粗毛硬革菌与纤维素酶固态发酵制备稀有人参皂苷的方法

摘要

本发明公开了粗毛硬革菌与纤维素酶固态发酵制备稀有人参皂苷的方法，属于人参皂苷的生物制备技术领域。本发明以粗毛硬革菌为发酵菌种，将种子液接种至以农业废弃物为发酵基质且含有人参提取物与纤维素酶的培养基中，固态发酵培养10天，发酵结束后得到富含人参皂苷Rd、F2、CK和PPT等稀有皂苷的产物，同时发酵产物中还包含多种粗毛硬革菌多糖、甾醇、酯类、倍半萜等生物活性物质。本发明方法工艺简单、发酵成本低、转化效率高，为含多种稀有人参皂苷的生物活性物质的循环生物经济生产提供了参考，并为开发利用毛韧革菌发酵制备多种高价值健康产品的新技术提供了方法。

说明书

技术领域

本发明涉及粗毛硬革菌与纤维素酶固态发酵制备稀有人参皂苷的方法，尤其是一种利用粗毛硬革菌与纤维素酶混合固态发酵人参提取物制备稀有人参皂苷的技术，属于人参皂苷的生物制备技术领域。

背景技术

人参是中国传统的名贵中药，也可用于食疗。人参的主要活性成分为人参皂苷，特别是稀有人参皂苷因其较低的分子量、较好的细胞膜通透性以及更容易被胃肠道吸收，具有更高的药理活性。已从西洋参、人参加工制品及其他西洋参的不同部位鉴定出150多种人参皂苷及其衍生物。所有人参皂苷的基本结构相同，即由一个达玛烷甾体核和17个碳原子组成的4个环。人参皂苷的结构多样性是由于不同的类型糖基的位置及其糖基的数量。人参皂苷基于糖苷配基结构的类型分为三种，即齐墩果烷型(Ro)，原人参二醇型(Rb

最近的体内和体外研究表明，稀有人参皂苷(如Rd、F

双向固态发酵是食药用菌以含有药效成分的底物进行固态发酵，伴随着发酵进行，底物中的药效成分发生变化，菌体生长产生丰富的次生代谢产物，经发酵后的培养基质含有多而复杂的药效成分。此方法为开发富含复杂药效成分的保健食药品提供了思路。在过去的几年里，与液态发酵相比，固态发酵通过利用不同的农工业废弃物作为碳源和微生物转化的诱导剂，成为一种经济、绿色的选择，且为生产稀有人参皂苷提供了参考。

粗毛硬革菌Stereum hirsutum(担子菌纲，红菇目)通常生活在硬木和针叶树的死枝和树干上。另一方面，粗毛硬革菌在营养生理上，可能被其他种类的真菌如银耳(Tremella aurantia)寄生，发展成相互不对称的共生关系，这种菌丝组成的异质复合物被称为金耳，一种在中国极具市场潜力的食药用菌。除子实体外，蘑菇菌丝还可作为功能食品和营养材料。粗毛硬革菌子实体在中国和韩国被用作治疗癌症的民间药物。据报道，粗毛硬革菌的发酵菌丝中含有多种具有生物活性的次生代谢产物，包括对结核分枝杆菌有抗结核活性的附睾甾醇，具有植物毒性活性的乙炔化合物与具有抗菌和抗氧化活性的三环倍半萜等。这些研究结果表明，粗毛硬革菌菌丝体在营养食品和功能食品的配方中是有用的。到目前为止，没有使用粗毛硬革菌生物转化人参皂苷的报道。

CN107746871A公开了利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备稀有人参皂苷的方法，其发酵产物仅局限于人参二醇型皂苷。CN105925655A公开了利用松杉灵芝液体发酵制备稀有人参皂苷的方法，液体发酵的工艺比较繁杂。CN111363774A公开了利用发酵乳杆菌发酵人参的方法制备人参皂苷的方法，其发酵产物为人参皂苷Rg

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供使用粗毛硬革菌生物转化制备人参皂苷的方法。

[技术方案]

本发明提供的生物转化制备人参皂苷的方法，是利用粗毛硬革菌与纤维素酶混合固态发酵人参提取物来制备稀有人参皂苷，可以获得富含多种稀有人参皂苷与粗毛硬革菌发酵活性物质的产物。

所述人参提取物是从五加科植物人参的根、茎叶中提取精制而成，富含人参皂甙。

所述固态发酵是以大米、玉米粉、麸皮、黄豆皮、玉米皮、麦芽、燕麦、黄豆粉中的一种或多种为发酵基质，并添加人参提取物，利用粗毛硬革菌为发酵菌种。

所述方法是以粗毛硬革菌为发酵菌种，按5％-30％(mL/100g)的接种量接种到固态发酵培养基中，固态发酵培养基的发酵基质为大米、玉米粉、麸皮、黄豆皮、玉米皮、麦芽、燕麦、黄豆粉，人参提取物的投料量为0.05-0.5g/g

在本发明的一种实施方式中，发酵温度是25℃。

在本发明的一种实施方式中，固态发酵培养基的初始含水量为60％。

在本发明的一种实施方式中，在添加人参提取物的同时还添加2.5％(w/w)的纤维素酶所述纤维素酶可以来源于黑曲霉、绿色木霉。

在本发明的一种实施方式中，所述稀有人参皂苷包括人参皂苷Rd、F

在本发明的一种实施方式中，人参提取物的投料量为0.1g/g-0.35g/g。

在本发明的一种实施方式中，发酵菌种的接种量为15％-25％，例如20％。

在本发明的一种实施方式中，添加2.5％(w/w)来源于黑曲霉的纤维素酶，酶活为50U/g。

[有益效果]

利用本发明方法发酵人参提取物，不仅得到了人参二醇型皂苷(F

本发明采用固态发酵省时省力，经济绿色环保。

本发明利用粗毛硬革菌与纤维素酶混合固态发酵人参提取物制备稀有人参皂苷的方法，发酵结束后得到富含人参皂苷Rd、F2、CK和PPT等稀有皂苷的产物，同时发酵产物中还包含多种粗毛硬革菌多糖、甾醇、酯类、倍半萜等生物活性物质。

本发明的发酵方法采用农工业废弃物对粗毛硬革菌进行固态发酵，为含多种生物活性物质的循环生物经济生产提供了参考，并为开发利用粗毛硬革菌发酵制备多种高价值健康产品的新技术提供了手段。

附图说明

图1：固态发酵基质对人参皂苷含量和β-葡萄糖甘酶酶活的影响

图2：接种量对人参皂苷含量和β-葡萄糖甘酶酶活的影响

图3：人参提取物投料量对人参皂苷含量和β-葡萄糖甘酶酶活的影响

图4：发酵周期对人参皂苷含量和β-葡萄糖甘酶酶活的影响

图5：实施例1粗毛硬革菌固态发酵的HPLC图

图6：实施例3粗毛硬革菌添加绿色木霉的固态发酵的HPLC图

图7：实施例2粗毛硬革菌添加黑曲霉的固态发酵的HPLC图

具体实施方式

人参提取物的来源：西安天行健天然生物制品有限公司

β-葡萄糖甘酶的酶活定义及酶活测定方法：

吸取待测菌株的粗酶液1mL，于8000g，4℃离心10min，吸取上清液100μL，加入200μL的5mmol·L

酶活定义：1min释放出1μmol的对硝基酚所耗的酶量为一个酶活单位。

酶活计算公式：

(1)式中：

U—酶活大小(U·mL

C—对硝基苯酚浓度(mmol·L

V—反应体系的体积(mL)；

t—反应时间(min)；

v—取上清液的体积(mL)；

N—稀释倍数。

HPLC检测人参皂苷的方法：色谱仪器为安捷伦1260，色谱设备与条件是GP-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为30℃；进样量为10μL；流速为1mL·min

以玉米皮为发酵基质的培养基：20g玉米皮，4g人参提取物，加水调整初始含水量为60％。

粗毛硬革菌的种子培养基及培养方法：以PDA培养基为种子培养基，接种量10％，在25℃，180rpm培养7天。

实施例1：

粗毛硬革菌按20％(100g接20mL)的接种量接种到固态发酵培养基中，固态发酵培养基的配方为：20g玉米皮为发酵基质、人参提取物的投料量为0.2g/g

发酵结束后，发酵产物以1g：5mL的比例用醋酸缓冲液(pH＝6.0，50mM)在4℃浸提12小时，提取液经离心(10000rpm,20min)过滤菌丝和杂质，收集上清液作为粗酶液，用于测β-葡萄糖甘酶的酶活。在测定人参皂苷含量时，用等体积正丁醇提取发酵产物3次，每次浸提12小时，将正丁醇提取物在真空旋转蒸发器上60℃蒸发至干燥，在干燥产品中加入10mL的甲醇(HPLC级)，然后用0.22μm超滤膜过滤，收集所得液体进行HPLC分析。

实施例2：

粗毛硬革菌按20％(100g接20mL)的接种量接种到固态发酵培养基中，将来源于黑曲霉的纤维素酶(酶活为50U/g)按照固态发酵培养基2.5％(w/w)的比例添加到固态发酵培养基中，固态发酵培养基的配方为：20g玉米皮为发酵基质、人参提取物的投料量为0.2g/g

发酵结束后，发酵产物以1g：5mL的比例用醋酸缓冲液(pH＝6.0，50mM)在4℃浸提12小时，提取液经离心(10000rpm,20min)过滤菌丝和杂质，收集上清液作为粗酶液，用于测β-葡萄糖甘酶的酶活。在测定人参皂苷含量时，用等体积正丁醇提取发酵产物3次，每次浸提12小时，将正丁醇提取物在真空旋转蒸发器上60℃蒸发至干燥，在干燥产品中加入10mL的甲醇(HPLC级)，然后用0.22μm超滤膜过滤，收集所得液体进行HPLC分析。

实施例3：

粗毛硬革菌按20％的接种量接种到固态发酵培养基中，将来源于绿色木霉的纤维素酶(15000U/g)按照固态发酵培养基2.5％(w/w)的比例添加到固态发酵培养基中，固态发酵培养基的配方为：20g玉米皮为发酵基质、人参提取物的投料量为0.2g/g

发酵结束后，发酵产品以1:5的比例用醋酸缓冲液(pH＝6.0，50mM)在4℃浸提12小时，提取液经离心(10000rpm,20min)过滤菌丝和杂质，收集上清液作为粗酶液，用于测β-葡萄糖甘酶的酶活。在测定人参皂苷含量时，用等体积正丁醇提取发酵产物3次，每次浸提12小时，将正丁醇提取物在真空旋转蒸发器上60℃蒸发至干燥，在干燥产品中加入10mL的甲醇(HPLC级)，然后用0.22μm超滤膜过滤，收集所得液体进行HPLC分析。

表1未经发酵的人参提取物以及各实施例发酵产物中人参皂苷含量的变化

注：×表示没有检测到。

实施例4

以实施例1为基础，将玉米皮替换为大米。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例5

以实施例1为基础，将玉米皮替换为玉米粉。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例6

以实施例1为基础，将玉米皮替换为黄豆皮。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例7

以实施例1为基础，将玉米皮替换为麸皮。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例8

以实施例1为基础，将玉米皮替换为小麦。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例9

以实施例1为基础，将玉米皮替换为黄豆粉。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例10

以实施例1为基础，将玉米皮替换为燕麦。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例11

以实施例1为基础，将玉米皮替换为麦芽。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例11

以实施例1为基础，将玉米皮替换为麦芽。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图1所示。

实施例12

以实施例1为基础，将接种量调整为5％。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图2所示。

实施例13

以实施例1为基础，将接种量调整为10％。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图2所示。

实施例14

以实施例1为基础，将接种量调整为15％。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图2所示。

实施例15

以实施例1为基础，将接种量调整为30％。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图2所示。

实施例16

以实施例1为基础，将人参提取物投料量调整为0.05g/g。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图3所示。

实施例17

以实施例1为基础，将人参提取物投料量调整为0.1g/g。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图3所示。

实施例18

以实施例1为基础，将人参提取物投料量调整为0.35g/g。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图3所示。

实施例19

以实施例1为基础，将人参提取物投料量调整为0.5g/g。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图3所示。

实施例20

以实施例1为基础，将发酵周期调整为3d。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图4所示。

实施例21

以实施例1为基础，将发酵周期调整为5d。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图4所示。

实施例22

以实施例1为基础，将发酵周期调整为8d。发酵结束后，测得β-葡萄糖甘酶的酶活、人参皂苷含量如图4所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。