一种南方白甲鱼DNA条形码标准检测基因及其应用

摘要

本发明公开了一种南方白甲鱼DNA条形码标准检测基因及其应用,该DNA条形码标准检测基因为COT基因，其核苷酸系列如SEQ ID NO.1。本发明的南方白甲鱼DNA条形码物种鉴定方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了南方白甲鱼。与传统的形态学鉴定方法相比，该方法获得的标准基因系列有利于实现南方白甲鱼的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。

说明书

技术领域

本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种南方白甲鱼DNA条形码标准检测基因及其应用。

背景技术

南方白甲鱼(Onychostomagerlachi)，别称:南方突吻鱼；俗称:香榄鱼，红尾榄，平头榄，滩头鲮，齐口鲮，石鲮。体修长，侧扁，头短而宽，吻圆锥形，口下位，横裂。下颌骨具角质边缘，上颌末端达鼻孔后缘的下方，唇薄，下唇与下颌愈合，唇后沟仅限于口角，无须。背鳍具硬刺，其后缘具强锯齿。体银白色，背部深灰；背鳍及胸鳍为灰色，腹鳍与臀鳍呈橙红色。多栖息于清水石底河段，为江河的中下层鱼类，以着生藻类为主食，也食少量枝角类、轮虫及高等植物碎片。1冬龄性腺开始成熟，2周龄全部成熟，4-5月间，亲鱼集群在河溪石滩水流通畅处产卵。分布于长江中、上游干支流和珠江、元江水系，是长江上游及珠江流域的主要经济鱼类之一。生长速度较快，1-3龄较显著，3冬龄鱼平均为37.1厘米，平均体重达1.14公斤，3冬龄以后增长较缓慢。常见个体为0.25-2公斤，最大个体达6.5公斤。它在产区的捕获物中所占比重较大，肉细嫩，味鲜美，很有可能发展成山谷水库的饲养对象。产量也高，尤其在广西北部高寒山区生长较快，当年鱼体长可达10-15厘米，重14-62克；1冬龄鱼体长15-20厘米，重60-118克；2冬龄鱼体长18-25厘米，重96-291克；3冬龄鱼体长25-29厘米，重275-425克。肉质含脂率高，味鲜美肥嫩，为地区性主要经济鱼类。

DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase I,COI)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对南方白甲鱼进行快速、有效的鉴定。

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。自从2003年，加拿大科学家Hebert提出以COI基因做为DNA条形码以来，越来越多的研究表明DNA条形码在物种分类上具有高效可行性。大量的研究结果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。

该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决形态学鉴定中因标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且鉴定时间也极大缩短。目前己有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有南方白甲鱼的相关基因序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴定南方白甲鱼的DNA条形码标准检测基因。

本发明的另一目的在于提供上述用于鉴定南方白甲鱼的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种南方白甲鱼DNA条形码物种鉴定方法，该方法有利于实现南方白甲鱼的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于鉴定南方白甲鱼的DNA条形码标准检测基因，该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.l，该核苷酸序列的全长为652bp。南方白甲鱼标准序列SEQ ID NO.l为：

TTATCTCGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGAACTGCCCTAAGCCTCCTAATTCGGGCTGAACTGAGCCAACCCGGGTCGCTTCTGGGCGATGACCAAATTTATAACGTTATCGTAACTGCCCACGCCTTCGTCATAATTTTCTTTATAGTAATGCCCATCCTTATTGGGGGGTTCGGAAATTGACTTGTACCTCTAATAATCGGAGCCCCCGACATGGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGATTACTACCCCCATCATTTCTGCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCAGGGGCCGGGACAGGATGAACCGTTTATCCACCCCTTGCAGGAAACCTGGCCCACGCAGGGGCATCAGTAGACCTGACAATTTTCTCACTTCATTTAGCAGGTGTCTCATCAATCCTAGGGGCAATCAACTTCATCACTACGATTGTTAACATAAAACCCCCAGCCATCTCCCAATATCAAACACCCCTATTCGTCTGATCCGTGCTTGTAACTGCTGTCCTCCTTCTCCTGTCACTACCTGTTTTAGCTGCCGGAATCACAATACTATTAACAGACCGAAACCTCAATACCACATTCTTTGACCCGGCAGGGGGAGGAGACCCAATCCTCTACCAACACCTGTTC

上述的用于鉴定南方白甲鱼的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。

一种南方白甲鱼DNA条形码物种鉴定方法，包括以下步骤：

1)从待测组织中分离提取总DNA；

2)以步骤1)分离提取的DNA为模板用两对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)将步骤2)的扩增产物进行电泳分析，如果能特异性扩增出目的条带，则进行测序；

4)如果目的条带的测序结果与SEQ ID NO.l的基因序列同源性在98％以上时，即可判定该待测组织为南方白甲鱼。

步骤2)中所述的两对引物的序列为：

FishF2_tl:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQ IDN0.2)

VF2_tl:5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)

FishR2_t-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQ ID N0.4)

FR1d_t1:5-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQ ID N0.5)

所述的目的条带为长度为700±15bp的条带。

本发明公开了南方白甲鱼的DNA条形码分子鉴定方法和COI序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出南方白甲鱼COI基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至测序公司进行测序。与所述DNA条形码标准基因序列SEQ ID NO.l的同源性在98％以上，即可判定所述的待测组织即为南方白甲鱼。该方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了南方白甲鱼。

上述南方白甲鱼DNA条形码物种鉴定方法的详细步骤为：1)从待测组织中分离提取总DNA；2)以该DNA为模板用两对通用引物，通过聚合酶链式反应扩增出目的基因；3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的目的基因用琼脂糖电泳进行分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出700±15bp的条带，则送生物公司测序；4)根据测序结果，如果与如SEQ ID NO.l所示的基因序列的同源性在98％以上，即可判定该待测组织为南方白甲鱼。

优选的，上述南方白甲鱼DNA条形码物种鉴定方法中的PCR反应体系(25μl)为：10×PCR Buffer 2.5μl、dNTP Mixture(2.5mM each)2.0μl、TaKaRa Taq(5U/μl)0.3μl、FishF2_tl引物(lOμM)O.5μl、FishR2_tl引物(lOμM)O.5μl、VF2_tl引物(lOμM)O.5μl、FRld_tl(lOμM)O.5μl、DNA模板(约10ng/μl)1μl、ddH20 17.2μl。

PCR反应程序为：95℃*2min,94℃*30s,55℃*30s,72℃*lmin,35个循环，72℃*lOmin。

本发明的有益效果：

本发明的方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了南方白甲鱼。与传统的形态学鉴定方法相比，该方法获得的标准基因序列有利于实现南方白甲鱼的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。

附图说明

图1为南方白甲鱼DNA条形码分子鉴定技术路线图

图2为扩增产物电泳图谱

具体实施方式

实施例1南方白甲鱼标准序列的获得

1.南方白甲鱼形态学鉴定及样本采集保存

根据南方白甲鱼具有体修长，侧扁，头短而宽，吻圆锥形，口下位，横裂。下颌骨具角质边缘，上颌末端达鼻孔后缘的下方，唇薄，下唇与下颌愈合，唇后沟仅限于口角，无须。背鳍具硬刺，其后缘具强锯齿。体银白色，背部深灰；背鳍及胸鳍为灰色，腹鳍与臀鳍呈橙红色等形态学特征以及相关鱼类分类专家的共同鉴定，选出南方白甲鱼样本。剪取肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

2.DNA提取

酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于-20℃保存备用。

3.PCR引物合成

本方法选取2对引物的序列如下：

FishF2_tl:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQ IDN0.2)

VF2_tl:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)

FishR2_tl:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQ IDN0.4)

FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQ IDN0.5)

4.PCR反应体系(25μl)

试剂 使用量

10×PCR Buffer 2.5μl

dNTP Mixture(2.5mM each) 2.0μl

TaKaRa Taq(5U/μl) 0.3μl

FishF2_t1引物(10μM) 0.5μl

FishR2_t1引物(10μM) 0.5μl

VF2_t1引物(10μM) 0.5μl

FR1d_t1引物(10μM) 0.5μl

DNA模板(约10ng/μl) 1μl

ddH

5.PCR反应程序

95℃*2min，

72℃*10min。

反应结束后，打开PCR仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存

6.标准序列的获得

取2μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V,200mA,25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，选取效果较好的PCR产物送至生物公司纯化后测序，测序结果经过去除两端的冗余序列即为南方白甲鱼的标准序列(SEQ ID NO.1)。

实施例2

1.待测样本的采集保存与处理

从浸泡标本中剪取部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

2.DNA提取

酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于-20℃保存备用。

3.PCR引物合成

本方法选取2对引物的序列如下：

FishF2_tl:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQ IDN0.2)

VF2_tl:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)

FishR2_tl:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQ IDN0.4)

FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQ IDN0.5)

4.PCR反应体系(25μl)

试剂 使用量

10×PCR Buffer 2.5μl

dNTP Mixture(2.5mM each) 2.0μl

TaKaRa Taq(5U/μl) 0.3μl

FishF2_t1引物(10μM) 0.5μl

FishR2_t1引物(10μM) 0.5μl

VF2_t1引物(10μM) 0.5μl

FR1d_t1引物(10μM) 0.5μl

DNA模板(约10ng/μl) 1μl

ddH

5.PCR反应程序

95℃*2min，

72℃*10min。

反应结束后，打开PCR仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存

6.PCR产物检测

取2μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V,200mA,25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如下，检出大小约为700±15bp的目的条带，可初步判定待测样本可能是南方白甲鱼。

7.基因序列测定

选取效果较好的PCR产物送至生物公司纯化后测序，测序结果显示与如SEQ IDNO.l所示的基因序列的同源性为99％，因而可判定该待测样本即为南方白甲鱼，结合南方白甲鱼体型、体表、头型和鳍等形态学特征进行复核鉴定提供该样本组织的物种确为南方白甲鱼。

送样序列(SEQ ID NO.6):

CATACAAGCGGAACTGCCAAGGGAAAAATGTGAGGGGGGGAATCGGGAGAGACGAGGGGGGTAAATGCTGGCGAACTGAGCCAACCCGGGTCGCTTCTGGGCGATGACCAAATTTATAACGTTATCGTAACTGCCCACGCCTTCGTCATAATTTTCTTTATAGTAATGCCCATCCTTATTGGGGGGTTCGGAAATTGACTTGTACCTCTAATAATCGGAGCCCCCGACATGGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGATTACTACCCCCATCATTTCTGCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCAGGGGCCGGGACAGGATGAACCGTTTATCCACCCCTTGCAGGAAACCTGGCCCACGCAGGGGCATCAGTAGACCTGACAATTTTCTCACTTCATTTAGCAGGTGTCTCATCAATCCTAGGGGCAATCAACTTCATCACTACGATTGTTAACATAAAACCCCCAGCCATCTCCCAATATCAAACACCCCTATTCGTCTGATCCGTGCTTGTAACTGCTGTCCTCCTTCTCCTGTCACTACCTGTTTTAGCTGCCGGAATCACAATACTATTAACAGACCGAAACCTCAATACCACATTCTTTGACCCGGCAGGGGGAGGAGACCCAATCCTCTACCAACACCTGTTCTGATTCTTCGGTCACCCTGAAGTGTCTCTGTTTTTCCTCATTGAAAAAATCCCTTTGTCCTTTGGGGAAGGGTACTCTGCCCCTTCAATATTAAAAA

<110> 镇江华大检测有限公司

<120> 一种南方白甲鱼DNA条形码标准检测基因及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 652

<212> DNA

<213> 南方白甲鱼(Sinilabeo rendahli)

<400> 1

ttatctcgta tttggtgcct gagccggaat agtgggaact gccctaagcc tcctaattcg 60

ggctgaactg agccaacccg ggtcgcttct gggcgatgac caaatttata acgttatcgt 120

aactgcccac gccttcgtca taattttctt tatagtaatg cccatcctta ttggggggtt 180

cggaaattga cttgtacctc taataatcgg agcccccgac atggcattcc cacgaataaa 240

taacataagc ttctgattac tacccccatc atttctgcta ctcctagctt cttctggtgt 300

tgaagcaggg gccgggacag gatgaaccgt ttatccaccc cttgcaggaa acctggccca 360

cgcaggggca tcagtagacc tgacaatttt ctcacttcat ttagcaggtg tctcatcaat 420

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<212> DNA

<213> artificial

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