一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法

摘要

本发明公开了一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，具体涉及生物医学领域，包括有效检测人食管鳞癌组织内具核梭杆菌，所述具核梭杆菌特异性基因nusG的引物序列特征为：根据具核梭杆菌的nusG基因mRNA序列Gene ID：45633894，基因组序列为NZ_LN831027.1。本发明通过qPCR检测肿瘤组织内的具核梭杆菌的DNA表达含量，利用预设的cutoff值判定阳性或阴性；其次通过全外显子测序技术检测肿瘤组织的肿瘤突变负荷，利用预设的cutoff值判定高TMB或者低TMB；当F.nucleatum结果为阳性并且高TMB，食管癌更易发生转移；结合两个检测结果建立的预测模型可能成为预测食管鳞癌转移的有力方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法。

背景技术

食管癌是世界上最主要的上消化道恶性肿瘤。食管癌早期发现较为困难，一经确诊往往为中晚期，并且存在侵袭性强和致死率高等特点，是一种进展迅速并且预后较差的疾病。目前手术仍是食管癌患者获得长期生存的主要手段，但即便是根治性切除，病理检查无淋巴结转移(pNO)的患者术后5年内仍有40％～50％出现转移复发，因此食管癌转移复发是影响患者长期生存的重要原因。现亟待探索更有效的预警食管癌转移复发的手段，从而最终提高食管癌患者总体生存的关键问题。

具核梭菌作为一种厌氧的革兰氏阴性菌，主要分布于人、动物肠道和口腔粘膜。具核梭菌在口腔中含量最丰富，近年来研究发现该菌与人类疾病的联系越来越多。许多研究表明，具核梭菌与肿瘤的发生相关密切，尤其与结肠癌的发生之间存在相关性。此外，有报告研究它与食管癌的不良预后呈正相关。临床研究提示，较高的具核梭菌含量与食管鳞癌的新辅助化疗的不良反应之间存在正相关。所有的这些研究结果表明：具核梭菌有可能成为提示恶性肿瘤发生和发展的新标志物。

肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)被定义为所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。肿瘤的突变可能导致产生新的变异蛋白，或者说新抗原，而这些新抗原会被机体免疫系统作为外来物识别并引发细胞毒效应，杀伤肿瘤。肿瘤突变数目越多，就越有可能产生新抗原，从而对免疫治疗有更好的应答。TMB的高低，不仅可以预测免疫治疗的疗效，而且可以精准预测不少靶向药和化疗药的疗效。2019年的大型临床研究中指出1662名接受过PD-1抗体等免疫治疗的癌症患者中，高TMB人群的总生存期明显高于TMB低的人群。在晚期肺癌患者，Hellmann MD发现在EGFR突变的患者，TMB较高的患者，接受靶向治疗，疗效维持时间较短、中位总生存时间较短。在843名接受化疗的肠癌患者中发现TMB高的病人与TMB低的患者相比，总生存时间明显延长。在TMB高的人群中，贝伐联合化疗，相比于爱必妥联合化疗，疗效明显提高，疾病进展的风险下降87％，生存期明显更长。TMB作为生物标志物在预测恶性肿瘤的治疗疗效方面已获得临床数据支撑，在另一方面也充分反映TMB与肿瘤的发展之间紧密相关。

目前有许多研究报道预测食管鳞癌转移的生物标志物，大多通过单独的蛋白标志物或者血浆中micoRNA进行预测，但由于食管鳞癌转移是受到多个因素所影响，多个指标联合预测可以有效的提高预测效率。因此，多指标联合用于预测食管鳞癌转移的方法已广泛被研究和开发。

现有技术和方法中未见报道基于瘤内具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)含量和肿瘤突变负荷(TMB)联合预测食管鳞癌(ESCC)转移的方法应用。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，本发明所要解决的技术问题是：如何将瘤内具核梭杆菌和肿瘤突变负荷进行联合来预测食管鳞癌转移。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，包括有效检测人食管鳞癌组织内具核梭杆菌，所述具核梭杆菌特异性基因nusG的引物序列特征为：根据具核梭杆菌的nusG基因mRNA序列Gene ID：45633894，基因组序列为NZ_LN831027.1；

nusG正义链引物：5’-TGGTGTCATTCTTCCAAAAATATCA-3’；

nusG反义链引物：5’-AGATCAAGAAGGACAAGTTGCTGAA-3’；

具体预测步骤如下：

S1：根据该有效的nusG基因序列，通过qPCR技术检测并设定通过熔解曲线评价qPCR结果的可靠性，并取Ct值(达到设定阈值所经历的循环数)，从而检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达；所述的针对人食管鳞癌组织中具核梭杆菌的nusG基因序列，能够有效的检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达，利用qPCR检测食管鳞癌组织中具核梭杆菌的含量；

S2：利用全外显子测序技术检测食管鳞癌组织的肿瘤突变负荷(TMB)，利用全外显子测序的方法检测肿瘤突变负荷(TMB)，使用Qiagen DNA提取试剂盒从石蜡组织块中提取肿瘤和正常基因组DNA，提取DNA后，对样本分别使用NanoDrop微量核酸蛋白浓度测定仪、qubit荧光定量仪和Agilent BioAnalyzer细胞分析仪进行定量和定性测定；DNA终文库最后在MGISEQ-2000高通量平台上测序；在测序过程中，通过滚环复制(RCR)将ssDNA环与DNA纳米球(DNB)一起生成，以放大荧光信号；将DNB加载到图案化纳米阵列中，并在MGISEQ-2000平台上读取100bp的对端读取，用于后续的数据分析研究；

S3：联合步骤S1和步骤S2的结果构建预测模型，根据Ct值和TMB值有效地进行食管鳞癌转移情况的预测，基于上述的检测构建预测模型，利用肿瘤中的具核梭杆菌含量和肿瘤突变负荷，两者与食管鳞癌的转移有显著相关性(P＜0.05)。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S1中的检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达方式中：任何Ct值低于或等于37个循环的样本都被认定为阳性；当标本的Ct值大于37时，认为阴性。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S2中设定当TMB值大于或等于120时为高TMB(TMB-H)，TMB值小于120时为低TMB(TMB-L)。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S3中创建的预测食管鳞癌转移模型包括食管鳞癌组织中具核梭杆菌的Ct值和食管鳞癌组织的TMB值。

本发明的技术效果和优点：

本发明通过提供一种能有效预测食管鳞癌转移的方法模型，通过在临床组织标本中检测发现，该方法可以有效的预测食管鳞癌患者的转移，此方法为开发预测食管鳞癌转移的新型生物标志物提供新思路。

附图说明

图1为本发明食管鳞状细胞癌中具核梭杆菌的表达示意图。

图2为本发明的利用全外显子测序技术检测人食管鳞状细胞癌中基因突变和肿瘤突变负荷示意图。

图3为本发明的利用瘤内具核梭杆菌含量联合肿瘤突变负荷预测食管鳞癌转移示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本发明提供了一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，其中包括有效检测人食管鳞癌组织内具核梭杆菌，所述具核梭杆菌特异性基因nusG的引物序列特征为：根据具核梭杆菌的nusG基因mRNA序列Gene ID：45633894，基因组序列为NZ_LN831027.1；

nusG正义链引物：5’-TGGTGTCATTCTTCCAAAAATATCA-3’；

nusG反义链引物：5’-AGATCAAGAAGGACAAGTTGCTGAA-3’；

具体预测步骤如下：

S1：根据该有效的nusG基因序列，通过qPCR技术检测并设定通过熔解曲线评价qPCR结果的可靠性，并取Ct值(达到设定阈值所经历的循环数)，任何Ct值低于或等于37个(Ct≤37)循环的样本都被认定为阳性；当标本的Ct值大于37(Ct＞37)时，认为阴性，从而检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达；所述的针对人食管鳞癌组织中具核梭杆菌的nusG基因序列，能够有效的检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达，利用qPCR检测食管鳞癌组织中具核梭杆菌的含量，为评价具核梭杆菌在肿瘤组织中的相对丰度，采用qPCR方法对21对食管鳞癌患者的具核梭杆菌特异性nusG基因进行定量分析，通过结果表明，21例肿瘤组织标本中具核梭杆菌阳性率为66.7％(14/21)，肿瘤组织中具核梭杆菌的相对丰度明显高于配对正常组织(P＝0.0262)(参照图1)；

S2：利用全外显子测序技术检测食管鳞癌组织的肿瘤突变负荷(TMB)，利用全外显子测序的方法检测肿瘤突变负荷(TMB)，设定当TMB值大于或等于120时为高TMB(TMB-H)，TMB值小于120时为低TMB(TMB-L)，使用QiagenDNA提取试剂盒从石蜡组织块中提取肿瘤和正常基因组DNA，提取DNA后，对样本分别使用NanoDrop微量核酸蛋白浓度测定仪、qubit荧光定量仪和Agilent BioAnalyzer细胞分析仪进行定量和定性测定；DNA终文库最后在MGISEQ-2000高通量平台上测序；在测序过程中，通过滚环复制(RCR)将ssDNA环与DNA纳米球(DNB)一起生成，以放大荧光信号；将DNB加载到图案化纳米阵列中，并在MGISEQ-2000平台上读取100bp的对端读取，用于后续的数据分析研究，对于这一步，应用了先进的组合探针-锚定合成(CPAS)技术和DNA纳米球(DNB)测序技术；肿瘤突变负荷(TMB)被定义为基于全外显子或Target Panel测序下，肿瘤基因组去除胚系突变后的每兆碱基体细胞内编码、碱基替换和插入突变的突变数量；在过滤之前，计算目标基因的编码区中所有碱基替换和Indels，包括同义改变；计算同义突变以减少采集噪声；虽然同义突变不可能直接参与产生免疫原性，但它们是产生基因突变的提示信号，其突变结果也将导致基因组中其它地方产生非同义突变和新抗原；本检测基因偏向于肿瘤中具有功能突变的基因，包括目前COSMIC数据库内已知的体细胞改变，但肿瘤抑制基因的截短体形式和非编码变异未计算在内；由体细胞-胚系组成的杂合形式其预测为胚系变异形式的突变类型没有被计算在内；在已知的临床样本队列中被反复预测为胚系变异的未被计算在内；dbSNP中已知的胚系改变不计算在内；ExAC数据库中发生两个或两个以上计数的胚系变异未计算在内。

对20对食管鳞癌样本进行全外显子测序(WES)；13例肿瘤组织中含有具核梭杆菌阳性，7例为阴性；在提供测序样本的20例患者中，11例在术后6个月内发生远处转移；其余9例随访2年无转移；11例患者中，具核梭杆菌阳性率为72.8％(8/11)；11例有转移者的平均±SE突变负荷高于无转移者(141.5±16.94 vs 124±16.31，P＝0.467)(图2)；每个原发肿瘤的突变负荷被确定(中位数，133.6；范围从33到256)；高突变负荷组定义为大于等于120的患者，低突变负荷组定义为小于120的患者；

S3：联合步骤S1和步骤S2的结果构建预测模型，利用肿瘤中的具核梭杆菌含量和肿瘤突变负荷，两者与食管鳞癌的转移有显著相关性(P＜0.05)；在具核梭杆菌阳性食管鳞癌中，高突变负荷组与低突变负荷组相比，有更多的淋巴转移和远端转移患者，根据Ct值和TMB值有效地进行食管鳞癌转移情况的预测，基于上述的检测构建预测模型，得到如下数据(见下表)；

而具体到本实施例中用qPCR的方法检测人食管鳞癌石蜡标本中的具核梭杆菌的含量：

DNA提取及16S核糖体RNA测序

使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒对每个组织蜡块样本进行提取总DNA，最后用约50μL双蒸水洗脱，并在-20℃保存直至使用；使用Qubit对提取的DNA进行定量，并在细菌16SrRNA基因V3-V4区域用特异引物(336F：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA；806R：GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增出30ng的DNA；用16SrRNA高通量下一代Illumina MiSeq平台对扩增的样品进行测序；

qPCR分析

组织中F.nucleatum DNA含量使用实时荧光定量PCR分析；反应体系10ul，包含40ng提取的全基因组DNA，1×Power SYBR Green PCR Master Mix，上下游引物分别为0.4uM，置于96孔qPCR反应管中，每个反应进行3次重复；F.nucleatum nusG基因引物和人SLCO2A1基因引物分别为：nusG上游引物，5’-TGG TGTCATTCTTCCAAAAATATCA-3’；nusG下游引物，5’-AGATCAAGAAGGACAAGTTGC TGAA-3’；SLCO2A1上游引物，5’-ATCCCCAAAGCACCTGGTTT-3’；SLCO2A1下游引物，5’-AGAGGCCAAGATAGTCCTGGTAA-3’；利用StepOnePlus实时聚合酶链反应系统在以下反应条件下进行DNA扩增和检测：95℃，10min；95℃，15s，45个循环；60℃，1min。每个组织中F.nucleatum DNA的含量均是相对于SLCO2A1，并通过使用2-ΔCt方法进行计算(ΔCt＝‘the mean Ct value of F.nucleatum’-‘themean Ct value of SLCO2A1’)；通过溶解曲线评价qPCR结果的可靠性；Ct小于或等于37的样本被认为是F.nucleatum阳性；当标本Ct值大于37时，或无法扩增出溶解曲线的则认为标本为F.nucleatum阴性。

实施例2：

一种利用全外显子测序技术检测人食管鳞癌石蜡组织样本的基因突变：

1.核酸提取

使用Qiagen DNA FFPE试剂盒提取FFPE样本的全基因组DNA，提取完成的DNA质控标准如下：使用Qubit荧光定量仪，测定gDNA浓度，要求DNA总量≥400ng；使用琼脂糖凝胶电泳评估片段大小，要求片段分布≥500bp；

2.DNA样本检测

DNA样本检测主要有三种方法：

1)琼脂糖凝胶电泳：检测是否降解，是否有杂质；

2)nanodrop检测：质量量化；要求：浓度＞＝20ng/ul，总量＞800ng

3)Qubit检测：双链DNA量化；要求：浓度＞＝10ng/ul，总量＞400ng

3.文库构建、靶向捕获和测序

在文库构建之前，每个样本取400ng全基因组DNA，使用Covaris S2超声波破碎仪，将其片段化成200-300bp，然后进行文库构建；首先，DNA片段使用末端修复酶和加A尾酶按照以下条件进行孵育：20℃，30min；65℃，30min，目的是得到末端修复的、5’磷酸化以及3’加A尾的双链DNA片段；接下来进行接头连接，该接头包含定制合成的标签序列(10bp)，且接头3’端含dNTP，用于跟含A尾的双链DNA进行互补连接；通过10个循环的PCR(聚合酶链式反应)完成接头的链接；接头链接完成之后，按照输入总量为1.5微克，将3-6个接头连接文库混合到一起，按比例混合完成的DNA样本文库集，使用捕获体系进行4h杂交孵育；用于该杂交捕获反应的探针/Panel全外显子相关基因，其终浓度为3pmol；杂交捕获之后，使用40μL洗脱缓冲液洗脱与探针结合的DNA片段，接下来通过PCR富集捕获到的目标片段，然后使用Qubit对PCR产物进行定量，并将包含不同标签的样本按照总量为220ng进行等摩尔混合，然后将其制备成单链环状DNA，即最终的环化文库；

所有的终文库都将使用MGISEQ-2000高通量测序平台进行测序；单链环状DNA通过滚环扩增技术生成DNB(DNA纳米球)，从而在测序的过程中放大荧光信号；DNB加载到规则的纳米阵列中，并且在MGISEQ-2000高平台上进行双端100bp测序，用于后续数据分析；在测序的过程中使用联合探针锚定聚合测序技术和DNBSEQ技术；

4.数据分析

下机数据首先使用NCfilter进行低质量reads过滤，使用BWA mem比对到hs375d5参考基因组上，并使用GATK(version3.4-46-gbc02625)将PCR产生的重复reads进行标记、对indel区域的reads进行局部重新比对，并对碱基质量值进行校正；对snv and indel的检出，通过GSR(有正反向支持的模板片段)和对照样本来寻找低频支持的reads，同时使用对照样本(正常组织)进行胚系突变的过滤；使用同批次质控合格的对照样本作为基线来进行CNV检出；使用Clip，unmap，DiscordantPair的reads进行重组装来进行sv突变的检出；

注释之后，将变异在1000Genomes Project，GAD，dbSNP，和ExAC等数据库中进行对比；过滤掉在1000G、1000G EAS、ExAC、ExAC EAS人群频率库中等位基因频率大于1％的变异；过滤掉内部数据库中存在的常见变异以及低质量的变异；其余的变异将进行人工核查，并对变异进行分级；过滤掉同义突变以及距离编码区超过2bp的内含子区的突变。

实施例3：

通过全外显子测序技术分析人食管鳞癌石蜡组织样本的数据对TMB进行计算：

肿瘤突变负荷(TMB)被定义为基于全外显子或Target Panel测序下，肿瘤基因组去除胚系突变后的每兆碱基体细胞内编码、碱基替换和插入突变的突变数量；在过滤之前，计算目标基因的编码区中所有碱基替换和Indels，包括同义改变；计算同义突变以减少采集噪声；虽然同义突变不可能直接参与产生免疫原性，但它们是产生基因突变的提示信号，其突变结果也将导致基因组中其它地方产生非同义突变和新抗原；由于检测基因偏向于肿瘤中具有功能突变的基因，包括目前COSMIC数据库内已知的体细胞改变，但肿瘤抑制基因的截短体形式和非编码变异未计算在内；由体细胞-胚系组成的杂合形式其预测为胚系变异形式的突变类型没有被计算在内；在已知的临床样本队列中被反复预测为胚系变异的未被计算在内；dbSNP中已知的胚系改变不计算在内；ExAC数据库中发生两个或两个以上计数的胚系变异未计算在内。

在上述三个实施例检测人食管鳞癌石蜡标本，得到测量数据如下结论：

食管鳞癌患者肿瘤组织中具核梭杆菌的相对丰度明显高于配对正常组织(P＝0.0262)(图1)；肿瘤组织内基因突变频率和特征；每个样本的肿瘤突变负荷(图上部)，显著突变基因(SMG)按突变类型及其突变频率着色(图下部)；列：检测样本；行：基因；N：具核梭杆菌阴性组；P：具核梭杆菌阳性组(图2)；结合瘤内具核梭杆菌含量和肿瘤突变负荷预测食管鳞癌转移；水平线表示肿瘤突变负荷的分界值；每个患者的临床和病理特征，包括有无远处转移或淋巴结转移；具核梭杆菌阳性：qPCR Ct值

最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。