个方面所述的引物对或本发明的第四个方面所述试剂盒含有根据左侧翼序列设计的引物对且获得750bp的PCR扩增产物，和/或

本发明的第三个方面所述的引物对或本发明的第四个方面所述的PCR检测试剂盒含有根据右侧翼序列设计的引物对且获得380bp的PCR扩增产物时，说明待测样品为转基因甘蔗SCAG5。

本研究利用southern杂交确定了转基因甘蔗SCAG5的外源基因的插入拷贝为单拷贝，利用染色体步移方法，扩增得到转基因甘蔗SCAG5外源基因插入位点的左右侧翼序列，以此序列为基础，建立了转基因甘蔗SCAG5的品系特异性检测方法，该方法特异性好，灵敏度高，检出极限为100ng/ul DNA模板浓度的0.1％，相当于9个单倍体甘蔗基因组拷贝数，这一检测灵敏度远高于欧盟对转基因植物衍生的食品及饲料标识的0.9％的最低限量，为转基因甘蔗SCAG5的利用及产品检测身份识别提供了技术基础与依据。

附图说明

图1为pNUBG植物表达载体酶切位点及探针位置。

图2为pNUBG表达载体的T-DNA结构和特异性引物的位置。

图3为转基因甘蔗SCAG5 Southern Blot分析结果，其中，A：BG探针杂交；B：bar探针杂交；C：sta探针杂交；D：kan探针杂交。M：Marker；P：Kpn I酶切质粒；N：HindⅢ酶切非转基因甘蔗基因组；1：BamH I酶切；2：EcoRⅤ酶切；3：Nde I酶切；4：HindⅢ酶切。

图4为转基因甘蔗SCAG5左右侧翼序列的巢式PCR扩增结果，其中，A：左侧翼序列扩增；B：右侧翼序列扩增。M：DNA Marker；1：1st产物；2：2nd产物3：3rd产物；4：4th产物。

图5为SCAG5左侧翼序列及拼接位置特征，其中，A：SCAG5左侧翼序列；下划直线(大写字母)：T-DNA载体序列(511～840bp)，其余：甘蔗基因组序列。B：T-DNA拼接位置特征；pUNBG：包括T-DNA左边界在内的载体序列；箭头：T-DNA转入甘蔗基因组时的断裂位置，箭头左边为载体非T-DNA区；椭圆框：T-DNA左边界核心序列；下划波浪线：T-DNA转入甘蔗基因组时缺失序列；小写字母：SCAG5甘蔗基因组序列；方框：SCAG5与pUNBG的重叠载体序列。

图6为SCAG5右侧翼序列及拼接位置特征，其中，A：SCAG5右旁侧序列；下划直线(大写字母)：T-DNA载体序列(1～318bp)，其余(小写字母)：甘蔗基因组序列。B：T-DNA拼接位置特征；pUNBG：包括T-DNA右边界在内的载体序列；箭头：T-DNA转入甘蔗基因组时的断裂位置，箭头右边为载体非T-DNA区；椭圆框：T-DNA右边界核心序列；下划波浪线：T-DNA转入甘蔗基因组时缺失序列；SCAG5：右侧翼序列，小写字母为甘蔗基因组序列；方框：SCAG5与pUNBG的重叠载体序列。

图7为甘蔗SCAG5转化事件特异性PCR检测结果，其中，A：左、右侧翼特异性引物筛选，M：DNA Marker；1-3：右侧引物RS139/RA467、RS139/RA526、RS006/RA467扩增的PCR产物；4-5：左侧引物LS132/LA797、LS132/LA791、LS040/LA791扩增的PCR产物。B：转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗bar基因PCR检测；C：转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗左侧翼事件特异性PCR检测(引物LS040/LA791)；D：转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗右侧翼事件特异性PCR检测(引物RS139/RA526)，其中M：DNA Marker；1：表达载体质粒pUNBG；2：非转基因甘蔗ROC22；3-10：分别为转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗SCAG1、SCAG2、SCAG4、SCAG5、SCAG32、SCAG35、SCAG36和SCAG41。

图8为左、右侧翼特异性引物对PCR检测限度的测定结果，其中，A：左边界特异性引物LS040/LA791对检测限度的测定，B：右侧翼特异性引物RS139/RA526对检测限度的测定；M：DNA Marker；1～8：转基因甘蔗SCAG5的DNA含量分别为100％、50％、10％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0％(非转基因甘蔗ROC22)。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1材料与方法

1.1试验材料与试剂

植物材料为转Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因和bar抗除草剂基因的甘蔗SCAG5株系以及SCAG1、SCAG2、SCAG4、SCAG32、SCAG35、SCAG36和SCAG41，是针对甘蔗生产中鳞翅目、同翅目两大类主要害虫，利用具有自我剪切功能的连接多肽FMDV 2A序列将cry1Ac和gna两个不同抗虫机制的基因融合，得到cry1Ac-2A-gna抗虫融合基因，在玉米Ubi强表达启动子驱动下构建成植物表达载体pNUBG，再以bar基因为选择标记基因，通过农杆菌介导把cry1Ac-2A-gna基因转入甘蔗新台糖22号(ROC22)，而获得的甘蔗新品种，能抗螟虫绵蚜以及蛴螬等多种害虫。SCAG2、SCAG5株系已申请在海南省儋州进行中间试验，并已完成，现在海南省文昌市迈号镇乌鸡塘村农业部转基因植物及植物用微生物环境安全监督检验测试中心(海口)试验基地保存，准备下一步环境释放试验。

植物表达载体以pCambia3300为骨架。Dig nucleic acid detection kit、PCRDIG Probe Synthesis Kit购于德国罗氏公司；HyboodTM-N+尼龙膜购自美国GE Amersham；Genome Walking Kit、试剂LA Taq酶、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、T4 DNA Ligase等购于TaKaRa公司；质粒提取、胶回收试剂盒及纯化试剂盒购于Axygen公司；2×Taq plusMasterMix、DNA Marker购于Biosharp公司；氨苄青霉素，琼脂糖购于Sigma公司。PCR引物合成及基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1甘蔗SCAG5基因组DNA的提取

选择转基因甘蔗SCAG5的无性繁殖T2代甘蔗的幼嫩叶片，采用改良CTAB法大量提取并纯化基因组总DNA，同时提取非转基因甘蔗ROC22基因组总DNA作为对照。取2μl于Thermo Scientific Nano Drop One生物核酸定量检测仪测定DNA的浓度和纯度，另取2μl于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

1.2.2 Southern杂交检测

以转化质粒pNUBG为模板，利用高效PCR地高辛标记法分别制备BG(包括Cry1Ac-2a-gna中Cry1Ac基因下游355bp，2a和gna全长)、bar、sta、kan四种不同的探针，扩增引物、退货温度、产物长度等详见表1。通过分析T-DNA区的酶切位点，结合各探针在T-DNA上的位置(见图1)，分别选择两种限制性内切酶对30μg基因组DNA进行酶切(不同探针使用的内切酶详见表4)，低电压电泳后，转膜至HyboodTM-N+尼龙膜，再利用相应的探针，进行Southern杂交检测，杂交温度40℃，预杂交时间2小时，杂交时间16小时，室温黑暗条件下用BCIP/NBT进行化学显色，待杂交信号带清晰后终止显色，拍照并分析。具体操作参考试剂盒说明书和本研究团队成员崔学强发表的文章(崔学强,张树珍,沈林波,等.转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化[J].生物技术通报,2015,31(12):105-109.)。

表1 PCR DIG探针制备所用引物和探针长度

1.2.3转基因甘蔗SCAG5的T-DNA左右侧翼序列的获取

按照染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit，TaKaRa公司)中的要求，在植物表达载体pNUBG的T-DNA左右端序列分别设计4条退火温度约为65℃的嵌套特异性引物(Lsp1～Lsp4和Rsp1～Rsp4)，位置见图2，序列见表2。由于不同植物物种基因组的差异，为了增加试剂盒使用的广谱性，试剂盒提供了四种随机简并引物，按照操作说明，每种随机简并引物AP1～AP4分别与嵌套特异性引物组合配对，进行三～四轮巢式PCR扩增分离该株系的T-DNA左右侧翼序列。第一轮反应体系中，SCAG5基因组DNA模板为200ng，特异性引物为Lsp1或Rsp1，简并引物为AP1～AP4其中之一。第二PCR反应的扩增模板为稀释50倍的第一轮PCR产物，特异性引物为Lsp2或Rsp2，简并引物为第一轮所用的AP引物，第三、四轮同第二轮，特异引物换成Lsp3/Rsp3或Lsp4/Rsp4，每一轮反应的退火温度详见表2，扩增程序参照试剂盒说明书。最后扩增产物于用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，特异扩增片段利用DNA胶回收试剂盒回收。连接T载体，转化大肠杆菌DH5α，送阳性菌株至上海生工测序。

表2巢式PCR反应所需要的特异性引物

1.2.4转基因甘蔗SCAG5事件特异性PCR检测及其灵敏度

SCAG5事件特异性PCR检测的建立：根据T-DNA左、右侧翼序列的测序结果以及T-DNA左右端载体序列分别设计三对特异性检测引物：LS132/LA797、LS132/LA791、LS040/LA79和RS139/RA467、RS139/RA526、RS006/RA467，对转基因甘蔗SCAG5进行扩增，分别筛选一组左、右特异性检测扩增效率最好的，并回收纯化特异性片段及测序，比对是否与预期序列完全一致，最终建立事件特异性检测方法。特异性检测引物的一条引物位于甘蔗基因组序列，另一条引物则位于T-DNA左、右端载体序列，引物序列详见表3。分别利用上述筛选的两对引物和bar基因引物，以包括SCAG5在内的转Cry1Ac-2a-gna基因的不同甘蔗株系和非转基因甘蔗DNA为模板，表达载体pUNBG质粒为对照，进行转化事件特异性PCR检测。DNA模板量为200ng，反应循环数35，退火温度见表3。PCR产物取5μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率和扩增特异性。

表3 SCAG5事件特异性PCR检测引物

检测转化事件特异性PCR的灵敏度：转基因甘蔗SCAG5与受体甘蔗ROC22#(新台糖22号)的基因组DNA分别稀释至100ng/μL，根据不同的比例配制SCAG5的DNA相对含量为100％、50％、10％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0％(V/V)的100ng/μL的DNA模板样品。混合样品取各1μL作为PCR模板，分别利用上述已筛选出来的扩增效率最高的左、右特异性引物对，进行PCR扩增。取5μL PCR产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检查各浓度SCAG5DNA模板下的扩增效果，测试各对引物的转化事件特异性PCR的特异性和灵敏度。

2结果与分析

2.1抗虫转基因甘蔗SCAG5外源T-DNA插入拷贝数检测

转基因甘蔗SCAG5基因组DNA分别用BamHI、Nde I、EcoRV限制性内切酶进行酶切、电泳和转膜后，利用地高辛标记的外源基因BG和bar片段的探针分别进行Southern杂交检测，结果表明，不同的限制性内切酶后的甘蔗基因组DNA经BG和bar探针杂交后，均只显示一条杂交带，并且杂交带的大小与预测理论大小一致，而对照非转基因植株中无杂交信号，说明外源基因已整合到甘蔗SCAG5基因组中并以单拷贝的方式整合(图3)；用载体骨架序列制备的sta和kan探针进行Southern杂交，结果表明转基因甘蔗基因组中没有来源于转化载体的其他元件以及骨架序列。

表4 SCAG5 Southern Blot杂交带大小的理论值

2.2T-DNA左、右侧翼序列的获得及分析

为了获得SCAG5株系T-DNA的左、右侧翼序列，在T-DNA左右边界分别设计四条巢式特异性。左侧四条巢式特异性引物分别与试剂盒中AP1～AP4四条简并引物组合，经过三～四轮热不对称巢式PCR反应后，电泳结果显示，任何引物组合经三轮巢式PCR的扩增均未获得特异性片段，只有AP4简并引物与四条巢式引物组合，经过四轮巢式PCR的扩增，能得到特异性的片段如图4-A。回收产物送上海生工测序，获得840bp的序列，如图5-A，其中510bp属于甘蔗基因组序列，此部分GC百分含量为25.49％；剩余330bp与T-DNA左边载体序列重合，并发现缺失了LB border最左边的17bp序列，见图5-B。

右侧四条巢式特异性同上操作，则在简并引物AP1与特异性引物Rsp1/Rsp2/Rsp4组合，经三轮巢式PCR扩增得到特异性片段，如图4-B。测序获得1233bp的序列，如图6-A。其中915bp为甘蔗基因组序列，GC百分含量为39.89％，余下318bp与T-DNA右边界载体序列虫害，并发现缺失了RB border最右侧的20个碱基，见图6-B。由此可见，T-DNA序列插入SCAG5基因组时，左右两侧的都有不同程度的缺失。

2.3建立转基因甘蔗SCAG5事件特异性检测方法

利用左、右端三对特异性检测引物LS132/LA797、LS132/LA791、LS040/LA791和RS139/RA467、RS139/RA526、RS006/RA467，对转基因甘蔗SCAG5进行扩增，扩增效率最好的左、右特异性检测引物对分别是LS040/LA791和RS139/RA526，见图7-A。以转相同基因的转基因甘蔗株系和非转基因甘蔗为模板，分别利用LS040/LA791和RS139/RA526特异引物和bar基因引物进行事件特异性检测。结果显示，使用特异性检测引物的扩增产物中，只在转基因甘蔗SCAG5可以扩增到大小约为750bp(左侧翼)和约380bp(右侧翼)的特异性条带，其他转基因株系和非转基因材料扩增均为阴性(图7-C、D)；而使用bar基因引物的扩增产物中，表达载体质粒和转基因各株系都能扩增到约423bp的特异性片段，只有非转基因甘蔗扩增结果为阴性(图7-B)。SCAG5扩增到的约750bp和380bp的特异性片段回收后，测序，经比对证实与预期序列完全一致。证明LS040/LA791和RS139/RA526这两对引物可以特异的识别转基因甘蔗事件SCAG5。

2.4事件特异性PCR检测的灵敏度

利用LS040/LA791和RS139/RA526两对引物检测在不同SCAG5 DNA含量混合样品中的转化事件特异性PCR扩增效率，测试此两对引物的最低扩增限度。结果发现，以左侧引物LS040/LA791扩增时，当SCAG5的DNA相对含量降低至0.1％时，仍然可以特异地扩增到目的片段(图8-A)；以右侧引物RS139/RA526扩增时，当SCAG5的DNA相对含量降低至1％、0.5％、0.1％时，除了目的片段，还出现了非特异片段的扩增，当降低至0.05％和0％时，只有非特异片段的扩增(图8-B)。以上结果表明以右侧RS139/RA526为引物的事件特异性PCR的特异性和灵敏度较差，而以左侧LS040/LA791为引物的事件特异性PCR检测的特异性好和灵敏度高，最低检出值达100ng/ul DNA模板浓度的0.1％，按甘蔗基因组为10Gb计算，相当于9个单倍体基因组拷贝数，也就是说该转化事件特异性PCR最低检测限约为9个单倍体甘蔗基因组拷贝数。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种转基因甘蔗事件SCAG5的外源插入片段侧翼序列及其品系特异性检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 840

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

cctctctccg tcggaatgtg aagctgcata ccctgggcta gtggcaatcc cacggaccca 60

caactgtctt tttttgggaa aaaaatattt cagcgttttt ttaaaagtta taaagttata 120

cctacaacct ttatgtatta ttttttgtag ataaattatc aacatatttt cttagaaagt 180

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<210> 2

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

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tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt 300

gtcgtttccc gccttgagct tgagcttgga tcatgaggac attcaaaatg gacaacccat 360

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ggacacaaga gaaaataatt atattaaata attaatgact gctcaatgac caacaacctt 900

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